蘇文全，金榮，耿運(yùn)玲，杜雅薇，吳圣賢

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是慢性炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)在As斑塊的形成、破裂、糜爛、栓塞及誘發(fā)急性心腦血管事件中有著重要作用[1]，而斑塊壞死脂質(zhì)核心中的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要來源[2]。四妙勇安湯是解毒活血法的經(jīng)典方劑，現(xiàn)臨床上已廣泛用于治療As相關(guān)性疾病[3]。然而在As抗炎治療中，相對于其他炎癥因子，血清高敏-C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-responsibility protein，hs-CRP)水平的降低是指南推薦的最有效、獨(dú)立的治療目標(biāo)[4]。同時我們在臨床上亦發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯是降低hs-CRP的潛在中藥方劑，運(yùn)用2周能有效降低As患者的血清hs-CRP水平，穩(wěn)定斑塊。本實(shí)驗(yàn)以血清hs-CRP水平的有效降低為抗炎療效的基礎(chǔ)，圍繞“NF-κB/IL-1β/CRP”通路，具體探討四妙勇安湯抑制As斑塊炎癥反應(yīng)的作用及可能機(jī)制，以期為四妙勇安湯降低hs-CRP及抑制As炎癥反應(yīng)提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠，35只，體質(zhì)量20～25 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度恒定22～24 ℃，濕度50%，明暗交替，自由采食。本研究獲北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與主要試劑

辛伐他汀(舒降之，默沙東公司生產(chǎn)，批號：20080224)；四妙勇安湯由金銀花、玄參、當(dāng)歸、生甘草組成，免煎顆粒，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供；高脂飼料(21%脂肪、0.15%膽固醇)，購自京科奧協(xié)力飼料有限公司；小鼠高敏C反應(yīng)蛋白ELISA試劑盒購自美國RapidBio Lab公司(進(jìn)口分裝，批號2B900s)，IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗購自美國ZYMED公司Sp系列試劑盒。

1.3 主要儀器

4634旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(jī)、5235組織包埋機(jī)、pM-401石蠟溶蠟箱、CRM-440切片機(jī)，均為日本SAKURA公司生產(chǎn)；ICAp-9000型STAR72600酶標(biāo)儀為美國Jarrel-ASH公司生產(chǎn)，美國Image-pro plus Version 6.0(Ipp6.0)圖像分析軟件。

1.4 模型制備及分組給藥

35只ApoE-/-小鼠先給予普通飼料喂養(yǎng)7～8周，后改用高脂飼料喂養(yǎng)13周。隨機(jī)處死5只，于光鏡下確認(rèn)小鼠心臟主動脈根部AS斑塊形成。隨后將其余30只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安湯組，每組10只，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。分組后模型組按體質(zhì)量比例生理鹽水灌胃，辛伐他汀組給藥劑量為3.03 mg/(kg·d)，蒸餾水溶解灌胃。四妙勇安湯組給藥劑量為金銀花4.505 g/(kg·d)、玄參4.505 g/(kg·d)、當(dāng)歸3.003 g/(kg·d)、生甘草1.501 g/(kg·d)，蒸餾水溶解灌胃。10只C57BL/6J小鼠為正常組，全程普通飲食飼養(yǎng)，按體質(zhì)量比例生理鹽水灌胃。各組每日給藥1次，連續(xù)給藥19周后取材。

1.5 標(biāo)本采集及處理

成模后禁食12 h取材，采用腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后摘取眼球取血，離心后血清標(biāo)本存于-20 ℃冰箱。消毒皮膚，打開胸腔，暴露組織，在無菌條件下取出心臟及主動脈，并在心底部位縱向切開小口(以便固定液滲透)，生理鹽水涮洗，4%多聚甲醛固定。

1.6 血清hs-CRP水平的檢測

按照試劑盒操作說明，采用經(jīng)典酶聯(lián)免疫法測定小鼠血清hs-CRP水平。

1.7 免疫組化法檢測小鼠主動脈根部AS斑塊CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ的表達(dá)

