張淑敏 石涌霏 王麗琨 任思穎 伍國鋒

癲癇是由神經(jīng)元異常放電引起的一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂綜合征[1]，其中顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是發(fā)病率最高的類型，極易轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幮园d癇或稱難治性癲癇[2]，表現(xiàn)為不受藥物控制的長期反復(fù)的頑固性癲癇發(fā)作[3]。除反復(fù)癇性發(fā)作外，部分患者可能出現(xiàn)執(zhí)行能力減退、學(xué)習(xí)記憶障礙、智力下降等認(rèn)知行為改變[4]，且這類患者自殘行為和自殺意念發(fā)生率也普遍較高[5]。癲癇發(fā)作的不可預(yù)測性對患者造成嚴(yán)重危害，其合并癥亦可能對癲癇患者的生存質(zhì)量產(chǎn)生更大影響[6]。因此，不僅要關(guān)注癲癇患者臨床癥狀的改善，更需重視癲癇相關(guān)合并癥的研究與治療。目前，國內(nèi)對TLE的系統(tǒng)性行為學(xué)研究較少，部分研究只對慢性期癲癇進(jìn)行探討，尚未對癲癇的耐藥性與否做出細(xì)分。該研究通過構(gòu)建TLE大鼠模型，觀察耐藥性癲癇大鼠的認(rèn)知、焦慮、抑郁等行為學(xué)改變，旨在為探究耐藥性TLE對認(rèn)知功能及焦慮、抑郁情緒障礙的影響提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級成年健康雄性SD大鼠80只，體重180～220 g，貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購入。自然光照，自由進(jìn)食水。

1.2 主要試劑及儀器包括：氯化鋰、鹽酸毛果蕓香堿(美國Sigma)，硫酸阿托品(哈爾濱三精藥業(yè))，苯巴比妥鈉(大連億德瑞公司)，苯妥英鈉(Aladdin，上海)，水合氯醛(科密歐，天津)，SuperMaze行為學(xué)分析軟件(欣軟，上海)，視頻監(jiān)控系統(tǒng)(HIKVISION，杭州)。

1.3 方法

1.3.1癲癇模型制備和分組：隨機(jī)抽取6只作為正常對照組，其余74只按文獻(xiàn)[7]方法制備癲癇模型。預(yù)先給予大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～20 h后正式造模，造模前30 min，腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg。采用小劑量多次腹腔注射毛果蕓香堿，首次劑量10 mg/kg，后每隔30 min按相同劑量追加，總量不超60 mg/kg，直至大鼠出現(xiàn)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)中Ⅳ級及以上的持續(xù)性大發(fā)作，即癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)，SE持續(xù)60 min后給予水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射終止發(fā)作。正常組給予等量生理鹽水腹腔注射。2周后大鼠癲癇進(jìn)入慢性期，出現(xiàn)慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作(spontaneously recurrent seizures，SRS)者即為慢性癲癇大鼠[8]。慢性期開始對大鼠進(jìn)行24 h視頻監(jiān)控，記錄大鼠SRS的次數(shù)、癲癇發(fā)作等級(Racine分級)及持續(xù)時間。2周結(jié)束后，出現(xiàn)SRS的大鼠給予腹腔注射苯巴比妥(25 mg/kg，1次/d)，治療14 d記錄發(fā)作情況。若治療后發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低50%以上，則判斷為對苯巴比妥治療敏感；若發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低少于50%，則繼續(xù)給予苯妥英鈉(75 mg/kg，1次/d，×14 d)治療，若發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低仍少于50%，則視為對兩種藥物耐藥，歸為耐藥大鼠，反之為藥敏大鼠[9]。

共誘發(fā)SE大鼠55只(74.32%)，SE后存活28只(50.91%)，發(fā)生SRS大鼠24只，藥物篩選過程中死亡3只，最終耐藥大鼠6只，藥敏大鼠15只。將6只耐藥大鼠納入耐藥組，從藥敏大鼠中隨機(jī)抽取6只納入藥敏組。

1.3.2曠場實驗：方形敞箱，底部等分成25個方格，中間9格為中央?yún)^(qū)。將大鼠從中心位置放入箱內(nèi)，自由活動5 min，記錄大鼠在各區(qū)域的活動情況及站立、理毛、排便等行為。

1.3.3糖水偏好實驗：每籠大鼠給予2瓶純水，自由進(jìn)食水；第2天將一瓶純水替換為1%(質(zhì)量濃度)蔗糖溶液；第3天，禁食水24 h；第4天，給每只大鼠放置等量純水和1%(質(zhì)量濃度)蔗糖溶液，隔12 h交換兩瓶位置，24 h后計算糖水偏好率。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.3.4強(qiáng)迫游泳實驗：透明圓柱形桶中注水，深度約30 cm，水溫22～26℃。將大鼠放入水中適應(yīng)訓(xùn)練15 min，訓(xùn)練完畢撈出吹干。24 h后，相同水深和溫度，將大鼠放入水中強(qiáng)迫游泳6 min，記錄5 min內(nèi)大鼠在水中的不動時間。

