孫延平,王博譞,劉艷,梁軍,劉艷鑫,曹琦,楊炳友,王秋紅,匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所藥用資源開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150081;4.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 512000)

牽牛子近年來研究文獻(xiàn)較少，大多主要集中于對(duì)牽牛子藥材本身的傳統(tǒng)功用、臨床應(yīng)用、毒副作用及部分藥理作用的總結(jié)歸納[1-5]，對(duì)于牽牛子的化學(xué)成分研究，近期僅限于對(duì)牽牛子苷類(樹脂苷類)成分的結(jié)構(gòu)研究[6]，以及牽牛子苷對(duì)抗癲癇、抗結(jié)腸癌、抗菌作用及機(jī)制研究[7-9]。目前對(duì)于牽牛子中大分子物質(zhì)的研究，特別是多糖類成分研究較少，本課題組前期從中藥藥性理論的角度進(jìn)行了牽牛子化學(xué)拆分組分的性味藥理學(xué)評(píng)價(jià)及藥味歸屬研究，發(fā)現(xiàn)PNP具有利尿、增加大鼠大腸推進(jìn)率及化痰等藥理作用[10]，此外，PNP通過降低炎性因子含量，提高腎小球過濾功能，顯著改善大鼠腎病綜合征,緩解水腫[11-12]。

多糖作為一種中藥中廣泛存在的大分子類化合物，具有復(fù)雜而多方面的生物活性和功能[13-17]，為了合理開發(fā)利用PNP這種豐富資源，多糖的結(jié)構(gòu)表征及其潛在活性急需挖掘。因此，本研究從PNP中分離純化得到均一多糖PNP-5，采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、高效凝膠排阻色譜(HPSEC)、高效液相色譜(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、高碘酸氧化Smith降解和甲基化分析、核磁共振(NMR)等技術(shù)從純度、分子量、基團(tuán)特征結(jié)構(gòu)、單糖組成、主鏈側(cè)鏈糖苷鍵連接方式和組成對(duì)PNP-5進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并對(duì)其體外清除自由基活性及對(duì)體外小鼠脾細(xì)胞增殖活性進(jìn)行了研究，以期為PNP的生物活性、作用機(jī)制和綜合利用提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 儀器與材料

R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Alltech ELSD-2000蒸發(fā)光檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司)；pH計(jì)Sartorius PB-20(德國(guó)Sartorius公司)；Shimadzu FTIR-8400S紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Shimadzu UV-1601紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Thermo Fisher Scientific DSQ II氣相色譜質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

弱陰性陰離子交換樹脂F(xiàn)PA90Cl-(美國(guó)Amberlite公司)；弱陽(yáng)性陽(yáng)離子交換樹脂IRC84(美國(guó)Amberlite公司)；離子交換纖維素DEAE Cellulose 52(英國(guó)Whatman公司)；離子交換瓊脂糖凝膠DEAE-Sepharose F.F(瑞典Pharmacia公司)；丙烯葡聚糖凝膠Sephacyrl S-400(瑞典Pharmacia公司)；葡聚糖凝膠Sephadex G-50(瑞典Pharmacia公司)；糖柱Shodex sugar KS-805(日本Shodex公司)；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran(瑞典Pharmacia公司)；透析袋(截留分子量3500)(美國(guó)Sigma公司)；C.M.C[1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對(duì)甲苯黃酸鹽](美國(guó)Fluka公司)；硼氫化鈉(美國(guó)Sigma公司)；三氟乙酸(德國(guó)Merck公司)；硫酸(北京市化學(xué)試劑公司)；氫氧化鈉(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)；重水D2O(瑞典Pharmacia公司)。

小鼠脾細(xì)胞來源BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

牽牛子藥材于2012年10月購(gòu)自于哈爾濱市藥材公司，產(chǎn)地為山東，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定，為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil(L.)Choisy的干燥成熟種子，標(biāo)本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 PNP-5的提取分離制備