小鼠主動脈組織包埋切片后，采用免疫組化染色兩步法檢測。60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，PBS液沖洗3 次，3%雙氧水孵育，血清封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育，鏡下觀察。蘇木素染液復(fù)染，中性樹膠封片。每組均以PBS代替一抗作為陰性對照。于光學(xué)顯微鏡下觀察切片，選取3個不同視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，定量測定斑塊內(nèi)CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ陽性表達(dá)區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈根部斑塊的脂質(zhì)核心增大,纖維帽變薄，其血清hs-CRP水平顯著升高。與模型組比較，四妙勇安湯組血清hs-CRP的水平顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組顯示降低趨勢，但無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組對ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影響

2.2 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68表達(dá)的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無CD68表達(dá)，模型組CD68表達(dá)明顯升高。與模型組比較，辛伐他汀組及四妙勇安湯組斑塊局部CD68表達(dá)有降低趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),見表2，圖1。

表2 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68表達(dá)的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68的免疫組化染色(×200)

2.3 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β表達(dá)的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無IL-1β表達(dá)，模型組IL-1β表達(dá)顯示升高。與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組的斑塊局部IL-1β表達(dá)有顯著降低(P<0.05),見表3，圖2。

表3 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β表達(dá)的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖2 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β的免疫組化染色(×200)

2.4 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊NF-κBp65表達(dá)的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊未見NF-κBp65陽性顆粒表達(dá)，模型組的NF-κBp65陽性表達(dá)明顯增加；與模型組比較，辛伐他汀組有降低趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，四妙勇安湯組NF-κBp65陽性表達(dá)有顯著降低(P<0.05),見表4，圖3。

表4 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊NF-κBp65表達(dá)的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖3 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊NF-κBp65的免疫組化染色(×200)

2.5 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ表達(dá)的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無PPAR-γ陽性表達(dá)，模型組的PPAR-γ陽性表達(dá)明顯增加；與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組PPAR-γ陽性表達(dá)有增高趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),見表5，圖4。

表5 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ表達(dá)的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖4 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ的免疫組化染色(×200)

3 討論

中醫(yī)以解毒活血法防治As已得到臨床和基礎(chǔ)研究的廣泛認(rèn)可[5]。研究表明解毒活血的方劑或單藥能通過抗炎、抗凝、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善斑塊內(nèi)部成分等途徑，延緩As發(fā)展，降低急性心腦血管事件的發(fā)生。四妙勇安湯是具有清熱解毒、活血化瘀功效的經(jīng)典方劑，方中以金銀花為君，性味甘寒，直解熱毒；玄參為臣，咸寒涼血，解毒散結(jié)；當(dāng)歸為佐，辛溫通滯，活血化瘀；甘草為使，生以解毒，調(diào)和諸藥；全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，療效顯著，成為國家中醫(yī)藥管理局首批確認(rèn)的古代經(jīng)典名方之一。同時現(xiàn)代科學(xué)對As斑塊炎癥研究的逐步深入，這有助于揭示四妙勇安湯的藥理機(jī)制。研究表明單核細(xì)胞遷入斑塊內(nèi)成為泡沫細(xì)胞是斑塊壞死脂質(zhì)核心的重要組成部分，也是誘發(fā)As炎癥反應(yīng)的主要因素[6]。存在于巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體CD68是目前最可靠的斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物[7]，能與ox-LDL大量結(jié)合而促進(jìn)巨噬源性泡沫細(xì)胞形成，并在一定程度上具有刺激巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化的作用[8]。然而單核細(xì)胞由血液遷入內(nèi)膜，發(fā)揮吞噬作用并清除沉積于內(nèi)膜的脂質(zhì)和壞死物質(zhì)的過程，是免疫系統(tǒng)保護(hù)血管的生理作用，故以抑制單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮的方法，并非理想的抗炎治療策略[9]。通過抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，尋找有效的抗炎靶點(diǎn)和信號通路，成為了有效的As抗炎方案[10]。同時抑制炎癥反應(yīng)，在一定程度上能抵抗炎性衰老，恢復(fù)巨噬細(xì)胞的生理功能，進(jìn)而促進(jìn)As斑塊的消退[11]。

