陳付菊，多杰當(dāng)智，付生云，馬 敏，趙宇田，常 蘭

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海省裸鯉救助中心，西寧 81003)

水體中溶解氧(DO)作為水生動物有氧代謝的重要限制因子，影響水生動物的生長、發(fā)育、代謝和行為、抗氧化等生命活動[1-3]。然而水體的DO含量由于物理、化學(xué)或生物等因素的影響而呈現(xiàn)出一定的波動性(4.0～7.4 mg/L)[4]。魚類暴露在低氧環(huán)境后，因活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生，會造成缺氧應(yīng)激損傷。為此，魚類在漫長的進化過程中形成了獨特的適應(yīng)策略來應(yīng)對不同的溶解氧水環(huán)境。

線粒體是細胞利用氧并產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，也是細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的重要細胞器[5]。在生理狀態(tài)下，因生物體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng)如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等，這些酶在清除過量ROS的過程中發(fā)揮重要的作用[6]。當(dāng)線粒體受到損傷時，線粒體呼吸鏈電子傳遞功能異常，進而使線粒體產(chǎn)生過量的ROS[7]，從而影響抗氧化系統(tǒng)與生物膜的脂質(zhì)過氧化，進而誘導(dǎo)機體組織氧化應(yīng)激損傷[8]。

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)俗稱“湟魚”，屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科，是青海湖中唯一的經(jīng)濟魚類，屬國家二類保護珍貴魚類。作為青藏高原上代表性的土著魚類，長期生活在高海拔的低氧環(huán)境中(海拔3 200 m)。正如其他裂腹魚亞科魚類一樣，青海湖裸鯉對水體環(huán)境DO波動(3.0～8.5 mg/L)表現(xiàn)出極強的習(xí)服特性。以往對青海湖裸鯉的研究多集中于繁殖特性[9-10]、鹽度適應(yīng)特性[11-12]及生物學(xué)特性[13]等方面，僅見低氧脅迫對青海湖裸鯉鰓[14]和體腎組織結(jié)構(gòu)的影響。肝作為魚體內(nèi)最大的腺體，在能量代謝、解毒、凝血等方面起著非常重要的作用[15]。肝臟受損往往會影響機體內(nèi)代謝、解毒、排泄等生命活動的正常進行[16]。陳世喜等[17]和楊明等[18]發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫使卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)和日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)肝組織結(jié)構(gòu)損傷，提示肝組織對低氧敏感，但低氧對青海湖裸鯉肝組織結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性影響未見有報道。因此，本研究以青海湖裸鯉肝組織為研究對象，分析不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織結(jié)構(gòu)、線粒體超微結(jié)構(gòu)及抗氧化酶活性的影響，以期探討青海湖裸鯉的低氧適應(yīng)能力，為青海湖裸鯉的資源保護提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

青海湖裸鯉120尾取自青海湖黑馬河，體長(24.11±0.12) cm，體重(97.68±0.12) g，正式實驗前在實驗室暫養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器

丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1)、過氧化氫(H2O2)測定試劑盒(A064-1)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3)、谷胱甘肽過氧化物(GPX)測定試劑盒(A005-1)和總蛋白測定試劑盒(A045-2)均購自南京建成生物工程研究所；組織線粒體分離試劑盒(C3606)、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006)、Bradford蛋白濃度試劑盒(P0006C)、蘇木精-伊紅染色試劑盒(C0105M)、二甲苯、乙醇均購自中國碧云天生物公司；詹納斯綠B(J8020)購自北京索萊寶科技有限公司。

石蠟組織切片機(型號為LEICA RM2235)、生物組織包埋機和冷凍臺(型號為BMJ-1B)、展片機(型號為ZPJ-1A)、烤片機(型號為KPJ-1A)，均購自天津天利航空機電有限公司；電子天平(型號為BSA 1245 sartorius)，購自金壇市富華儀器有限公司；顯微鏡(型號為NIKON H600 L)，購于北京瑞科中儀科技有限公司；多功能酶標儀(SpectraMax M5)，購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗設(shè)計