將1 kg干燥的牽牛子用95%乙醇加熱回流提取，過濾，藥渣用水煎煮冷卻后濾過、合并濾液。加入95%乙醇使乙醇終濃度為85%，收集沉淀，冷凍干燥，得182 g牽牛子粗多糖。20 g 牽牛子粗多糖加入蒸餾水，使溶解成終濃度為5%的溶液，經(jīng)過Amberlite FPA90-Cl-(5 cm×50 cm)+Amberlite IRC-84(5 cm×50 cm)陰陽(yáng)離子串聯(lián)樹脂柱，得到水洗脫部位，再經(jīng)DEAE-Cellulose DE-52(3.5 cm×50 cm)0.4 mol/L NaCl水溶液洗脫和Sephacryl S-400(1.6 cm×75 cm)凝膠色譜柱水洗脫，進(jìn)一步分離純化，得到282 mg牽牛子均一多糖，并命名為PNP-5(Pharbitis nil polysaccharide-5)。

2.2 PNP-5結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 UV光譜測(cè)試

將PNP-5以蒸餾水配成濃度為2.0 mg/mL的溶液，離心，取上清液在190～400 nm內(nèi)利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，以確定牽牛子多糖中是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物。

2.2.2 純度檢驗(yàn)及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)(2996泵，Alltech ELSD2000，Shodex sugar KS-805+保護(hù)柱KS-G)進(jìn)行HPSEC法測(cè)試，室溫下以超純水為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran T10、Dextran T40、Dextran T70、Dextran T500、Dextran T2000作為標(biāo)準(zhǔn)品配置溶液進(jìn)樣，以分子量的lg值為橫坐標(biāo)，以保留時(shí)間tR為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。PNP-5樣品同法制備，進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算PNP-5分子量。

2.2.3 IR光譜測(cè)試

取2 mg PNP-5多糖樣品，用KBr壓片后進(jìn)行常規(guī)IR掃描，掃描波長(zhǎng)400～4 000 cm-1；對(duì)甲基化多糖樣品，則采用氯仿液膜的形式進(jìn)行IR光譜掃描。

2.2.4 單糖組成的測(cè)定

稱取10 mg PNP-5樣品用2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液110 ℃水解8 h，經(jīng)離心分離取上清液，用甲醇反復(fù)減壓回收除去TFA至pH值為7.0，用去離子水定容至2.0 mL，離心，取上清液進(jìn)行PMP衍生化，經(jīng)HPLC分析，在與以上相同條件下，以8種單糖：甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)作為對(duì)照品溶液制作峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，根據(jù)各單糖對(duì)照品的保留時(shí)間，確定牽牛子多糖的單糖組成。

具體色譜條件采用Diamonsil?C18(2)色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)。流動(dòng)相A：0.05 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)緩沖液-乙腈(體積比為85∶15)；流動(dòng)相B：0.05 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)緩沖液-乙腈(體積比為60∶40)。梯度洗脫條件：時(shí)間為0→10→30 min，對(duì)應(yīng)流動(dòng)相為100%→92%→80%溶劑A。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.5 高碘酸氧化Smith降解

依據(jù)文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，最終計(jì)算出高碘酸的消耗量和甲酸的生成量。然后進(jìn)行Smith降解反應(yīng)，將乙二醇處理后的溶液透析，取透析袋內(nèi)液濃縮，加入NaBH4還原過夜。用50%HAc中和至pH為6～7，蒸餾水透析。取1/3干燥后做GC分析，剩余部分進(jìn)行Smith降解。加入等體積的1 mol/L H2SO4，25 ℃水解40 h，BaCO3中和至pH為6，用定量濾紙過濾，濾液用蒸餾水透析，袋外部分干燥做GC分析，袋內(nèi)加乙醇醇析，離心，上清及沉淀部分干燥后分別做GC分析。

2.2.6 甲基化分析

參考文獻(xiàn)方法[19-20]，取20 mg PNP-5進(jìn)行甲基化，經(jīng)氯仿反復(fù)萃取后，IR圖譜在3 400 cm-1處無(wú)吸收峰，即無(wú)羥基吸收峰，則證明多糖甲基化完全。再經(jīng)水解、還原、乙?；?，進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：采用Agilent 5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備DB-1701毛細(xì)管柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm，程序升溫，柱溫80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min至200 ℃，以2 ℃/min至220 ℃，以10 ℃/min至270 ℃，保持1 min，氦氣作載氣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比1∶42，柱流速1.2 mL/min。EI(70 eV)，接口溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，掃描范圍：m/z43～500，掃描速率：2.5 scan/s。

