王 恩，陳玉青，萬(wàn)國(guó)盛，林 萍，蘭公劍

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

蘋(píng)果酸舒尼替尼是美國(guó)輝瑞制藥研制的一種多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，臨床上用于治療不能手術(shù)的晚期腎細(xì)胞癌、甲磺酸伊馬替尼治療失敗或不能耐受的胃腸間質(zhì)瘤，以及不可切除及轉(zhuǎn)移性高分化進(jìn)展期的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等。2018年蘋(píng)果酸舒尼替尼進(jìn)入國(guó)家醫(yī)保目錄，未來(lái)隨著醫(yī)保放量，蘋(píng)果酸舒尼替尼在國(guó)內(nèi)的市場(chǎng)潛力會(huì)進(jìn)一步得到釋放。

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮是蘋(píng)果酸舒尼替尼的合成起始物料[1-2]，目前尚未有產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法的報(bào)道[3-4]，因此本研究采用HPLC，建立了蘋(píng)果酸舒尼替尼合成起始物料5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，以期為這一產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供新的方法。

1 儀器與藥劑

1.1 儀器

Thermo U3000高效液相色譜儀，Mettler XS105電子分析天平。

1.2 藥劑

供試品（上海瀚鴻，批號(hào)BH-B71291-180201），雜質(zhì)A對(duì)照品（南京華威，批號(hào)17HW34022a-2），雜質(zhì)B對(duì)照品（南京華威，批號(hào)17HW34022a-3）。甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鉀均為色譜級(jí)，水為自制超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）；含0.04%辛烷磺酸鈉的0.013mol·L-1磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.1）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.2mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm，進(jìn)樣量5μL。

表1 梯度洗脫設(shè)計(jì)

2.2 溶液的制備

供試品溶液：精密稱(chēng)定10mg的5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：分別取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮及雜質(zhì)對(duì)照品A、B適量，用甲醇溶解并定量稀釋?zhuān)渲瞥擅?mL中約含5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮1.0mg、雜質(zhì)10μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專(zhuān)屬性

2.3.1 系統(tǒng)適用性

精密量取系統(tǒng)適用性溶液與空白溶劑各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果表明，溶劑對(duì)主峰和雜質(zhì)峰無(wú)干擾，各雜質(zhì)峰與主峰之間均能有效分離。

圖1 空白溶劑圖譜

圖2 系統(tǒng)適用性溶液圖譜

2.3.2 破壞實(shí)驗(yàn)

將5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮分別經(jīng)過(guò)酸（0.1mol·L-1鹽酸溶液）、堿（0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液）、氧化（0.5%H2O2）、高溫（105℃）和光照（4500Lx光強(qiáng)）的破壞，取破壞后的溶液5μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮在酸、堿、氧化、高溫和光照等破壞條件下，有降解雜質(zhì)產(chǎn)生，降解雜質(zhì)峰與主峰均能有效分離。

2.4 線性關(guān)系

分別取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮與雜質(zhì)對(duì)照品A、B適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，制成每1mL約含1.0mg溶質(zhì)的溶液，作為貯備液。取上述貯備液各適量，依次用溶劑稀釋?zhuān)瞥擅?mL中分別含0.5～30μg溶質(zhì)的系列濃度的混合溶液。精密量取上述系列濃度溶液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮與雜質(zhì)在質(zhì)量濃度0.5～30μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表2 結(jié)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 校正因子

采用線性方程的斜率計(jì)算雜質(zhì)A、B的校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，雜質(zhì)B的校正因子為5.2，偏離自身對(duì)照法的校正因子使用范圍（0.2～5.0），在有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定中，應(yīng)采用外標(biāo)法計(jì)算其含量。雜質(zhì)A的校正因子為1.4，可使用自身對(duì)照法計(jì)算該雜質(zhì)含量。其他單個(gè)雜質(zhì)按校正因子為1.0，采用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量。

表3 雜質(zhì)A、B的校正因子

2.6 檢測(cè)限與定量限

取對(duì)照品貯備液適量，精密稱(chēng)定，配成一系列低濃度溶液，分別精密量取溶液5μL進(jìn)樣分析。信噪比約為3時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品量為檢測(cè)限。5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的檢測(cè)限分別為0.61ng、0.48ng、0.16ng。信噪比約為10時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品量為定量限，5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的定量限分別為2.1ng、1.6ng、0.53ng。

2.7 回收率

稱(chēng)取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，分別定量加入雜質(zhì)對(duì)照品A、B，配制成含雜質(zhì)限度分別為50%、100%、150%的加標(biāo)供試品溶液。取上述溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算雜質(zhì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，雜質(zhì)回收率的考察結(jié)果符合要求，方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 雜質(zhì)回收率

2.8 溶液穩(wěn)定性

按照2.2的方法制備供試品溶液，分別于0、2、5、7、9、12h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)下，雜質(zhì)A峰面積的RSD為0.6%（n=6），雜質(zhì)B均未檢出，所有雜質(zhì)峰面積總和的RSD為4.5%（n=6），無(wú)新增雜質(zhì)產(chǎn)生，說(shuō)明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性

適當(dāng)調(diào)整色譜參數(shù)（柱溫30℃±5℃，流速1.2 mL·min-1±0.1 mL·min-1，流 動(dòng) 相B相 比 例5%±1%，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm±2nm），考察供試品溶液中的主峰與雜質(zhì)峰的分離情況。結(jié)果表明，主峰與相鄰雜質(zhì)峰間的分離度均大于1.5，供試品中雜質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明本方法的耐用性良好。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

在5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的有關(guān)物質(zhì)的探究過(guò)程中，對(duì)比了流動(dòng)相分別以有機(jī)酸、緩沖鹽、離子對(duì)試劑作為添加劑時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，采用有機(jī)酸時(shí)，雜質(zhì)無(wú)法有效分離；采用緩沖鹽，雜質(zhì)峰形有所改善，但保留性稍差；采用離子對(duì)試劑，雜質(zhì)有保留但峰形較差。因此最終決定采用緩沖鹽與離子對(duì)試劑組合的流動(dòng)相體系。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮在波長(zhǎng)244nm處有特征吸收峰，雜質(zhì)A、B在244nm附近也有較大吸收，足以保證檢測(cè)的靈敏度，因此選擇244nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 不同企業(yè)起始物料的影響

研究結(jié)果顯示，不同企業(yè)的5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，雜質(zhì)水平的差異顯著。由于雜質(zhì)會(huì)參與反應(yīng)，極易傳導(dǎo)至下一步產(chǎn)物，會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，因此，起始物料的質(zhì)量控制非常關(guān)鍵。本方法可以對(duì)各企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，如有較大雜質(zhì)檢出，則提示應(yīng)對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步降低雜質(zhì)含量。若使用雜質(zhì)含量較大的產(chǎn)品生產(chǎn)蘋(píng)果酸舒尼替尼時(shí)，應(yīng)進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

4 小結(jié)

本研究基于高效液相色譜儀，建立了5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，并對(duì)方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的質(zhì)量檢測(cè)。