沈新月 石鄭浩 任安艷 葛汝麗 范雪麗

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的與免疫相關(guān)的慢性炎性脫髓鞘疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與感染、自身免疫反應(yīng)、遺傳與環(huán)境因素有關(guān)。既往研究認(rèn)為MS是自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]，但越來(lái)越多研究表明體液免疫在MS疾病的形成中不可或缺[2]。濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)是一種重要的輔助B細(xì)胞的CD4+Th細(xì)胞亞型[3]，其定位于生發(fā)中心(germinal center，GC)，分泌白細(xì)胞介素21(interleukin21，IL-21)，表達(dá)程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)、可誘導(dǎo)的共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)、轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴6(B cell lymphoma 6，Bcl-6)等[4]。Tfh細(xì)胞參與體液免疫反應(yīng)，對(duì)GC形成、B細(xì)胞在GC親和力的成熟、高親和力抗體和記憶性B細(xì)胞的產(chǎn)生至關(guān)重要[5]。Tfh細(xì)胞功能失調(diào)可導(dǎo)致自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤等多種疾病[6]。該研究通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠腦、脊髓PD-1、ICOS、IL-21的表達(dá)情況，探討Tfh細(xì)胞相關(guān)作用分子在MS/EAE中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物選擇SPF級(jí)6～8周齡C57BL/6雌性小鼠40只，體重(18±2)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。置SPF級(jí)、恒溫(20～24℃)、恒濕(40%～70%)環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。所有操作均符合濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和EAE模型組，各20只。剔除死亡及造模失敗小鼠，最終對(duì)照組18只(死亡2只，余18只未出現(xiàn)癥狀)、EAE模型組17只(死亡2只，1只未出現(xiàn)明顯癥狀)入組。

1.2 主要試劑及儀器髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55肽段購(gòu)自美國(guó)GenScript公司，完全福氏佐劑(FAC)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，滅活結(jié)核分枝桿菌(H37Ra)購(gòu)自美國(guó)BD Difco公司，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司，HE染色試劑盒購(gòu)自Solarbio公司，PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司，IL-21、PD-1、ICOS抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1EAE模型制備：配制MOG35-55肽段溶液(溶于PBS，濃度為2 mg/mL)、結(jié)核分枝桿菌溶液(加至FAC中，濃度為8 mg/mL)、PTX溶液(溶于PBS，濃度為300 ng/mL)。將MOG35-55肽段溶液與結(jié)核分枝桿菌溶液等比例混合，充分乳化MOG抗原，給予小鼠200 μg皮下多點(diǎn)注射，并于注射后及48 h腹腔注射PTX溶液。對(duì)照組以等量PBS代替MOG35-55肽段溶液，余操作步驟同模型組。

1.3.2EAE小鼠評(píng)分：隨機(jī)取對(duì)照組小鼠6只，EAE模型組5只，于主動(dòng)免疫后的第1天至第29天，每天清晨同一時(shí)間對(duì)小鼠稱重并進(jìn)行臨床表現(xiàn)評(píng)分。EAE小鼠評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常；1分，尾部無(wú)力，不能抬起或步態(tài)蹣跚；1.5分，尾部無(wú)力伴蹣跚步態(tài)；2分，除尾部無(wú)力外，可見(jiàn)單后肢癱或雙后肢不全癱；2.5分，小鼠單后肢全癱伴對(duì)側(cè)后肢不全癱；3分，雙后肢全癱；4分，雙后肢癱且伴前肢單肢或雙肢受累；5分，死亡。

1.3.3組織切片的制備：主動(dòng)免疫后第21天(發(fā)病高峰期)，隨機(jī)取EAE模型組及對(duì)照組小鼠各6只，將小鼠深度麻醉，用恒流泵灌流，觀察小鼠肝臟顏色，變至灰白色時(shí)改用4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注，待小鼠全身僵硬、肝臟質(zhì)地堅(jiān)韌，停止灌流。立即取其腦、脊髓組織，進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片備用，片厚4～6 μm，用于HE染色和免疫組化檢測(cè)。

1.3.4HE染色：依照HE染色盒試劑說(shuō)明書(shū)將腦、脊髓石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化、染色、脫水、透明、中性樹(shù)膠封固，置光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦、脊髓組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并采集圖片。

1.3.5免疫組化：將上述制備好的腦、脊髓石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化，高壓修復(fù)后將玻片浸泡至3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液內(nèi)，避光浸泡15 min，清洗玻片。用免疫組化筆劃定組織范圍，玻片上滴加山羊血清，置37℃溫箱內(nèi)封閉30 min，清洗玻片。滴加Ⅰ、Ⅱ抗，置37℃溫箱內(nèi)分別放置2 h、30 min，清洗玻片。滴加DAB顯色盒中的試劑至玻片顯色，經(jīng)染色、分化、脫水、封片等步驟，置鏡下觀察ICOS、IL-21、PD-1的表達(dá)情況。顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色，腦、脊髓組織ICOS、IL-21、PD-1陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，采用IPP6.0軟件定量分析其陽(yáng)性染色相應(yīng)累積光密度值(IOD)。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：將發(fā)病高峰期(造模后第21天)的剩余EAE小鼠6只及對(duì)照組6只斷頭處死，置冰上快速取腦組織。根據(jù)PCR試劑盒(含GAPDH內(nèi)參、PD-1、ICOS、IL-21引物)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等步驟，采用2-△△T法定量分析PD-1、ICOS、IL-21 mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，圖2～5，表1～2同；與EAE模型組比較，aP<0.05圖1 兩組小鼠主動(dòng)免疫后不同時(shí)間體重變化

