李俊峰，徐 俊，李曉雷，李涵冰

(1.四川省南充市中心醫(yī)院胸心外科，川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000)

食管癌(esophageal cancer，EC)是一類發(fā)生于食管上皮組織的消化道腫瘤，在所有惡性腫瘤中，EC的發(fā)病率為2%，它包括食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma carcinoma，EADC)兩種類型，ESCC的發(fā)病率高于EADC[1]。由于具有高浸潤性和侵襲轉(zhuǎn)移強(qiáng)的特點(diǎn)，ESCC的治療效果差、引起患者不良預(yù)后[2]。因此，深入探究ESCC浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制有助于為該疾病的治療提供新策略。促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移能力關(guān)鍵過程是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生[3]。在EMT發(fā)生過程中，E盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1)是關(guān)鍵的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中通過誘導(dǎo)EMT來促進(jìn)腫瘤的浸潤及侵襲轉(zhuǎn)移。ZEB1屬于E盒結(jié)合鋅指蛋白家族，通過結(jié)合E-box啟動子元件促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[3]。ZEB1高表達(dá)也常見于在轉(zhuǎn)移性較高的上皮腫瘤細(xì)胞中[4]。此外，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路及其下游蛋白c-Myc也在EMT的發(fā)生過程中起著調(diào)控作用，從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[3]。而在ESCC中，ZEB1的表達(dá)加快腫瘤進(jìn)程并促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5]，但ZEB1對ESCC侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制還少有研究。本研究通過基因敲除手段，考察ZEB1表達(dá)對ESCC侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討ZEB1對侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 ESCC細(xì)胞系EC9706購買于ATCC(American Type Culture Collection)。

1.2試劑及耗材 細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)中，總RNA利用RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒，反轉(zhuǎn)錄cDNA使用、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，RT-qPCR操作利用SYBR Green PCR Master Mix染料，RT-qPCR相關(guān)試劑均購買于南京諾唯贊生物科技有限公司。RT-qPCR引物購買于蘇州金唯智生物科技有限公司，ZEB1 primers序列為，F(xiàn):5′-GCCAATAAGCAAACGATTCTG-3′；R:TTTGGCTGGATCACTTTCAAG。shRNA陰性對照質(zhì)粒及ZEB1 shRNA慢病毒質(zhì)粒購買于德國默克公司，ZEB1 shRNA序列：5′-CCGGTGT-CTCCCATAAGTATCAATTCTCGAGAATTGA-TACTTATGGGAGACATTTTTG-3′，CCK8檢測試劑盒購買于上海翊圣生物科技有限公司。WB抗體包括β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin和E-cadherin，購買于美國Cell Signaling Technology公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括DMEM無血清培養(yǎng)基、Gibco血清、胰酶，購買于美國GIBCO公司。免疫印跡法(Western blot，WB)所需試劑，RIPA Buffer和PierceTMBCA Protein Assay Kit購買于美國ThermoFisher公司；SDS-PAGE膠成分Tris 6.8，Tris 8.8，29：1聚丙烯酰胺溶液、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、TMED、過硫酸銨購買自上海生工生物工程股份有限公司；電泳所需電源、制膠架、電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽購買自美國伯樂Bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基(dulbecco′s minimum essential medium，DMEM)用超純水溶解后，按比例加入一定量的碳酸氫鈉，0.22 μm無菌濾膜過濾分裝。使用時加入Gibco胎牛血清，120 mg/L鏈霉素和120 U/mL青霉素，配成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。EC9706細(xì)胞置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中孵育增殖。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后胰酶消化并傳代。