2.2.7 磁共振光譜分析

取PNP-5樣品40～60 mg溶于1 mL D2O，凍干后再次溶解于2 mL D2O，離心，上清液裝入核磁管，于室溫核磁共振儀上進(jìn)行13C-NMR光譜測(cè)定。

2.3 體外生物活性研究

2.3.1 PNP-5體外清除ABTS+·活性測(cè)定

體外抗氧化活性采用簡(jiǎn)單方便快速的體外抗ABTS+·自由基實(shí)驗(yàn)，測(cè)定步驟如下：首先將ABTS溶于0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)溶液中，配成濃度為7 mol/L的溶液。然后，將7 mol/L的ABTS溶液加入過硫酸鉀使之終濃度為2.45 mol/L，即可配制成ABTS+·,混合溶液黑暗中靜置16 h開始使用。ABTS+·溶液用PBS溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02(734 nm)，水浴30℃平衡30 min。把PNP-5樣品稀釋成濃度為0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.5和5 mg/mL，各0.2 mL，加入2.0 mL稀釋好的ABTS+·溶液。在室溫下反應(yīng)20 min后，在波長(zhǎng)為734 nm下，迅速測(cè)定并記錄吸光度。維生素C(Vc)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。ABTS自由基清除率百分比計(jì)算，根據(jù)公式如下：ABTS清除率(%)=[A0-(As-Ab)]/A0×100。其中A0為ABTS未加入樣品的A734；As為ABTS加入樣品的A734；Ab為樣品未加入ABTS的A734。

2.3.2 PNP-5體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響

準(zhǔn)確稱取PNP-5樣品1～2 mg，溶于適量生理鹽水，濃度為4 mg/mL。使用前分別取適量上述多糖溶液稀釋至濃度為5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。小鼠頸椎脫位處死，眼球放血，75%酒精消毒。無(wú)菌取脾，置于盛無(wú)菌PBS液的培養(yǎng)皿中，用注射器片芯研磨后過100目篩網(wǎng)，用PBS沖洗3次。用PBS液洗滌小鼠脾細(xì)胞2次，每次用量10 mL左右。后1 000 r/min離心10 min，棄上清。加10 mL 10% FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，后調(diào)細(xì)胞濃度至1×108/mL。將PNP-5各個(gè)濃度100 μL/孔，均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，100 μL/孔，加入96孔培養(yǎng)板中，以RPMI-1640對(duì)照。每孔加細(xì)胞懸液100 μL，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)44 h。每孔加入5 mg/mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入二甲亞砜100 μL，于微量振蕩器上緩慢作用10 min，在酶標(biāo)儀上于492 nm處測(cè)吸光度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 UV光譜分析

PNP-5凍干品為土黃色絮狀物，吸濕性強(qiáng)，能溶于水，易溶于熱水，不溶于有機(jī)溶劑。PNP-5的紫外光譜在260 nm和280 nm處無(wú)明顯吸收峰，表明無(wú)核酸和蛋白質(zhì)(圖1)。

圖1 PNP-5 UV光譜圖

3.2 純度檢驗(yàn)及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

按tR-lgM關(guān)系作圖得到標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.445 5x+14.146,R2=0.993 6。HPSEC法測(cè)定PNP-5凝膠曲線圖譜見圖2，顯示為單一對(duì)稱峰，表明PNP-5為均一性多糖。根據(jù)PNP-5的保留時(shí)間tR為17.721 min，計(jì)算出它們的分子量為1.78×106Da。