暫養(yǎng)時將120尾青海湖裸鯉隨機分配在3個500 L的塑料桶中，每日投喂人工配合餌料1次(青海湖裸鯉救助中心提供)，每日9:00和17:00分別使用DO為(8.4±0.1) mg/L曝氣自來水換水一次，每次換水量約為養(yǎng)殖水體的1/4。暫養(yǎng)期間采用空氣泵連續(xù)增氧，使水體DO維持在(8.4±0.1) mg/L，即常氧組，水溫為(14.5±0.7) ℃，正式實驗前1天停止進食。

實驗設(shè)重度低氧組、中度低氧組和常氧組，每組設(shè)置3個平行，將暫養(yǎng)的實驗魚隨機分至裝有120 L曝氣自來水的頂部覆蓋塑料膜的9個自制水族箱中，每個低氧組水族箱中15尾實驗魚，每個常氧組水族箱中10尾實驗魚。隨后往低氧組水族箱中注入氮氣，重度低氧組在1 h內(nèi)將水體DO降至(0.7±0.1) mg/L；中度低氧組在1 h內(nèi)將水體DO降至(3.0±0.1) mg/L。維持低氧處理24 h，并分別在8 h和24 h時采集樣本。低氧脅迫期間水溫為(14.5±0.7) ℃，調(diào)節(jié)氮氣和空氣的注入流量來控制水中的DO水平，并利用AZ8402溶解氧測定儀定期監(jiān)控水體DO濃度。

1.4 樣品采集

在低氧脅迫8 h時將裸鯉用MS-222溶液麻醉，迅速解剖后取肝臟，用生理鹽水沖洗，提取線粒體并檢測膜電位(8 尾/組)；4%多聚甲醛緩沖液(pH=7.4)固定用于肝組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察(4 尾/組)；2.5%戊二醛固定用于肝組織超微結(jié)構(gòu)的觀察(4 尾/組)；液氮儲存用于肝組織酶活性的檢測(8 尾/組)。

1.5 肝組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察

將4%多聚甲醛固定液固定24 h后的肝組織，經(jīng)50%、75%、85%、95%、100%的梯度酒精逐級脫水2 h后，二甲苯透明30 min，浸蠟、包埋，用切片機連續(xù)切片(厚度6 μm)，展片機展片，烤片機烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，蘇木精-伊紅(H·E)染色，鹽酸酒精分色，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 肝組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察

將2.5%戊二醛固定的肝組織，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次，每次5 min；1%四氧化鋨固定1 h，30%、50%、70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水15 min，100%環(huán)氧丙烷包埋3 次，每次5 min； 環(huán)氧丙烷：包埋液(2∶1)室溫2 h，環(huán)氧丙烷:包埋液(1∶2)室溫3 h， 純包埋液室溫過夜。然后用牙簽挑出樣品，于包埋板上包埋； 包埋板放于60 ℃烘箱 48 h，待樹脂完全聚合后，取出包埋塊備用； 樹脂塊于超薄切片機半薄切片定位，根據(jù)定位情況進行修塊后，對所需位置進行超薄切片，切片厚度70 nm，銅網(wǎng)撈片；3%醋酸鈾飽和酒精溶液染色8 min；70%酒精清洗3次，超純水清洗3次；2.7%枸櫞酸鉛溶液染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干后透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 肝組織抗氧化酶活性的測定

將-80 ℃保存的肝組織在冰上解凍，稱取適量的樣品，按照質(zhì)量∶體積=1∶9向樣品中加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰上進行勻漿。隨后將勻漿液用冷凍離心機在4 ℃條件下離心10 min(2 500 r/min)，取上清液，檢測樣品總蛋白濃度，-80 ℃暫存待用。