1.3.5Morris水迷宮實驗：圓形水池分為4個象限，逃生平臺固定于其中一個象限。前4 d，每天將大鼠依次從4個象限放入水中，記錄120 s內(nèi)站上逃生平臺所用時間(即逃避潛伏期)。若找到平臺，讓其停留15 s；未找到平臺，用木棒引導(dǎo)至平臺并停留15 s。第5天，撤除平臺，將大鼠從距原平臺最遠(yuǎn)的象限放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠穿越原平臺區(qū)域次數(shù)、進(jìn)入目標(biāo)象限(即原平臺所在象限)次數(shù)及在目標(biāo)象限的停留時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠行為學(xué)變化耐藥組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作等級及持續(xù)時間均高于藥敏組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 兩組SRS大鼠癲癇發(fā)作情況比較

2.2 各組大鼠抑郁樣行為改變與正常對照組比較，藥敏組和耐藥組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間長，糖水偏好率降低(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間長，糖水偏好率低(均P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組SRS大鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間和糖水偏好率比較

2.3 各組大鼠焦慮樣行為改變與正常對照組比較，耐藥組和藥敏組大鼠總運動距離增加，站立次數(shù)減少(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組總運動距離更長，站立次數(shù)更少(均P<0.05)。耐藥組理毛次數(shù)多于藥敏組和正常對照組(P<0.05)，而藥敏組理毛次數(shù)與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各組間進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組SRS大鼠曠場實驗焦慮樣行為比較

2.4 各組大鼠認(rèn)知功能改變Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，藥敏組第3、4天逃避潛伏期延長(均P<0.05)，而耐藥組第1～4天逃避潛伏期均增加(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組第2～4天逃避潛伏期更長(均P<0.05)。在學(xué)習(xí)記憶測試中，耐藥組同樣表現(xiàn)出較正常對照組記憶功能更差、穿越原平臺區(qū)域次數(shù)和進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)減少、停留時間縮短表現(xiàn)(均P<0.05)。結(jié)果見表4～5。

表4 各組SRS大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較

表5 各組SRS大鼠Morris水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶功能比較

3 討論

氯化鋰-毛果蕓香堿制備癲癇模型可模擬人類TLE的神經(jīng)病變與行為學(xué)改變[7]。該研究結(jié)果顯示，癲癇大鼠在曠場實驗中總運動距離增加，耐藥性癲癇大鼠自主活動性明顯亢進(jìn)，這種運動性躁動可能與癲癇發(fā)作過程中大腦谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增加導(dǎo)致神經(jīng)興奮性增強(qiáng)有關(guān)[10]；耐藥組站立次數(shù)、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)減少及理毛次數(shù)增加，反映耐藥性癲癇大鼠探索性減弱及對空曠區(qū)域的緊張情緒增加，焦慮行為增強(qiáng)；強(qiáng)迫游泳實驗中耐藥組不動時間明顯延長，表現(xiàn)出放棄掙扎的絕望行為，提示抑郁程度更重。嚙齒類動物偏愛甜食，正常大鼠在純水和糖水中優(yōu)先選擇喝糖水，而抑郁嚙齒類動物優(yōu)先選擇糖水的欲望較低。該研究結(jié)果顯示，耐藥組大鼠的糖水消耗量減少，糖水偏好率降低，提示耐藥性癲癇大鼠的快感缺失加重，抑郁樣情緒更明顯。Morris水迷宮實驗中，耐藥性癲癇大鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力較正常和藥敏大鼠明顯下降；各組大鼠逃避潛伏期均呈逐漸下降，但耐藥組大鼠下降高于其他兩組，需要更長的時間進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶，提示其認(rèn)知功能減弱；撤去平臺后，耐藥組大鼠穿過平臺區(qū)域、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)及停留時間也明顯低于正常組和藥敏組，表明耐藥性癲癇大鼠對平臺所在位置的空間記憶能力下降。空間記憶能力主要是海馬依賴的記憶形式，海馬長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)是學(xué)習(xí)記憶的生理基礎(chǔ)[11]，這種功能的受損很可能與耐藥性癲癇發(fā)展過程中海馬神經(jīng)元丟失和LTP、LTD異常改變密切相關(guān)[12]。部分研究認(rèn)為，抗癲癇藥物的使用可能會產(chǎn)生對認(rèn)知功能的負(fù)面作用，多種抗癲癇藥物聯(lián)合使用會對認(rèn)知功能產(chǎn)生更大的負(fù)面影響[13]，但也有研究表明，在中位有效劑量下，這兩種抗癲癇藥物的使用并不會對小鼠逃避潛伏期產(chǎn)生影響[14]。該研究結(jié)果顯示，耐藥組大鼠水迷宮實驗中的各指標(biāo)表現(xiàn)均差于藥敏組，一定程度上表明耐藥性癲癇可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能受損加重。耐藥性癲癇的形成機(jī)制復(fù)雜，易并發(fā)認(rèn)知障礙、情緒異常等多種合并癥，且對情緒、認(rèn)知功能的損傷更重，這些合并癥與耐藥性癲癇之間可能具有雙向的生物學(xué)聯(lián)系或某些共同的因果機(jī)制，確切結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，慢性癲癇會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能減退及產(chǎn)生焦慮、抑郁情緒等行為學(xué)改變，耐藥性癲癇可使認(rèn)知功能受損、焦慮、抑郁程度加重。提高耐藥性癲癇合并癥的認(rèn)識及深入研究耐藥性癲癇與其合并癥的共患病機(jī)制具有一定重要意義。