申麗莎，楊，蔣成英，張安琪，楊巧虹

（1.重慶市中藥研究院，重慶400061；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶401121；3.重慶醫(yī)療器械質量檢驗中心，重慶401147）

骨質疏松癥是以骨量低下、骨微結構損壞而導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。該病屬中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇，證候分布特點以“腎精虧損”為主［1］，臨床多采用補腎益精類中藥及其復方治療。參仙片由淫羊藿、女貞子、仙茅、人參和制何首烏5味中藥材組方，有溫腎益精、補氣養(yǎng)心功效［2－3］。本研究中利用網絡藥理學與分子對接技術［4］，構建參仙片治療骨質疏松癥的藥物成分與靶點及調控的通路網絡，為該藥臨床用于骨質疏松癥的治療提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據收集

有效成分篩選：利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：／／tcmspw.com／），以人參、女貞子、仙茅、淫羊藿為關鍵詞，檢索其有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，參考國內外文獻，查找制何首烏的活性成分，利用PubChem網站（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）獲取各活性成分的SMILES式，導入SwissADME平臺（http：／／www.swissadme.ch／），最終收集得符合條件的有效成分。

有效成分相關靶點收集：利用TCMSP數據庫中的Related Targets，PubChem，Swiss Target Prediction數據庫（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）對有效成分相關靶點進行預測，篩選出每味中藥有效成分的潛在靶點，再通過蛋白數據庫Uniprot（https：／／www.uniprot.org／）將靶點轉換為統(tǒng)一基因名稱。

潛在靶點獲?。豪肎eneCards數據庫（https：／／www.genecards.org／），以“Osteoporosis”為關鍵詞進行檢索并匯總，得到骨質疏松癥的相關靶點，再通過微生信（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）在線作圖工具，將參仙片與骨質疏松癥靶點進行映射，獲得潛在作用靶點。

1.2 網絡模型的構建與分析

利用Cytoscape 3.8.2軟件構建“藥物－成分－潛在靶點”的網絡，并分析其網絡拓撲參數，得到主要有效成分及靶點關系。將參仙片的潛在靶點輸入String數據庫（https：／／string－db.org／），以 物 種homo sapiens，combined score＞0.4為標準進行篩選，得到潛在靶點的蛋白相互作用（PPI）網絡。

1.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

利 用David 6.8.0數 據 庫（https：／／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），對參仙片治療骨質疏松癥的潛在靶點進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。

1.4 成分－靶點分子對接

從Rcsb數 據 庫（http：／／www.rcsb.org／）中 下 載PPI網絡中排名前三的關鍵靶點的晶體結構：AKT1（PDB ID：6HHH），白細胞介素6（IL－6，PDB ID：1ALU），TP53（PDB ID：2VUK），綜 合 運 用PyMol和AutoDock Tools 1.5.6軟件完成分子對接及相關的可視化處理。

2 結果

2.1 有效成分篩選與作用靶點確定

共篩選出參仙片有效成分68個，其中有57個化學成分在TCMSP數據庫及Swiss Target Prediction數據庫中匹配到404個靶點（刪除重復值后）。

2.2 潛在作用靶點預測

通過GeneCards數據庫得到骨質疏松靶點4 441個，將參仙片中的作用靶點與骨質疏松癥靶點進行映射，獲得共同靶點259個（見圖1）。表明參仙片可能通過多個潛在作用靶點協同治療骨質疏松癥。

圖1 參仙片活性成分靶點與骨質疏松癥靶點映射Fig.1 Mapping between targets of active ingredients in Shenxian Tablets and osteoporosis－related targets

2.3 “中藥－有效成分－潛在靶點”網絡構建

利用Cytoscape 3.8.2軟件將5種中藥、57個化學成分和259個潛在靶點進行可視化處理（見圖2）。該網絡共有409個節(jié)點、1 576條邊，該網絡節(jié)點的平均degree為7.706 6，接近中心值（BC）平均值0.005 6，緊密度中心性（CC）平均值為0.308 7。其中，有23個活性成分的degree，BC，CC均高于平均值。排名前三的化合物分別為quercetin，moupinamide，citreorosein，推測這3個成分是參仙片防治骨質疏松癥的主要活性成分。

圖2 參仙片治療骨質疏松癥的“藥物－成分－潛在靶點”網絡Fig.2″Drug－component－potential target″network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis

2.4 PPI網絡構建

將參仙片與骨質疏松癥的259個共同靶點輸入String數據庫，物種限定為“homo sapiens”，選取minimun required interaction score＞0.4，探尋靶基因相互作用間的作用關系（見圖3）。該網絡涉及257個節(jié)點、5 408條邊，其中節(jié)點表示靶基因，邊表示靶基因間的相互作用關系。網絡拓撲分析結果表明，節(jié)點degree均值為42.25。根據節(jié)點數值高于2倍degree平均值篩選出29個關鍵靶點（見圖4），并認為這些靶點對參仙片防治骨質疏松癥起到了關鍵作用。按degree排列，排名前三的靶點分別為AKT1，IL－6，TP53，可認為這是核心靶點。

圖3 參仙片治療骨質疏松癥相關靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis－related targets