樣品總蛋白濃度、SOD、T-AOC、GPX活性及MDA、H2O2含量的測定均按試劑盒說明書進行操作。

1.8 肝組織線粒體分離和線粒體膜電位的檢測

取新鮮的肝組織約90 mg，放入預(yù)冷的離心管中，并用預(yù)冷的小剪刀剪碎，隨后向離心管內(nèi)加入900 μL預(yù)冷的分離液A，用預(yù)冷的玻璃勻漿器手動上下勻漿10次，用冷凍離心機在4 ℃條件下離心5 min(600 r/min)，取上清液，用冷凍離心機在4 ℃條件下離心10 min(11 000 r/min)，小心棄去上清液，加入預(yù)冷的線粒體儲存液，混勻后用詹納斯綠B檢測線粒體活性，并測定蛋白濃度。線粒體膜電位的檢測按試劑盒說明書進行操作。

1.9 統(tǒng)計分析

結(jié)果均采用平均值±標準誤(mean±SE)表示，采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，同一時間點不同DO濃度組間及同一DO濃度組不同時間點間的數(shù)據(jù)用Duncan檢驗多重比較，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下青海湖裸鯉常氧組肝細胞胞質(zhì)均勻，細胞核清晰，位于肝細胞中央，肝血竇狹窄，內(nèi)有紅細胞，肝細胞內(nèi)可見大小不一的脂肪滴。常氧8 h和24 h間肝組織顯微結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖1-A，1-D)。中度低氧脅迫8 h和24 h時肝血竇擴張，血竇內(nèi)紅細胞數(shù)量增多(圖1-B，1-E)。重度低氧脅迫8 h時肝血竇擴張明顯，血竇內(nèi)紅細胞數(shù)量增多，肝細胞出現(xiàn)空泡(圖1-C)；重度低氧脅迫24 h時肝血竇擴張，血竇內(nèi)紅細胞數(shù)量增多，肝細胞空泡變性加劇(圖1-F)。

圖1 低氧脅迫后青海湖裸鯉肝組織的顯微結(jié)構(gòu)(蘇木精-伊紅染色)

2.2 不同DO水平對青海湖裸鯉肝線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下青海湖裸鯉常氧組肝線粒體多呈圓形，有的則近橢圓狀，數(shù)量多，內(nèi)有嵴，線粒體膜完整，電子密度高。常氧8 h和24 h間肝線粒體超微結(jié)構(gòu)無差異(圖2-A，2-D)。中度低氧脅迫8 h時線粒體多呈圓形和橢圓形，線粒體形態(tài)正常，線粒體膜完整(圖2-B)；中度低氧脅迫24 h時除圓形線粒體外，觀察到桿狀線粒體，線粒體膜完整，線粒體間出現(xiàn)少量空泡(圖2-E)。重度低氧脅迫8 h時線粒體以橢圓形和桿狀居多，線粒體膜完整，線粒體間空泡明顯(圖2-C)；重度低氧脅迫24 h時線粒體多呈圓形、橢圓形，偶見桿狀線粒體，線粒體數(shù)量減少，部分線粒體出現(xiàn)空泡化，線粒體間空泡化嚴重(圖2-F)。

圖2 低氧脅迫后青海湖裸鯉肝組織超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡)

2.3 不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織線粒體膜電位的影響

如圖3所示，中度低氧脅迫8 h和24 h時肝組織線粒體綠色熒光與紅色熒光強度比值降低，但中度低氧8 h和中度低氧24 h間差異不顯著。重度低氧8 h和24 h時肝組織線粒體綠色熒光與紅色熒光強度比值增加，但重度低氧8 h和重度低氧24 h間差異不顯著，表明中度低氧脅迫使肝組織線粒體膜電位升高，重度低氧脅迫使肝組織線粒體膜電位降低。

圖3 不同DO水平下青海湖裸鯉肝線粒體膜電位的變化

2.4 不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織氧化和抗氧化指標的影響

青海湖裸鯉肝組織氧化和抗氧化酶活性結(jié)果見圖4。中度和重度低氧脅迫使青海湖裸鯉肝組織H2O2含量持續(xù)增加，但中度低氧8 h時H2O2含量與常氧組間差異不顯著，且中度低氧8 h和中度低氧24 h間及重度低氧8 h和重度低氧24 h間H2O2含量差異不顯著。中度低氧使肝組織MDA含量呈先增加后降低的趨勢，但與常氧組差異不顯著；重度低氧脅迫使肝組織MDA含量持續(xù)增加，但重度低氧8 h和重度低氧24 h間差異不顯著。

