李祥勝，孟雅萍，許雷鳴

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥230051）

那屈肝素鈣注射液臨床主要用于外科手術(shù)中靜脈血栓形成中高度或高度危險(xiǎn)的情況［1］，預(yù)防靜脈血栓栓塞性疾病，治療已形成的深靜脈血栓，以及聯(lián)合阿司匹林用于不穩(wěn)定型心絞痛和非Q波性心肌梗死急性期的治療。其藥品說明書所載用法還包括血液透析中預(yù)防體外循環(huán)中的血凝塊形成。那屈肝素鈣是由腸黏膜獲取的氨基葡聚糖（肝素）片段的鈣鹽。肝素雙糖單位中有多個位置被硫酸基團(tuán)取代，硫酸基取代的位置及數(shù)量與肝素的抗凝活性密切相關(guān)。當(dāng)肝素解聚為那屈肝素鈣時，糖鏈上的硫酸基團(tuán)會脫落，若生產(chǎn)工藝控制不當(dāng)，硫酸基團(tuán)會過度解離，從而影響那屈肝素鈣的活性，且那屈肝素鈣注射液的硫酸基團(tuán)在貯藏過程中也有可能脫落，故應(yīng)嚴(yán)格控制那屈肝素鈣制劑中的游離硫酸鹽。目前（截至筆者投稿時）在國內(nèi)上市的那屈肝素鈣注射液生產(chǎn)企業(yè)有4家，其中國產(chǎn)3家、原研1家（葛蘭素史克），僅原研、國產(chǎn)各1家生產(chǎn)企業(yè)以離子色譜法對制劑中游離硫酸鹽加以控制，但這2家生產(chǎn)企業(yè)的離子色譜法均存在氫氧化鈉淋洗液濃度偏高導(dǎo)致抑制器電流過大、出峰過早，以及因基線噪音過大影響積分準(zhǔn)確性等瑕疵。本研究中參考文獻(xiàn)［2－15］，通過優(yōu)化色譜條件等對檢測方法進(jìn)行優(yōu)化?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

ICS－5000型離子色譜儀（美國Dionex公司）。硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號為18094，質(zhì)量濃度為1 000 μg／mL），草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號為19012，濃度為0.1 mol／L），均購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；無水碳酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C10477836，含量為99.0%）；那屈肝素鈣注射液［南京健友生化制藥股份有限公司，批號分別為A40206E，A41105E，A40805E；河北常山生化藥業(yè)有限公司，批號分別為F423180403，F(xiàn)42319012，F(xiàn)423190101；天津生物化學(xué)制藥有限公司，批號分別為73190201，74190202，74190203；葛蘭素史克＜天津＞有限公司，批號分別為5300（A），5264，5300（B）］；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：IonPacTMAS11－HC柱（250 mm×4 mm）；保護(hù)柱：IonPacTMAG11－HC柱（50 mm×4 mm）；柱溫：30℃；電導(dǎo)檢測器，電導(dǎo)池溫度：35℃；抑制器電流：50 mA；淋洗液：3 mmol／L碳酸鈉溶液（等度洗脫）；流速：2.0 mL／min；進(jìn)樣量：25 μL。

2.2 溶液制備

精密量取硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg／mL）適量，用淋洗液稀釋，制成每1 mL分別含硫酸根1，2，5，10，20 μg的系列硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol／L）適量，用淋洗液稀釋，制成每1 mL含草酸根50 μg的溶液，取1 mL與硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg／mL）3 mL，置同一10 mL容量瓶中，加淋洗液定容，搖勻，即得對照品溶液。取樣品0.5 mL，用淋洗液稀釋至50 mL，搖勻，離心，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以3 mmol／L碳酸鈉溶液（淋洗液）作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下3種溶液各25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果分離度為3.5，空白溶液對硫酸根測定無干擾，詳見圖1。

圖1 離子色譜圖1.sulfate ion 2.oxalate ionA.Reference solution B.Blank solution C.Test solutionFig.1 Ion chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下系列硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液各25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。記錄色譜圖，以硫酸根質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝0.075 04X－0.014 98，r＝0.999 95（n＝5）。結(jié)果表明，硫酸根進(jìn)樣質(zhì)量濃度在1.0～20.0 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：取2.2項(xiàng)下硫酸根對照品溶液（5 μg／mL）適量，倍比稀釋，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S／N）為3∶1和10∶1計(jì)算檢測限和定量限。結(jié)果硫酸根的檢測限為0.03 μg／mL，定量限為0.10 μg／mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg／mL）25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.39 %（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，3，5，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.58%（n＝7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為73190201）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果硫酸根平均含量為374 μg／mL，RSD為0.62 %（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（硫酸根含量為374 μg／mL，批號為73190201）0.5 mL，共6份，分別置50 mL容量瓶中，精密加入硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg／mL）0.5 mL，用淋洗液定容，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取12批樣品，分別以天津生化標(biāo)準(zhǔn)方法（方法1）、葛蘭素史克標(biāo)準(zhǔn)方法（方法2）及擬訂方法（方法3）進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

表2 3種方法含量測定結(jié)果比較（μg／mL，n＝3）Tab.2 Comparasion of the content of sulfate ion in the samples determined by three methods（μg／mL，n＝3）

3 討論

葛蘭素史克標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果略高于擬訂方法的測定結(jié)果（僅1批例外），可能與前者出峰過快（出峰時間為3 min）造成雜質(zhì)峰不能很好地分離有關(guān)；天津生化標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果低于擬訂方法測定結(jié)果（僅1批例外），可能與前者基線噪音較大，影響積分的準(zhǔn)確性有關(guān)。且葛蘭素史克標(biāo)準(zhǔn)方法中色譜柱是少用于離子色譜法的鋼化短柱，氫氧化鈉淋洗液濃度偏高，導(dǎo)致抑制器電流太高，影響其使用壽命，淋洗液配制也相對較煩瑣。本研究中在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化色譜條件來優(yōu)化檢測方法，新修訂的方法對不同企業(yè)那屈肝素鈣注射液中硫酸鹽的含量測定均有良好適用性，且操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，可作為國內(nèi)上市4家企業(yè)的那屈肝素鈣注射液中游離硫酸鹽含量的測定方法。