1.3.2RT-qPCR 細(xì)胞提取總RNA：轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組的EC9706細(xì)胞和ZEB1 shRNA沉默后的EC9706細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中消化，收集離心后，用PBS洗滌2次。細(xì)胞沉淀中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 0.5 mL，用槍頭反復(fù)吹打，直至細(xì)胞團(tuán)塊完全消失；加入RNase Free dH2O 200 μL，上下顛倒混勻后，常溫靜置15 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；避免接觸管底沉淀，吸取400 μL上清轉(zhuǎn)移至新離心管，加入400 μL異丙醇，反復(fù)震蕩20 s，然后室溫靜置15 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；保留管底白色團(tuán)塊，用移液器吸去上清，75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，常溫干燥。RNA定量：將乙醇揮發(fā)后的RNA用RNase Free dH2O溶解，利用分光光度計和Thermo ScientificTMNanoDropTMQC軟件對總RNA濃度進(jìn)行檢測，并用RNase Free dH2O將每組RNA濃度調(diào)整為1 g/L。逆轉(zhuǎn)錄cDNA：按5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O配方一次加入，至總體積10 μL。42 ℃孵育2 min后，于4 ℃冷卻，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，5×PrimeScriptBuffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O和RT Primer Mix 1.0 μL至總體積20 μL，程序37 ℃運(yùn)行15 min。85 ℃滅活15 s后終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下配制：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，PCR Forward Primer 0.25 μL，PCR Reverse Primer 0.25 μL，cDNA溶液0.5 μL，RNase Free dH2O 4 μL。每個濃度至少測量3個復(fù)孔。ABI 7500型熒光定量PCR儀，設(shè)定PCR反應(yīng)程序：Stage 1：預(yù)變性Reps：1，95 ℃ 30 s；Stage 2：PCR反應(yīng) Reps：50，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增。最后，對熒光實(shí)時定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得結(jié)果。

1.3.3慢病毒shRNA轉(zhuǎn)染 慢病毒ZEB1 shRNA轉(zhuǎn)染：利用HIV病毒將自身基因組插入整合到宿主基因組的特性，讓目的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)沉默目的基因的作用。操作流程：在處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞內(nèi)加入10 μg質(zhì)粒和HIV病毒合成所需要的組分(10 μL Lentiviral Mix和60 μL HG TransgeneTM Reagent)；培養(yǎng)24 h后病毒被293T細(xì)胞分泌到胞外，此時回收培養(yǎng)基上清(含病毒)，用0.22 μm濾頭過濾后，加入到需要被轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)；感染EC9706細(xì)胞48 h后，將培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素進(jìn)行真核細(xì)胞藥物篩選，存活下來的即穩(wěn)轉(zhuǎn)成功的細(xì)胞。

1.3.4CCK8(Cell Counting Kit-8)實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組的ESCC細(xì)胞系EC9706和沉默了ZEB1表達(dá)的EC9706細(xì)胞消化后重懸，以100 μL/孔等量均勻地加入96孔板，兩組細(xì)胞平行6個副孔。待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)到密度為70%～80%后加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)1～4 h后，與450 nm波長下檢測吸光度(optical density，OD)。計算后可得相對細(xì)胞活力水平。

