羅 玲，賀宗毅，韋，李 卿，楊 軔

（1.重慶市南岸區(qū)南山街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，重慶400065；2.重慶市中藥研究院，重慶400065；3.重慶市大足區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，重慶402360）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子實(shí)體，味甘、性平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)［1］，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘功效，臨床多用于心神不寧、肺虛咳嗽、虛勞短氣、不思飲食等證。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，其具有多種生物活性，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)文將靈芝作為新的藥食同源物料來源，極大地推動(dòng)了靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。超微粉碎技術(shù)通過機(jī)械或流體動(dòng)力的途徑將物料顆粒粉碎至微米級(jí)甚至納米級(jí)微粉的過程。中藥材活性成分主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞在完整無損情況下，活性成分只有穿透細(xì)胞壁才能發(fā)揮作用。經(jīng)過超微粉碎工藝，可使直徑10～100 μm的中藥細(xì)胞破壁率超過90%。中藥超微粉既保留了傳統(tǒng)飲片的優(yōu)點(diǎn)，又兼具一般顆粒所不具備的特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、生物活性等［2－9］。超微粉中藥來自天然藥材的超微粉碎，其溶出度高于普通粉，安全性可能與普通粉不完全相同［10－14］。通過靈芝超微粉長(zhǎng)期喂飼大鼠實(shí)驗(yàn)，全方位地評(píng)價(jià)其服用的安全性，對(duì)大鼠血液學(xué)及血液生化學(xué)的影響已有報(bào)道。本研究中擬介紹靈芝超微粉長(zhǎng)期喂飼對(duì)大鼠免疫學(xué)、尿液、眼科、臟器質(zhì)量及系數(shù)的影響，為科學(xué)、合理應(yīng)用靈芝提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：ST－360型酶標(biāo)儀（上?？迫A試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；AM－4290型尿液分析儀（日本京都第一科學(xué)儀器廠）；YZ11型檢眼鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；KJ5S1型手持裂隙燈顯微鏡（蘇州工業(yè)園區(qū)康捷醫(yī)療器械有限公司）；BX53型生物顯微鏡、CX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：總膽固醇（TC）試劑盒（批號(hào)為AUZ3408）、三酰甘油（TG）試劑盒（批號(hào)為AUZ4213）、肌酸激酶（CK）試劑盒（批號(hào)為9509），均購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；免疫球蛋白E（IgE）試劑盒（批號(hào)為20170801A）、CD3試劑盒（批號(hào)為20170801A）、CD4試劑盒（批號(hào)為20170801A）、CD8試劑盒（批號(hào)為20170801A），均購自上海繼錦化學(xué)科技有限公司；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號(hào)為908M031）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

藥物：靈芝超微粉（重慶純芝生物科技有限公司）經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.的干燥子實(shí)體。超微粉碎粒徑為150～400 nm，含靈芝多糖4.5%、三萜及甾醇0.68%。

動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，雌性，6～7周齡，體質(zhì)量130.3～192.1 g，60只；雄 性，6～7周 齡，體 質(zhì) 量167.2～226.2 g，60只。均由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（渝）2012－0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為No.0004635；動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（渝）2012－0003。飼養(yǎng)溫度為20.4～24.5℃，相對(duì)濕度為49%～69%；實(shí)驗(yàn)設(shè)施經(jīng)重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心檢測(cè)，符合GB 14925－2010標(biāo)準(zhǔn)中屏障環(huán)境要求。SPF大鼠維持喂養(yǎng)飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 方法

分組與給藥：將120只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為靈芝超微粉高、中、低劑量組（B組、C組、D組，給予生藥8.4，4.2，2.1g／kg）及溶劑對(duì)照組（A組，等體積水），各30只，雌雄各半，分開飼養(yǎng)。灌胃給藥，每天2次，連續(xù)91 d。