2 結(jié)果

2.1 體重變化結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組小鼠隨時(shí)間延長(zhǎng)體重增加(F=89.833，P=0.000)；EAE模型組免疫后不同時(shí)間點(diǎn)間體重變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=174.159，P=0.000)，自主動(dòng)免疫第13天時(shí)體重下降，發(fā)病高峰(主動(dòng)免疫后第21天下降最明顯，之后體重逐漸增加(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，EAE模型組小鼠主動(dòng)免疫后1～3 d體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，從第4天開(kāi)始其體重降低(均P<0.05)。

2.2 EAE小鼠行為學(xué)評(píng)分EAE模型組小鼠免疫后不同天數(shù)間的癥狀評(píng)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=80.860，P=0.000)；對(duì)照組小鼠不同天數(shù)之間的評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0，P=1)。EAE模型組小鼠于主動(dòng)免疫后第13天開(kāi)始發(fā)病，第21天癥狀評(píng)分達(dá)高峰，隨后癥狀逐漸好轉(zhuǎn)(均P<0.05)。對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)任何癥狀，評(píng)分均為0分。EAE模型組主動(dòng)免疫后 1～12 d行為學(xué)評(píng)分與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05)，第13～29天行為學(xué)評(píng)分高于對(duì)照組(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05圖2 各組小鼠不同時(shí)間臨床癥狀評(píng)分變化

2.3 病理學(xué)改變對(duì)照組小鼠腦、脊髓組織中無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；EAE模型組小鼠腦、脊髓組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)袖套樣改變。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 免疫組化EAE模型組小鼠腦、脊髓組織中IL-21、ICOS表達(dá)較對(duì)照組增高，而PD-1表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖4、圖5。

圖4 兩組小鼠腦組織IL-21、ICOS及PD-1表達(dá)(免疫組化，×20)

圖5 兩組小鼠脊髓IL-21、ICOS及PD-1表達(dá)(免疫組化，×20)

表1 兩組小鼠腦和脊髓組織ICOS、IL-21、PD-1表達(dá)累積光密度值比較

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與對(duì)照組比較，EAE模型組腦組織PD-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，而ICOS、IL-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量增高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠腦組織PD-1、ICOS、IL-21 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

MS是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的與免疫相關(guān)的慢性炎性脫髓鞘疾病，表現(xiàn)為脫髓鞘、軸突損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[7]。該研究Tfh細(xì)胞在體液免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能夠輔助B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞。Tfh細(xì)胞表達(dá)的ICOS、PD-1及其分泌的IL-21，對(duì)Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、分化和存活至關(guān)重要。Tfh細(xì)胞及其相關(guān)分子的異?？蓪?dǎo)致致病性自身抗體的產(chǎn)生，繼而引發(fā)自身免疫疾病。Rikke等[9]研究表明，MS患者中的Tfh細(xì)胞活性增強(qiáng)。作者團(tuán)隊(duì)既往研究表明MS、NMOSD患者外周循環(huán)中的記憶性Tfh細(xì)胞數(shù)量增多[10]，可能參與疾病的發(fā)病機(jī)制。

該研究結(jié)果顯示EAE小鼠腦、脊髓組織Tfh細(xì)胞表達(dá)的ICOS水平增高。這與Guo等[11]研究結(jié)果相一致。Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠脊髓組織ICOS水平表達(dá)增高，且在發(fā)病高峰期達(dá)高峰。推測(cè)ICOS水平升高可能對(duì)MS/EAE的發(fā)病有促進(jìn)作用。Tfh細(xì)胞表達(dá)的ICOS與其配體(ICOSL)結(jié)合，可促進(jìn)Tfh細(xì)胞和GC的形成，阻斷ICOS-ICOSL通路可能抑制Tfh細(xì)胞的功能，因此抗ICOS/ICOSL單抗治療可能成為難治性或嚴(yán)重自身免疫性疾病的潛在治療辦法[12]。

該研究結(jié)果顯示EAE小鼠腦、脊髓組織IL-21表達(dá)水平較對(duì)照組高。IL-21在GC B 細(xì)胞的增殖、生存和分化以及Tfh細(xì)胞的生存中發(fā)揮主要作用[13]，也是最有效促進(jìn)漿細(xì)胞分化的細(xì)胞因子[14]。在MS患者的活動(dòng)性病灶中，分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞可進(jìn)一步促進(jìn)Tfh細(xì)胞的活化[15]。Gharibi等[16]亦報(bào)道了MS患者炎性細(xì)胞浸潤(rùn)病變部位的淋巴細(xì)胞中IL-21呈高表達(dá)。推測(cè)IL-21水平的升高可能與EAE/MS的嚴(yán)重程度和進(jìn)展呈正相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，破壞BALB/c小鼠PD-1的編碼基因可致自身免疫性心臟??；敲除PD-1的C57BL/6小鼠可出現(xiàn)漸進(jìn)性關(guān)節(jié)炎、狼瘡樣腎小球腎炎以及急性自身免疫性糖尿病[17-19]。Haile等[20]研究表明PD-1缺陷的EAE小鼠癥狀更為嚴(yán)重。該研究結(jié)果顯示，EAE小鼠腦、脊髓組織PD-1的表達(dá)水平較對(duì)照組小鼠降低。因此作者推測(cè)，PD-1在MS/EAE的發(fā)病中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并可能成為治療靶點(diǎn)。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，EAE模型組小鼠腦、脊髓組織IL-21、ICOS及其mRNA表達(dá)較對(duì)照組增高，而PD-1及其mRNA表達(dá)低，提示上述分子可能參與了EAE的發(fā)病，并可能成為治療疾病的新靶點(diǎn)。有關(guān)Tfh細(xì)胞及其相關(guān)作用分子在MS/EAE中的確切作用尚需進(jìn)一步研究，為臨床治療提供更充分的依據(jù)。