王保華，郭起岳，劉月姝，白建瑜，朱章志，李賽美*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東 佛山 528248)

降糖三黃片是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥復(fù)方院內(nèi)制劑，由桃仁、桂枝、大黃、芒硝、黃芪、生地黃、麥冬、玄參、炙甘草組成，具有瀉熱逐瘀，益氣養(yǎng)陰的功效，用于治療2型糖尿病及慢性并發(fā)癥[1-5]，臨床療效明確。為新藥研發(fā)及臨床用藥提供安全性評價依據(jù)，本研究對降糖三黃片急性毒性及長期反復(fù)用藥的蓄積毒性反應(yīng)、劑量毒性效應(yīng)關(guān)系、毒性靶器官及可逆性進(jìn)行實驗研究。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，6～7周齡，雌雄各半，體質(zhì)量100～118 g，購買及飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 藥物

降糖三黃片(粵藥制字：Z20071185，批號：20150301)，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)。

1.3 儀器

全自動血細(xì)胞生化分析儀，日本HITACHI；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific；KJ8A1直接檢眼鏡，蘇州康捷醫(yī)療器械有限公司；ASP300S全自動脫水機(jī)，德國LEICA；EG1150生物組織包埋機(jī)，德國LEICA；RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國LEICA；HI1210攤片機(jī)，德國LEICA；HI1220烘片機(jī)，德國LEICA；AutoStainer-XL自動染色機(jī)，德國LEICA；BX43型生物顯微鏡，日本OLYMPUS。

2 方法

2.1 急性毒性試驗

SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對照組和降糖三黃片組，每組20只。禁食不禁水約16 h后稱重，1日3次灌胃給藥最大允許濃度(0.6 g/mL)和劑量(20 mL/kg)的降糖三黃片混懸液，即給藥量為36 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床最大擬用藥量的288倍。對照組給予等體積的去離子水。連續(xù)14 d觀察大鼠外觀、行為活動、呼吸、攝食攝水量、排便、死亡等情況。

2.2 長期毒性試驗

2.2.1 動物分組與藥物劑量選擇

SPF級SD大鼠208只，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組、降糖三黃片低(臨床劑量8倍，1 g·kg-1·d-1)、中(臨床劑量24倍，3 g·kg-1·d-1)、高劑量組(臨床劑量72倍，9 g·kg-1·d-1)，48只/組，按性別分籠飼養(yǎng)。每天1次灌胃降糖三黃片混懸液，對照組給予等體積的去離子水，連續(xù)6個月。每周稱重，跟據(jù)體質(zhì)量變化及時調(diào)整給藥量，恢復(fù)期觀察28 d。

2.2.2 觀察指標(biāo)

每天觀察大鼠精神狀態(tài)、行為活動等一般情況及其他毒性癥狀；計算攝食量與攝水量；給藥前及給藥后每周對大鼠進(jìn)行稱重；實驗中期(給藥3個月)、實驗?zāi)┢?6個月)及恢復(fù)期(停藥1個月)，每組各取總數(shù)的1/3大鼠，硫酸阿托品散瞳后進(jìn)行眼科檢查；代謝籠采集24 h尿液進(jìn)行尿量計算及分析；麻醉后腹主動脈取血，制備全血及血清標(biāo)本，分別進(jìn)行血常規(guī)及生化指標(biāo)檢測；解剖取臟器、稱重，計算臟器系數(shù)，心、肝、腎等臟器于4%多聚甲醛固定，包埋，切片及HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 降糖三黃片急性毒性試驗結(jié)果

給藥期間連續(xù)觀察14 d，大鼠一般狀況、自主活動、體表完好，生理腔道未見異常分泌物。試驗結(jié)束后各組無大鼠死亡，未見明顯毒性反應(yīng)癥狀，解剖后腦、心臟、肝臟、脾臟等主要器官未發(fā)現(xiàn)異常。大鼠攝食攝水量、體質(zhì)量增長無異常，降糖三黃片低、中、高劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 降糖三黃片長期毒性試驗結(jié)果

3.2.1 降糖三黃片對大鼠一般狀況的影響

試驗期間，各組大鼠精神狀態(tài)、外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸均無異常，無毒性癥狀出現(xiàn)。各組大鼠均無死亡，停藥后各項觀察指標(biāo)均未見異常改變。

3.2.2 降糖三黃片對各組大鼠攝食、攝水量和體質(zhì)量的影響

試驗期間各組大鼠飲食正常，攝食、攝水量無差異，尿量及尿常規(guī)檢查無異常，給藥組個別大鼠出現(xiàn)大便偏軟，但停藥后24 h即恢復(fù)正常，均未出現(xiàn)腹瀉癥狀。與對照組相比，降糖三黃片各組大鼠體質(zhì)量增長變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表1。

3.2.3 降糖三黃片對大鼠眼科檢查的影響

眼科檢查表明，給藥3個月、6個月及停藥1個月各組大鼠眼眶、眼瞼、眼球、瞳孔、角膜、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)乳頭等無異常。