檢測(cè)指標(biāo)：分別于給藥結(jié)束后（D91，n＝10）及給藥結(jié)束30 d后（D121，n＝5）檢測(cè)大鼠免疫學(xué)指標(biāo)，包括CD3，CD4，CD8，IgE。尿液指標(biāo)，包括尿液外觀、比重（SG）、pH、尿糖（GLU）、尿蛋白（PRO）、膽紅素（BIL）、尿膽原（URP）、酮體（KET）、潛血（BLD）、白細(xì)胞（LEU）；等級(jí)區(qū)分，①外觀，“－”表示淺黃，澄清；②GLU（mmol／L），－（Normal）、±（50）、＋1（100）、＋2（200）、＋3（500）、＋4（1 000）；③PRO（g／L），－（neg.）、±（15）、＋1（30）、＋2（100）、＋3（300）、＋4（1 000）；④BIL（μmol／L），－（neg.）、＋1（0.5）、＋2（2）、＋3（6）、＋4（over）；⑤URO（μmol／L），－（Normal）、＋1（2）、＋2（4）、＋3（8）、＋4（over）；⑥pH，－（5.0和5.5）、±（6.0和6.5）、＋1（7.0和7.5）、＋2（8.0和8.5）、＋3（≥9.0）；⑦SG，－（＜1.005）、±（1.010）、＋1（1.015）、＋2（1.020）、＋3（1.025）、＋4（≥1.030）；⑧BLD（mg／L），－（neg）、±［溶血＋1（0.06）］、＋1［溶血＋＋（0.2）］、＋2［溶血＋3（1.0）］、＋3（非溶血＋1）、＋4（非溶血＋2、＋3）；⑨KET（mmol／L），－（neg.）、±、＋1（15）、＋2（40）、＋3（80）、＋4（150）；⑩LEU（Leu／μL），－（neg.）、±（25）、＋1（75）、＋2（250）、＋3（500）。眼科指標(biāo)，包括眼瞼、眼球、結(jié)膜、角膜、虹膜、瞳孔、眼底等。組織病理學(xué)指標(biāo)，包括心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表4。免疫學(xué)指標(biāo)影響方面，與A組比較，C組雌性大鼠給藥結(jié)束后的CD4水平顯著升高（P＜0.05），其余各組無顯著差異（P＞0.05）。尿液指標(biāo)的影響方面，給藥結(jié)束后及給藥結(jié)束30 d后，各組大鼠各指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）。眼科指標(biāo)的影響方面，給藥結(jié)束后及給藥結(jié)束30 d后，各組大鼠眼科相關(guān)指標(biāo)，包括眼前節(jié)（眼瞼、眼眶、眼球、淚腺）、眼后節(jié)（結(jié)膜、角膜、前房、房水）、眼外觀（玻璃體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)乳頭、血管、黃斑）等檢查均未異見異常（P＞0.05）。臟器質(zhì)量、臟器系數(shù)的影響方面，與A組比較，B組雄性大鼠給藥結(jié)束后的胸腺質(zhì)量及系數(shù)均顯著減少／降低，腎上腺系數(shù)顯著升高（P＜0.05）；D組雄性大鼠給藥結(jié)束后的肝臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），其余組大鼠的臟器質(zhì)量及系數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。恢復(fù)期結(jié)束，各組無顯著差異。

表1 靈芝超微粉（D91）對(duì)大鼠免疫學(xué)的影響（±s，n＝10）Tab.1 Effect of Ganoderma ultra－fine powder（D91）on immunology of rats（±s，n＝10）

表1 靈芝超微粉（D91）對(duì)大鼠免疫學(xué)的影響（±s，n＝10）Tab.1 Effect of Ganoderma ultra－fine powder（D91）on immunology of rats（±s，n＝10）

注：與A組比較，*P＜0.05。表3、表4同。Note：Compared with those in group A，*P＜0.05，as well as Tab.3 and Tab.4.

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表4 靈芝超微粉對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，g／100 g）Tab.4 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ coefficient of rats（±s，g／100 g）

表4 靈芝超微粉對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，g／100 g）Tab.4 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ coefficient of rats（±s，g／100 g）

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病理學(xué)影響方面，肉眼觀察，給藥結(jié)束后，B組、C組、D組大鼠心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見與樣品相關(guān)的異常改變；給藥結(jié)束30 d后，個(gè)別雄性大鼠解剖時(shí)觀察到腸道明顯脹氣，其余動(dòng)物肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見與樣品相關(guān)的異常改變；組織病理學(xué)檢查，靈芝超微粉生藥8.4 g／kg連續(xù)給藥3個(gè)月及恢復(fù)1個(gè)月結(jié)束，各臟器組織包括肝、心、脾、肺、腎、腦（大腦、小腦、腦干）、腎上腺（雙側(cè)）、胸腺、脊髓（頸椎、中段胸椎、腰椎）等病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示病理改變均為大鼠偶發(fā)或自發(fā)輕微病變，與給藥無明顯相關(guān)性。

表2 靈芝超微粉對(duì)雄性大鼠尿液指標(biāo)的影響（雄／雌，只）Tab.2 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on urine indexes of male rats（male／female，rat）

表3 靈芝超微粉對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響（±s，g）Tab.3 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ weight of rats（±s，g）

表3 靈芝超微粉對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響（±s，g）Tab.3 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ weight of rats（±s，g）

注：D91 A組1只雄性大鼠肝指標(biāo)異常，未納入統(tǒng)計(jì)。Note:On D91，one male rat in group A had abnormal liver indexes，which were not included in the statistics.

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3 討論

本研究結(jié)果顯示，SD大鼠連續(xù)91 d（2次／天）灌胃靈芝超微粉生藥8.4，4.2，2.1 g／kg，在停藥后恢復(fù)30 d時(shí)，各組雄、雌性大鼠免疫學(xué)指標(biāo)無明顯差異，尿液、眼科、臟器質(zhì)量及系數(shù)相關(guān)指標(biāo)未見明顯異常，綜合長(zhǎng)期喂飼雄、雌性大鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)檢查試驗(yàn)結(jié)果，均未見與藥物相關(guān)的異常改變。

超微粉碎技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥飲片、制劑（單味藥材及復(fù)方配伍）領(lǐng)域，已在中藥領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［15－17］，但在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題，需加強(qiáng)正確引導(dǎo)和科學(xué)評(píng)價(jià)中藥超微粉（制劑）及其進(jìn)入人體后的安全性問題等［18］。

中藥材超微粉碎適應(yīng)了現(xiàn)代社會(huì)快節(jié)奏生活的需求，但由于中藥材品種多，分類廣，應(yīng)按藥材性質(zhì)及特征選擇合適的加工方法，加強(qiáng)物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效學(xué)及毒理學(xué)研究，特別是安全性的規(guī)范評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供參考。