血清hs-CRP水平是目前預(yù)測、診斷及風(fēng)險評估As炎癥反應(yīng)程度最可靠的指標(biāo)，亦常作為中醫(yī)As之“毒”的生物學(xué)標(biāo)志物，借以評價療效的標(biāo)準(zhǔn)[12]。且CRP直接參與As的病理過程，其與配體結(jié)合后能夠激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑和通過招募H因子調(diào)節(jié)補(bǔ)體的旁路途徑，促進(jìn)As斑塊炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊及血栓的形成[13]。在機(jī)制研究中，因CRP本身不能作為直接干預(yù)的靶點(diǎn)，調(diào)控其上游信號成為了降低CRP的主要方式[14]。目前“IL-1β/IL-6/CRP軸”是產(chǎn)生CRP的最主要途徑，然而IL-6是一個二級信號因子，直接抑制是否具有特定的抗炎作用尚不明確，且存在載脂蛋白B及LDL-C增加的不利影響，暫未能成為可靠的研究靶點(diǎn)[15]。同時Meta分析也顯示，抗炎治療中IL-6上游的IL-1β是更為理想的靶標(biāo)[16]。IL-1β不僅能有效抑制IL-6 信號，還具有不依賴IL-6，直接影響斑塊炎癥，誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用。CANTOS臨床試驗(yàn)也證實(shí)抑制IL-1β能有效降低hs-CRP水平，減少心血管事件的發(fā)生，是有效的抗炎靶點(diǎn)[17]。對于IL-1β的調(diào)節(jié)，抑制NF-κB的激活是重要的途徑[18]。研究表明通過激活I(lǐng)KK，誘發(fā)磷酸化IκB的泛素化，使得NF-κB活化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并結(jié)合于DNA鏈上的特定序列而促進(jìn)炎癥因子IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄[19]。同時國外研究已證實(shí)“NF-κB/IL-1β/CRP”是降低血清hs-CRP水平，防治As的有效通路[20]。而對于負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號途徑，目前活化的 PPARγ是一種常見方式，其激動劑能通過競爭性抑制NF-κB，而減少IL-1β、TNF-α等炎因子表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)和抗炎中同樣發(fā)揮著作用[21]。

本實(shí)驗(yàn)中，采用了高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠32周誘發(fā)As斑塊炎癥反應(yīng)的經(jīng)典模型，并以hs-CRP為研究靶點(diǎn)，對其上游可能的通路進(jìn)行了初步的探究。研究顯示模型組中血清hs-CRP水平及斑塊局部CD68、IL-1β、NF-κBp65的表達(dá)均明顯升高，表明As斑塊中有大量巨噬細(xì)胞分化，炎癥反應(yīng)明顯。與模型組比較，本實(shí)驗(yàn)中辛伐他汀及四妙勇安湯組均未能明顯降低斑塊CD68的表達(dá)(P>0.05)，表明對于減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的遷入無明顯作用，其抗炎效應(yīng)以抑制炎癥反應(yīng)為主。相比于辛伐他汀的微弱抗炎效應(yīng)(P>0.05)，四妙勇安湯能有效地降低血清hs-CRP水平(P<0.05)，具有更顯著抑制As炎癥的作用。在有效降低hs-CRP的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了具體的抗炎分子機(jī)制，結(jié)果顯示四妙勇安湯能有效抑制CRP上游的IL-1β、NF-κB炎癥因子分泌(P<0.05)，但無明顯激活PPARγ而抑制NF-κB的作用?？梢娝拿钣掳矞怯行Ы档脱録s-CRP水平的藥物，可通過抑制“NF-κB/IL-1β/CRP”通路實(shí)現(xiàn)，其效應(yīng)機(jī)制不同于PPARγ激動劑。故在此研究的基礎(chǔ)上，后期進(jìn)一步明確四妙勇安湯特有的靶向抑制NF-κB而減少IL-1β、CRP分泌的通路、作用成分及獨(dú)特抗炎效應(yīng)，可避免全面抑制NF-κB 所帶來的嚴(yán)重副作用。同時本實(shí)驗(yàn)?zāi)転榕R床開展四妙勇安湯以降低hs-CRP為靶點(diǎn)的抗炎治療提供一定依據(jù)，也能為后期探究其降低hs-CRP的可能藥理機(jī)制提供一定的參考。