表1 降糖三黃片對大鼠體質(zhì)量影響

3.2.4 降糖三黃片對大鼠血常規(guī)、凝血功能及生化指標(biāo)的影響

與對照組相比，各組大鼠在給藥3個月、6個月及停藥1個月的血常規(guī)、凝血功能、血糖、甘油三酯、膽固醇、血清鈉離子差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給藥3個月的降糖三黃片中、高劑量組大鼠血清鉀離子和給藥6個月的降糖三黃片中劑量組大鼠血清氯離子偏高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；給藥6個月的降糖三黃片低劑量組大鼠血清胰島素偏高，停藥1個月的降糖三黃片中、高劑量組大鼠胰島素偏低，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但這些差異均無劑量依賴性，故無毒理學(xué)意義；其余觀察期及其他組大鼠血清鉀離子、氯離子、胰島素含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表2、表3。

3.2.5 降糖三黃片對大鼠肝腎功能指標(biāo)的影響

與對照組相比，各組大鼠在給藥3個月、6個月及停藥1個月的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、尿素氮等肝腎功能指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給藥6個月的降糖三黃片中、高劑量組大鼠血清肌酐偏低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但并無生物學(xué)意義，結(jié)果見表4。

表2 降糖三黃片對大鼠血常規(guī)及凝血功能影響

表3 降糖三黃片對大鼠糖脂代謝、生化指標(biāo)的影響

表4 降糖三黃片對大鼠肝腎功能的影響

3.2.6 降糖三黃片對重要臟器系數(shù)及組織形態(tài)學(xué)的影響

給藥3個月、6個月及停藥1個月，對各組大鼠臟器進(jìn)行全面細(xì)致的肉眼尸檢，未發(fā)現(xiàn)異常器官組織。各組大鼠的心臟、腎臟、肝臟、胰腺、卵巢、睪丸等13個臟器除個別動物出現(xiàn)動物自發(fā)性病變導(dǎo)致的組織形態(tài)學(xué)變化外，其余大鼠臟器未見異常組織形態(tài)學(xué)變化。與對照組相比，降糖三黃片低、中、高劑量組大鼠的臟器系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表5。

表5 降糖三黃片對大鼠臟器系數(shù)的影響

4 討論

降糖三黃片由本課題組基于中醫(yī)治療2型糖尿病的系列臨床觀察[1-2]，以中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》[6]記載的桃核承氣湯為主方開發(fā)的制劑，由桃仁、桂枝、大黃、芒硝、黃芪、生地黃、麥冬、玄參、炙甘草組成。課題組前期一系列研究表明，該藥物具有改善2型糖尿病糖脂代謝紊亂，延緩2型糖尿病心、腎并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的作用[3-11]。為保證臨床用藥安全性，本研究按照《中藥新藥研究指南》[12]和《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]的要求對降糖三黃片的毒性進(jìn)行評價，以為新藥研發(fā)提供安全性評價依據(jù)。

急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果顯示，按照降糖三黃片最大允許濃度(0.6 g/mL)和最大允許劑量(20 mL/kg)給藥后，動物未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，表明降糖三黃片無急性毒性反應(yīng)。長期給藥毒性試驗中，最大給藥劑量9 g/kg(臨床劑量的72倍)，連續(xù)給藥6個月，大鼠的精神狀態(tài)、行為活動、攝食量及排泄功能等一般生理狀態(tài)均良好無異常，給藥組個別大鼠大便偏軟但并無腹瀉，且停藥后24 h能夠恢復(fù)。與對照組比，降糖三黃片各劑量組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，提示降糖三黃片對正常大鼠體質(zhì)量增長無影響。給藥30 d、60 d及停藥后28 d的降糖三黃片各劑量組大鼠血常規(guī)、凝血指標(biāo)、血糖、鈉離子、胰島素、肝腎功能指標(biāo)、臟器系數(shù)與對照組相比無顯著性差異；個別劑量組大鼠血清鉀離子、氯離子、胰島素含量與對照組有差異，但并無劑量依賴性及時間規(guī)律性，無毒理學(xué)意義。結(jié)合實驗背景，極個別動物出現(xiàn)的臟器組織形態(tài)學(xué)變化為動物自發(fā)性病變，其余各組大鼠臟器均未見病理學(xué)損傷。因此，降糖三黃片對大鼠一般生理狀態(tài)及肝臟、腎臟功能、生殖系統(tǒng)、腺體分泌、臟器組織學(xué)均無長期毒性及延遲毒性反應(yīng)。

綜上所述，降糖三黃片無急性毒性、長期毒性和延遲毒性反應(yīng)，藥物的最大耐受量(MTD)≥36 g/kg(臨床劑量的288倍)；基本安全劑量(NOAEL)為9 g/kg(臨床劑量的72倍)，在治療劑量范圍內(nèi)用藥安全性高。