圖4 不同DO水平下青海湖裸鯉肝組織H2O2(A)、MDA(B)、GPX(C)、SOD(D)和T-AOC(E)活性的變化

中度和重度低氧使肝組織GPX活性持續(xù)增加，但中度低氧8 h和中度低氧24 h間及重度低氧8 h和重度低氧24 h間GPX差異不顯著。中度和重度低氧使肝組織SOD活性呈增加趨勢，但與常氧組間差異不顯著。中度低氧使肝組織T-AOC持續(xù)增加，但中度低氧8 h和中度低氧24 h間差異不顯著，重度低氧使肝組織T-AOC呈先增加后降低趨勢，但均高于常氧組。

3 討論

3.1 不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

陳世喜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，急性和慢性低氧(1.55±0.20 mg/L)使卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)肝細胞出現(xiàn)空泡、局部壞死、肝線粒體數(shù)量減少等變化。馬毅等[20]對大鼠(Rattusnorvegicus)無心跳供體熱缺血損傷后肝組織超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞的空泡變性與線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和糖原的吸收有關(guān)。楊明等[18]研究顯示，急性低氧(2.0±0.2) mg/L脅迫使日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)肝組織結(jié)構(gòu)損傷。本研究中，中度低氧對肝組織顯微結(jié)構(gòu)影響不明顯。重度低氧使肝細胞出現(xiàn)空泡化，且隨低氧脅迫時間的延長空泡化加劇，表明重度低氧造成肝組織結(jié)構(gòu)損傷。區(qū)又君等[21]研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧脅迫使肝空泡體積增大與肝糖原的分解有關(guān)，且生境中低氧會造成魚體組織的缺氧，影響魚體正常的能量代謝。齊明等[22]研究顯示，低氧脅迫使青田田魚(Cyprinuscarpiovarqingtianensis)肝胰臟能量代謝方式發(fā)生改變。推測重度低氧脅迫后青海湖裸鯉肝組織空泡化可能與其能量代謝發(fā)生變化有關(guān)。

陳德舉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧(1.55±0.20) mg/L脅迫下吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)血液紅細胞數(shù)量顯著增加。陳世喜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低氧(1.55±0.10) mg/L脅迫下卵形鯧鲹鰓小片中紅細胞數(shù)量增加。本研究結(jié)果與之一致，低氧脅迫后肝血竇中紅細胞數(shù)量也增加，這可能與肝組織在面對低氧環(huán)境時需要通過增加紅細胞數(shù)量來獲得更強的攝氧能力，從而緩解外界水體環(huán)境低氧造成裸鯉肝組織的缺氧有關(guān)。

3.2 不同DO水平對青海湖裸鯉肝線粒體超微結(jié)構(gòu)和膜電位的影響

線粒體是對低氧反應(yīng)最為敏感的細胞器，而線粒體膜電位對維持線粒體正常功能起著關(guān)鍵作用，線粒體膜電位降低是細胞凋亡發(fā)生的最早事件[24]。薄海等[25]研究顯示，慢性低氧抑制大鼠線粒體的合成，導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少。魏琳等[26]研究發(fā)現(xiàn)，低氧導(dǎo)致凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)線粒體結(jié)構(gòu)腫脹變性、外膜扭曲腫脹、內(nèi)嵴溶解，空泡化。劉靜等[27]研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧暴露使大鼠腦海馬線粒體膜電位和ATP合成活力降低，而常氧環(huán)境運動預(yù)適應(yīng)使線粒體膜電位和ATP合成活力顯著升高，表明低氧脅迫后機體線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生適應(yīng)性變化。