3.3 IR光譜分析

PNP-5的IR光譜顯示其具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰(圖3)，3 355 cm-1出現(xiàn)一種寬峰，為O-H的伸縮振動(dòng)峰，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；2 931 cm-1處有吸收，為C-H的伸縮振動(dòng)峰；1 647 cm-1處為糖類-OH吸收峰；1 600 cm-1、1 417 cm-1有吸收表明有羧酸離子存在；在1 400～1 410 cm-1處有吸收峰，可能為C-O伸縮振動(dòng)引起的；在1 240～1 040 cm-1間有特征峰，可能為O-H變角振動(dòng)引起的，1 147 cm-1、1 060 cm-1、1 041 cm-1處具有很強(qiáng)的糖環(huán)特征吸收，表明具有吡喃環(huán)特征結(jié)構(gòu)。

3.4 單糖組成分析

將PNP-5完全酸水解后，通過PMP柱前衍生，經(jīng)高效液相定量分析，見圖4，結(jié)果表明PNP-5的組成單糖為Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal和Ara，其摩爾比為3.2∶10.6∶5.7∶1.5∶1.0∶4.5∶1.7∶4.5，相應(yīng)的摩爾百分?jǐn)?shù)分別為9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%和13.7%。以上數(shù)據(jù)表明，PNP-5為一個(gè)以鼠李糖為主的酸性雜多糖。

圖2 PNP-5的HPSEC色譜圖 (tR=17.721 min)

圖3 PNP-5的IR光譜圖

圖4 PNP-5經(jīng)完全酸水解后的PMP衍生物HPLC圖

3.5 高碘酸氧化Smith降解反應(yīng)分析

將PNP-5進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，結(jié)果表明生成甲酸的鍵型占30.5%，說明每10個(gè)己糖殘基大約有3個(gè)非還原末端或1→6糖苷鍵，并且存在連三羥基，即存在1→或1→6鍵型；被高碘酸氧化但不產(chǎn)生甲酸的鍵型占52.1%，說明有約1/2的鍵型為1→2、1→2,6、1→4或1→4,6等鍵型；不被高碘酸氧化的鍵型占17.4%，說明還有少量的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4鍵型中的某些鍵型。

高碘酸氧化后進(jìn)行完全酸水解，只檢出大量的Gly、Ery、Rha，此外還有少量的Gal，表明糖鏈中主要存在1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6等鍵型中的某些鍵型，且Rha及Gal中含有某些不被高碘酸氧化的鍵型如1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4等鍵型。經(jīng)Smith降解后，袋內(nèi)沉淀檢出Gly、Ery、Rha和Gal，表明主鏈核心部分含有1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6中的某些鍵型，且Rha和Gal所含的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4鍵型中的某些鍵型存在于主鏈核心部分；袋內(nèi)上清部分只檢測(cè)出含有Ery，說明支鏈或主鏈邊緣只存在1→4或1→4,6鍵型；袋外部分只檢測(cè)出含有Gly，說明支鏈或者主鏈的末端殘基上含有1→、1→6、1→2、1→2,6中的某些鍵型(表1)。

表1 PNP-5經(jīng)高碘酸氧化Smith降解片段結(jié)果

3.6 甲基化分析

將PNP-5的甲基化產(chǎn)物，通過酸水解、乙?；苽涑善浒柕洗家宜狨?，經(jīng)過GC-MS分析，可以得到PNP-5中糖殘基的各種連接方式(表2)。其中阿拉伯糖基只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,5-tri-O-methyl-1,4-di-O-acetyl-arabinitol，表明阿拉伯糖以呋喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為T-Araf-(1→，約占13.7%；鼠李糖共表現(xiàn)出2種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即3,4,6-tri-O-methyl-1,2,5-tri-O-acetyl-rhamnitol、3,6-di-O-methyl-1,2,4,5-tetra-O-acetyl-rhamnitol，表明鼠李糖均以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為→2)-Rhap-(1→和→2,4)-Rhap-(1→，其中以→2)-Rhap-(1→為主，約占20.2%；甘露糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3-di-O-methyl-1,4,5,6-tetra-O-acetyl-mannitol，表明甘露糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為→4,6)-Manp-(1→，約占9.9%；木糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4,6-tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-xylitol，表明木糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為T-Xylp-(1→，約占13.7%；葡萄糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4-tri-O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-glucitol，表明葡萄糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為→6)-Glcp-(1→，約占3.1%；半乳糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,4-di-O-methyl-1,3,5,6-tetra-O-acetyl-galactitol，表明半乳糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為→3,6)-Galp-(1→，約占5.3%；糖醛酸主要表現(xiàn)為→4)-GalpA-(1→和→4)-GlcpA-(1→，其分別約占4.6%和17.4%。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對(duì)甲苯黃酸鹽(CMC)還原后的CMC-PNP-5色譜圖較還原前的PNP-5多檢測(cè)出2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylgalactitol和2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylglucitol，因此確定了PNP-5中糖醛酸的連接方式。