圖4 關鍵靶點的PPI網絡Fig.4 PPI network of key targets

2.5 靶點的GO功能富集分析

將參仙片的259個潛在靶點錄入David數據庫，以P＜0.05為篩選條件，共得到GO富集條目1 084個，其中包括819個生物過程（BP）、87種細胞組分（CC）和178種分子功能（MF）。各選取排前10名的GO條目繪制柱狀圖（見圖5）。結果表明，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、細胞增殖、DNA模板轉錄、基因表達的正調控，藥物應答，信號轉導，凋亡過程的負調控等生物過程均在參仙片防治骨質疏松癥過程中發(fā)揮了重要作用。

圖5 GO功能富集分析結果Fig.5 Results of GO functional enrichment analysis

2.6 靶點的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析中有121條信號通路（P＜0.05），取排前20名的條目繪制氣泡圖（見圖6），與骨質疏松癥相關的通路主要有細胞凋亡、TNF信號通路、HIF－1信號通路、FoxO信號通路、PI3K－Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路等。

圖6 KEGG通路富集分析結果Fig.6 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對接

根據“藥物－成分－潛在靶點”網絡的23個主要活性成分，選擇degree大于均值的前3名的活性成分。與PPI網絡拓撲分析后所得的29個關鍵靶點的前3個靶點蛋白進行分子對接，分子對接結合自由能越小，則表示受體與配體之間的親和力越大（見表1）。將這3個化合物分別與3個靶點蛋白的結合進行可視化處理（見圖7）。結果顯示，各活性成分與AKT1，IL－6，TP53均有很好的親和力。

圖7 主要活性成分與關鍵靶點分子對接模擬圖Fig.7 Molecular docking simulation of main active ingredients and key targets

表1 活性成分與靶點蛋白的結合能Tab.1 Binding ability between active ingredients and target proteins

3 討論

正常的骨代謝過程是骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡。骨吸收由破骨細胞介導，骨形成則由成骨細胞介導［5］。當骨代謝出現異常，骨吸收超過骨形成時，則引起骨質疏松癥。遺傳、激素、局部細胞因子、營養(yǎng)攝入、運動、藥物等因素均會影響骨代謝過程［6］。

參仙片中的5味中藥均屬補益類藥物，對骨質疏松癥具有較好的藥理活性［7－15］。本研究中篩選出參仙片中的關鍵化學成分57個，關鍵靶點29個，以及相關信號通路121條。其中，排前3名的化學成分分別為quercetin，moupinamide，citreorosein（quercetin為女貞子和淫羊藿的共有成分［16－17］，moupinamide和citreorosein為何首烏的活性成分［18］），而排前3名的靶點分別為AKT1，IL－6，TP53。已有研究發(fā)現，quercetin不僅可上調BMP2和Smad4的表達，促進成骨細胞分化進而改善骨質疏松癥［19］；還能降低骨內SIPS相關p21，TP53，SASP的水平，使成骨細胞水平不受影響，進而延緩骨細胞衰老，挽救由雌激素缺乏導致的骨丟失［20］。還有研究發(fā)現，quercetin通過抑制ERK1／2與MAPK mRNA和蛋白的表達，進一步抑制ERK1／2－MAPK信號通路的傳導，從而改善骨小梁結構數量，增加骨密度［21］。moupinamide能抑制環(huán)氧合酶（COX）1和COX2的活性，發(fā)揮抗炎、抗氧化的藥理作用，保護成骨細胞［22］。citreorosein通過抑制MAPK和AKT介導的IKK磷酸化進而抑制轉錄因子NF－κB活化來抑制促炎細胞因子的產生［23］。除了“藥物－成分－靶點”的信息，“靶點－信號通路”在骨質疏松癥的作用機制方面也有大量文獻報 道，如AKT1可 控 制Akt1／forkhead box class O（FoxO）3a／Bim信號通路，首先使FoxO3a發(fā)生磷酸化，以防止其核定位，從而抑制下游bim基因的激活，最終抑制成骨細胞的凋亡［24］。IL－6與人體內的激素水平有密切關系，雌激素和雄激素均可通過激活IL－6基因啟動子轉錄活性的受體介導作用，抑制成骨細胞增殖［25］；反之，雌激素缺失引起的骨質疏松模型動物的骨髓細胞中IL－6水平則顯著升高［26］。在骨質疏松癥的患者和模型動物中，TP53基因表達和血清p53水平均明顯上調，說明p53水平升高與骨量減少相關，提示科研人員可通過抑制p53來逆轉骨質疏松癥［27］。本研究中不僅采用網絡藥理學篩選出參仙片中防治骨質疏松癥的活性成分、相關靶點及分子通路，還對關鍵成分與靶點分子對接所展現出的良好親和力和穩(wěn)定構象進行了驗證。

本研究中以參仙片為對象，對其中所含活性成分、作用靶點及生物過程和相關通路進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現參仙片主要化學成分及關鍵靶點可能通過多種信號通路作用于成骨細胞，刺激成骨細胞增殖，抑制破骨細胞，進一步調節(jié)骨細胞代謝，從而達到防治骨質疏松癥的目的，體現了中藥復方多成分、多靶點、多途徑相互作用的結果。本研究為臨床將參仙片用于骨質疏松癥的防治提供了理論基礎，但所收集的疾病和藥物所涉及的靶點可能與目前的熱點研究及報道的側重點相關，導致數據庫中的數據收集不全面，尚需進一步深入研究和驗證。