本研究中，中度低氧對線粒體結(jié)構(gòu)影響不明顯，但中度低氧使線粒體膜電位升高，這與劉靜等[27]的研究結(jié)果相一致。推測中度低氧脅迫后青海湖裸鯉肝線粒體可能通過增強線粒體呼吸功能來提高肝組織對低氧脅迫的抵抗力，重度低氧24 h時青海湖裸鯉肝線粒體數(shù)量下降，部分線粒體空泡化，且膜電位降低，表明隨低氧脅迫程度的加重和低氧時間的延長，肝線粒體氧化應(yīng)激損傷，從而使線粒體空泡化，最終導(dǎo)致線粒體膜完整性及其功能損傷。

3.3 不同DO水平對青海湖裸鯉肝組織氧化應(yīng)激的影響

氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS含量增加，但因細胞內(nèi)ROS壽命短暫，故通常通過檢測H2O2含量來間接反映細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫使青海湖裸鯉肝組織H2O2含量顯著增加，這一結(jié)果與低氧脅迫后日本沼蝦肌肉和鰓組織中H2O2含量顯著升高的結(jié)果相一致[18]，表明低氧脅迫使青海湖裸鯉肝組織產(chǎn)生大量的ROS。

MDA是ROS攻擊生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量能夠間接地反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。常志成等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低氧(1.56±0.24) mg/L脅迫降低花鱸(Lateolabraxmaculatus)幼魚肝組織MDA含量；陳世喜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，急性和慢性低氧(1.55±0.20) mg/L脅迫使卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)幼魚肝臟組織MDA含量增加。本研究中，中度低氧脅迫對青海湖裸鯉肝組織MDA含量沒有影響，表明在中度低氧脅迫后，肝組織內(nèi)雖產(chǎn)生大量的ROS，但體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)能夠及時清除ROS，從而對肝組織未造成氧化損傷，這與中度低氧并未造成青海湖裸鯉肝組織結(jié)構(gòu)損傷的結(jié)果相吻合。重度低氧使青海湖裸鯉肝組織MDA含量增加，表明在重度低氧脅迫后，肝組織內(nèi)產(chǎn)生的ROS超出了抗氧化酶的清除能力，導(dǎo)致過量的ROS未能及時被清除，從而使肝組織處于脂質(zhì)過氧化狀態(tài)，產(chǎn)生大量MDA，隨著低氧脅迫時間的延長，造成肝組織氧化應(yīng)激損傷，這也間接證實重度低氧導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)損傷。

3.4 不同DO水平對青海湖裸鯉肝臟組織抗氧化能力的影響

ROS累積易造成氧化應(yīng)激損傷，但魚體內(nèi)存在SOD、GPX等能夠清除過量ROS的抗氧化酶，從而保護細胞免受ROS損傷。張倩等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫使鯽魚(Carassiusauratus)血清、肌肉和鰓組織GPX和T-AOC顯著增加。本研究中，肝組織T-AOC和GSH在低氧脅迫后顯著增加，表明低氧脅迫使青海湖裸鯉肝組織始終處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，T-AOC和GSH持續(xù)清除肝組織內(nèi)因低氧脅迫而產(chǎn)生的過量ROS，保護機體免受ROS自由基損傷。本研究中，低氧脅迫后肝組織中SOD活性與常氧組差異不顯著。陳世喜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹幼魚肝組織SOD活性在急性低氧脅迫中持續(xù)增加，3 h時最大，后逐漸降低，8 h和24 h時降至正常水平，14 d時又顯著高于對照組，可能SOD主要參與慢性低氧脅迫中機體的抗氧化水平。

綜上所述，不同溶氧水平對青海湖裸鯉肝組織結(jié)構(gòu)、線粒體超微結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性產(chǎn)生不同的影響。中度低氧(3.0±0.1) mg/L對肝組織結(jié)構(gòu)和線粒體未造成損傷，隨著氧濃度的下降，重度低氧(0.7±0.1) mg/L對肝組織結(jié)構(gòu)和線粒體損傷較為嚴重，且低氧脅迫后肝組織通過調(diào)整相關(guān)抗氧化酶活性來適應(yīng)急性溶氧變化。本試驗結(jié)果為魚類低氧脅迫研究提供基礎(chǔ)資料，也為青海湖裸鯉人工增殖放流及運輸提供理論依據(jù)。