1.3.5劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組的ESCC細(xì)胞系EC9706及敲除ZEB1的EC9706細(xì)胞進(jìn)行消化后，用1 mL培養(yǎng)體系均勻培養(yǎng)在6孔板中。待細(xì)胞貼壁生長并在密度達(dá)到80%后，用移液器槍頭在孔內(nèi)細(xì)胞上劃痕，保證每條劃痕線寬度均勻且平行。劃線結(jié)束后，用滅菌后PBS輕輕洗滌6孔板，將劃痕后漂浮的細(xì)胞去除，留下清晰可見的劃痕線。對6孔板劃痕的固定位置進(jìn)行記錄拍照。劃痕0 h拍照記錄細(xì)胞生長狀態(tài)后，將六孔板放置回37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后再次記錄細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.3.6Western blot 收集細(xì)胞：對數(shù)期生長的轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組的EC9706及敲除ZEB1的EC9706細(xì)胞進(jìn)行消化后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿用PBS清洗2次后，合并細(xì)胞懸液和洗液，轉(zhuǎn)移至塑料離心管，2 300 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，用移液器棄去上清液，細(xì)胞團(tuán)塊用1 mL PBS重懸后，轉(zhuǎn)移到于1.5 mL離心管里，2 000 r/min離心5 min，將上清吸凈。蛋白提取：盡可能用移液槍將PBS去除干凈。將提前配好的蛋白裂解液按與細(xì)胞等體積的量加入1.5 mL Tube管，與細(xì)胞混合并輕輕打勻，置于冰上，裂解55 min，每隔10 min輕輕彈動EP管底部。裂解完畢后，用離心機(jī)以12 000 r/min離心30 min，將蛋白上清小心吸出并加入新的離心管中。BCA法用于測定樣品蛋白含量，將蛋白用水調(diào)至同一濃度。然后在蛋白中加入1/3蛋白體積的loading buffer混勻。100 ℃水浴變性10 min后，放置于冰上冷卻10 min，12 500 r/min離心1 min后準(zhǔn)備上樣。如果不立即使用，應(yīng)將蛋白保存在-20 ℃冰箱中。制膠及電泳分離蛋白：制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V濃縮膠，140 V分離膠，運(yùn)行1～1.5 h。全濕轉(zhuǎn)膜：電泳后取下膠，按尺寸剪取濾紙及NC膜，并將它們浸泡在全濕轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min。按海綿→濾紙→NC膜→膠→濾紙→海綿的順序依次疊放整齊，除了膜不能用試管搟壓外，每鋪一層都用試管去除氣泡。將夾板放入槽中，加入全濕緩沖液，恒流230 mA，轉(zhuǎn)膜時間為2 h；轉(zhuǎn)膜過程中，轉(zhuǎn)膜裝置放在冰盒中。麗染：將轉(zhuǎn)膜后的NC膜浸泡在麗春紅染液中，慢搖1 min后用dH2O震蕩、清洗，根據(jù)Marker指示，剪下目標(biāo)條帶，標(biāo)記，用PBS洗去麗春紅。封閉：配制3% BSA封閉液，將條帶封閉，37 ℃恒溫?fù)u床中孵育1 h。抗體孵育：用PBST將封閉后的條帶蕩洗一遍，用PBST配制一抗，將條帶用一抗封袋，37 ℃恒溫?fù)u床孵育1 后4 ℃孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，PBST洗3次，10 min清洗一次。用PBST配制二抗，封袋，37 ℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h。曝光：二抗孵育結(jié)束后，用PBST清洗條帶，清洗3次，每次10 min。用PBS浸泡條帶后，配置ECL顯色液，將條帶漂洗10 s后采用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀進(jìn)行曝光成像。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用成組設(shè)計的t檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ZEB1 shRNA敲除EC9706細(xì)胞中ZEB1表達(dá) 為了探究ZEB1蛋白表達(dá)是否對ESCC細(xì)胞系EC9706的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究首先構(gòu)建了ZEB1敲除的EC9706細(xì)胞系。采用ZEB1 shRNA對EC9706細(xì)胞系進(jìn)行慢病毒侵染，通過培養(yǎng)和篩選后獲得ZEB1敲減后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測ZEB1 shRNA轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞的ZEB1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，ZEB1 shRNA顯著降低了ZEB1 mRNA的表達(dá)水平(P<0.001)。見表1。

表1 ZEB1 shRNA抑制EC9706細(xì)胞ZEB1 mRNA表達(dá)Table 1 ZEB1 shRNA inhibited the expression of ZEB1 mRNA in EC9706 cells

2.2敲除ZEB1的EC9706細(xì)胞活力降低 為探究敲低ZEB1的EC9706細(xì)胞的增殖能力，利用CCK8實(shí)驗(yàn)考查細(xì)胞活力水平。與轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組的細(xì)胞相比，敲低ZEB1的EC9706細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.001)，見表2。

表2 ZEB1 shRNA抑制EC9706細(xì)胞活力水平Table 2 The cell viability of EC9706 cells was reduced by ZEB1 shRNA

2.3敲除ZEB1抑制EC9706細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力 利用劃痕實(shí)驗(yàn)考察ZEB1蛋白表達(dá)對ESCC細(xì)胞系EC9706細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組細(xì)胞在劃痕24 h后增殖迅速，愈合能力強(qiáng)，劃痕寬度顯著降低。而敲低了ZEB1表達(dá)的EC9706細(xì)胞，雖然也有一定程度的增殖和愈合，但劃痕寬度明顯大于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 ZEB1 shRNA抑制EC9706細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移表3 ZEB1 shRNA inhibited metastasis of EC9706 cells

2.4敲除ZEB1抑制ERK1/2激活并調(diào)節(jié)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平 針對EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，考察了ZEB1敲除后ERK1/2蛋白的表達(dá)和E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖1)，對比轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了ZEB1 shRNA的細(xì)胞，ZEB1蛋白表達(dá)水平明顯降低；敲減ZEB1后，細(xì)胞ERK1/2的激活水平被抑制；與EMT相關(guān)蛋白N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平增高。

圖1 ZEB1 shRNA抑制ERK1/2激活并調(diào)節(jié)cadherin表達(dá)水平Figure 1 ZEB1 shRNA inhibited activation of ERK1/2 and regulated expression of cadherin protein levels