表2 PNP-5的糖連接方式分析

3.7 核磁譜分析

PNP-5的13C-NMR譜(圖5)中，在δ54.6處的碳信號(hào)，可歸屬于糖醛酸甲酯化后的甲氧基碳信號(hào)。δ16.5～17.8處的碳信號(hào)，為鼠李糖碳6上的碳信號(hào)。δ20～24范圍內(nèi)出現(xiàn)的甲基信號(hào)證明存在氨基糖。在糖殘基端基碳信號(hào)區(qū)，δ103.7處的碳信號(hào)，可歸屬于α-D-Araf、(1→2,4)-α-Rhap、(1→4,6)-β-D-Manp、β-D-Xylp、(1→4)-α-GlcpA端基碳信號(hào)；δ97.9處的寬單峰碳信號(hào)，可歸屬于(1→2)-α-Rhap端基碳信號(hào)。

圖5 PNP-5的13C-NMR譜

3.8 PNP-5體外清除ABTS+·活性

表3為Vc、PNP-5對(duì)ABTS自由基的清除率數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)可以看出，PNP-5具有明顯的量效關(guān)系，呈現(xiàn)出劑量依賴性，并具有良好的自由基清除能力。在濃度為0.078125 mg/mL時(shí)，Vc、PNP-5樣品ABTS自由基清除率差別不顯著。在濃度為1.25 mg/mL時(shí)，清除率就可達(dá)到98.46%，PNP-5樣品在1.25～ 5mg/mL濃度時(shí)，ABTS自由基清除率均接近100%，并具有明顯的量效關(guān)系。通過計(jì)算IC50為0.339接近Vc的0.111，表明PNP-5對(duì)ABTS自由基的清除能力很強(qiáng)。

表3 PNP-5對(duì)ABTS自由基清除活性

3.9 PNP-5體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響

由表4可知，PNP-5在5～125 μg/mL濃度范圍內(nèi)均對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，并且隨著劑量的增加，增殖指數(shù)逐漸降低。隨著劑量的增加，增殖指數(shù)逐漸降低，當(dāng)PNP-5濃度達(dá)到125 μg/mL時(shí)，小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)為0.70±0.05，與空白組比較，具有極顯著差異(P<0.01)，此時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生非常顯著的抑制作用。

表4 不同濃度PNP-5體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)影響

4 結(jié)論

綜合IR光譜、糖組成分析、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及13C-NMR光譜等化學(xué)和波譜學(xué)方法，對(duì)PNP-5的結(jié)構(gòu)表征如下：PNP-5的單糖組成為Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal、Ara，其摩爾百分?jǐn)?shù)分別為9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%、13.7%?？芍狿NP-5亦為一個(gè)以Rha為主的酸性雜多糖。其苷鍵構(gòu)型同時(shí)包含α和β兩種。PNP-5主鏈可能以Rha為核心連接少量的Glc、Gal和Man作為主鏈，支鏈部分主要包含GlcA、GalA。其中，這些醛酸是在Rha的C-4位有連接的分支點(diǎn)，在Gal的C-6位有連接的分支點(diǎn)，此外還在Man的C-6位有連接的分支點(diǎn)。PNP-5的末端殘基為α-Araf-(1→和β-D-Xylp-(1→。體外生物活性研究結(jié)果顯示，ABTS自由基清除率IC50值為0.339mg/mL，表明PNP-5具有很強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。此外，PNP-5在5～125 μg/mL濃度時(shí)，具有明顯的體外抑制小鼠脾細(xì)胞增殖活性，且隨著劑量的增加，其抑制作用逐漸加強(qiáng)。