3 討 論

食管癌是發(fā)生于食管上皮的惡性腫瘤[6]。目前，手術(shù)切除和新輔助化療食管癌的主要治療方法。應(yīng)用于早期食管癌的治療方案主要是手術(shù)切除，當(dāng)腫瘤進(jìn)展到中晚期，由于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的發(fā)生，手術(shù)治療效果較差，需要配合化療[7]?；熀头暖熓侵委熓彻馨┑闹匾椒?。而新輔助治療，是一種聯(lián)合化療或放療手段在食管癌術(shù)前的應(yīng)用，其作用除了手術(shù)前降低食管癌腫瘤分期，使手術(shù)獲得更好療效以外，也應(yīng)用于術(shù)后治療，避免腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而減少局部復(fù)發(fā)[8]。但由于食管癌的高侵襲轉(zhuǎn)移性，腫瘤轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)依舊是食管癌治療的難點(diǎn)[9]。

惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的關(guān)鍵是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，消除EMT從而抵抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的思路之一[10]。在人類惡性腫瘤中，有80%來源于上皮組織。通過EMT，原發(fā)性上皮組織腫瘤細(xì)胞可以形成間充質(zhì)細(xì)胞，從而具備了遷移能力，進(jìn)而向血管內(nèi)侵襲，隨著血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)其他部位[11]。上皮腫瘤細(xì)胞最終通過EMT形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶，該過程極大地促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展和惡性程度，增加了臨床治療難度[11]。目前研究表明，調(diào)控EMT的主要轉(zhuǎn)錄因子包括Twist、Snail和ZEB[12]。ZEB家族是E盒結(jié)合鋅指蛋白(Zinc finger E-box binding homeobox)，包含ZEB1和ZEB2兩種類型[3]。在調(diào)控EMT發(fā)生中，ZEB1是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中，ZEB1可通過誘導(dǎo)EMT來促進(jìn)上皮腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13-14]。ZEB1啟動EMT的作用機(jī)制可能是ZEB1通過其鋅指結(jié)構(gòu)與E-cadherin的啟動子區(qū)域結(jié)合、抑制E-cadherin表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，ZEB1在上皮腫瘤EMT發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要功能[13]。而其他和ZEB1相關(guān)的蛋白，如ERK、MAPK信號通路及其下游蛋白c-Myc，在EMT的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[15]。如在肺癌細(xì)胞中，EMT受到ERK和ZEB1通路的廣泛調(diào)節(jié)[16]。而本文針對侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的ESCC細(xì)胞進(jìn)行了研究，考察了ZEB1對癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及ERK的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)敲低ZEB1表達(dá)后，能夠顯著抑制ESCC細(xì)胞系ES9706細(xì)胞的細(xì)胞活力、降低細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，并在蛋白水平抑制ERK1/2活性，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)和抑制N-cadherin表達(dá)。本研究結(jié)果顯示ZEB1在ESCC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移上發(fā)揮的關(guān)鍵作用，故而提示可以靶向ZEB1進(jìn)行ESCC的治療。目前直接靶向ZEB1的小分子抑制劑還鮮有研究，但最新的研究進(jìn)展中，發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑在針對肺癌的治療上可以逆轉(zhuǎn)EMT，使間充質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)為上皮細(xì)胞，這是通過HDAC抑制劑處理抗性細(xì)胞過程中可以抑制ZEB1功能而實(shí)現(xiàn)的[17]。除了直接抑制ZEB1活性外，ZEB1也受到上游因子PI3K、STAT3和SIRT等蛋白調(diào)控[14,18]。如PI3K抑制劑BENC-511，可以通過調(diào)控β-catenin-ZEB1通路來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[18]。所以也可以通過抑制ZEB1蛋白上游調(diào)控因子、干擾ZEB1信號環(huán)路，或是切斷ZEB1下游控制元件來抑制ZEB1相關(guān)通路，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。由于ESCC細(xì)胞具有的強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移性和難治性，故而靶向ZEB1從而達(dá)到抗ESCC具有一定研究價值和臨床意義。而本研究將在后續(xù)的研究中，將致力探討ERK1/2是否介導(dǎo)ZEB1對E-cadherin和N-cadherin的調(diào)控作用，通過過表達(dá)ERK1/2觀察ZEB1敲除下EMT的變化，從而深入研究ZEB1在ESCC侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，并尋找干擾ZEB1活性的小分子化合物及其抗腫瘤機(jī)制。