李 玲,何 霞,周自城,高曉玉

(四川省雅安市人民醫(yī)院檢驗科，四川 雅安 625000)

乳腺癌是最常見且嚴重威脅廣大女性身心健康的惡性腫瘤，其中浸潤、復發(fā)和轉移是危及患者生命安全的主要因素[1]。目前臨床上對于乳腺癌的發(fā)病機制尚未得到統(tǒng)一言論，認為其可能與飲食、環(huán)境、月經(jīng)情況、婚育情況、乳腺疾病病史等因素相關[2]。目前臨床暫無治療乳腺癌特效藥，隨著分子生物學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)乳腺癌在分子水平上具有高度異質性，故從分子角度闡明乳腺癌的轉移、復發(fā)的機制，尋找乳腺癌新的分子靶標[3]。故在本文研究中，選取2019年11月至2020年11月期間于我院就診的79例乳腺癌患者作為研究對象，檢測乳腺癌及癌旁組織中胱天蛋白酶募集域蛋白9(Caspase recruitment domain protein 9，CARD9)、M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase，PKM2)、趨化因子樣因子超家族成員6(Chemokine like factor superfamily member 6，CMTM6)表達水平，分析其與患者臨床病理特征的相關性，旨在為乳腺癌的診斷、治療及預后判斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年11月至2020年11月我院接診的79例乳腺癌患者研究對象，年齡35～74歲，平均年齡(51.78±21.11)歲，BMI 24～36kg/m2，平均BMI(28.50±7.13)kg/m2。所有研究對象及家屬均知情同意本次研究，且經(jīng)我院倫理委員會批準。納入標準：①符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2019年版)》[4]中乳腺癌的診斷標準；②經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌且在我院就診并行手術且術后病檢確診為乳腺癌者；③均為首發(fā)病例。排除標準：①年老體弱、存在嚴重合并癥不適合手術者；②處于妊娠期或哺乳期的女性；③出現(xiàn)遠處轉移者；④近1個月內進行過重大手術者。

1.2方 法

1.2.1標本采集:取乳腺癌患者手術切除癌組織及癌旁組織標本作研究，其中癌組織79例，另外距癌組織>5cm且經(jīng)病理學證實的38例癌旁正常乳腺癌組織作為癌旁組織，將制作的組織標本采用40g/L多聚甲醛進行固定，并進行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3μm，連續(xù)切片作免疫組化標記。

1.2.2免疫組化法檢測方法:采用免疫組化法檢測CARD9、PKM2、CMTM6表達，將癌組織、癌旁組織切片放置在二甲苯中浸泡2次(15min/次)，撈出后將多余水份取出后分別放置在無水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，采用自來水、PBS緩沖液沖洗3次(時間分別為1min/次、3min/次)；將EDTA抗原修復液加熱至沸騰后使其處于保溫狀態(tài)并將切片放入已沸騰的修復液中并繼續(xù)加熱20min，待EDTA溶液冷卻至室溫，將切片取出采用蒸餾水、PBS緩沖液均沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，分別加入100μL的鼠抗人CARD9、PKM2、CMTM6抗體，室溫下孵育60min后，采用PBS緩沖液沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，加入100μL酶標羊抗兔IgG聚合物，室溫下孵育15min后采用PBS緩沖液沖洗3次(3min/次)；去除PBS緩沖液，加入100～200μL DAB顯色液孵育3～5min，顯微鏡下觀察染色結果；自來水沖洗切片后采用蘇木素染色液復染10～30s，采用PBS緩沖液沖洗反藍；脫水、透明、封片：并將切片分別放置在無水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，二甲苯透明，然后采用中性樹膠和蓋玻片封片，顯微鏡鏡查。免疫組化染色結果:于高倍鏡(×200)下隨機選取5個視野，計算陽性細胞百分率，①染色強度：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分；②陽性細胞百分數(shù)：陽性細胞<10%、陽性細胞1%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分，上述兩者乘積作為最后結果，陰性、陽性分別為0～1分、2～9分。

1.2.3RT-PCR檢測方法:采用RT-PCR法檢測CARD9、PKM2、CMTM6表達，實驗步驟：將1mL TRNzol加入癌組織、癌旁組織取總DNA并檢測其純度和濃度，提取2μg總DNA并加入內參GAPDH及目的小分子RNA CARD9、PKM2、CMTM6逆轉錄引物，42℃ 15min，85℃ 5s，逆轉錄合成cDNA；PCR反應條件：95℃ 預變性10min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃時間分別12s、40s、15s、30s、15s(收集熒光)，40個循環(huán)，使用Primer5.0軟件對引物序列進行設計，每個樣本設3個復孔，同時以ddH2O設為陰性對照，CARD9引物序列上游：5'-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3'，下游：5'-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3'；PKM2引物序列上游：5'-GGTGTTTGCGTCATTCATCC-3'，下游：5'-ACCGTCCAATCATCATCTTCTG-3'；CMTM6引物序列上游：5'-AGGCAATAGGTCAGTAAGGTCAGTAGG-3'，下游：5'-GTCCAGAAGCAGTCAGTCTCAAGTC-3'；內參GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.2.4計算公式:靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，診斷效率=真陽性+真陰性/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)。

2 結 果

2.1CARD9、PKM2、CMTM6在癌組織和癌旁組織中的表達比較:CARD9、PKM2、CMTM6在癌組織中表達均高于癌旁組織，具有統(tǒng)計學差異(t=61.610、52.920、54.510，均P<0.05)，見表1、圖1、圖2、圖3。

表1 CARD9 PKM2 CMTM6在癌組織和癌旁組織中的表達比較

圖1 CARD9在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

圖2 PKM2在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

圖3 CMTM6在癌組織、癌旁組織中免疫組織化學染色圖(×200)a：癌組織；b：癌旁組織

2.2CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性分析:CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者年齡、腫瘤部位、病理類型、絕經(jīng)情況、腫瘤大小無關，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。低分化程度、有淋巴結轉移、Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者CARD9、PKM2、CMTM6表達高于高中分化程度、無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2。

表2 CARD9 PKM2 CMTM6與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性分析

2.3CARD9、PKM2、CMTM6之間相關性分析：Pearson相關性分析顯示，CARD9、PKM2之間正相關(r=0.257，P=0.022)；CARD9、CMTM6之間正相關(r=0.260，P=0.021)；PKM2、CMTM6之間正相關(r=0.254，P=0.024)，見圖4。

圖4 CARD9、PKM2、CMTM6之間相關性圖

2.4CARD9、PKM2、CMTM6對乳腺癌的預測價值:分別繪制CARD9、PKM2、CMTM6單項和三者聯(lián)合對乳腺癌診斷的ROC曲線，結果顯示，CARD9、PKM2、CMTM6單項檢測診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為716(95%CI：0.591～0.840)、0.653(95%CI：0.531～0.774)、0.735(95%CI：0.611～0.860)，而CARD9、PKM2、CMTM6聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.833(95%CI：0.741～0.925)，見表3、圖5。

圖5 CARD9、PKM2、CMTM6診斷乳腺癌的ROC曲線圖

表3 CARD9 PKM2 CMTM6診斷乳腺癌的效能分析

3 討 論

乳腺癌患者早期時不具備典型的癥狀和體征，常在體檢或乳腺癌篩查中被發(fā)現(xiàn)，此病的典型體征包括乳腺腫塊、乳頭溢液、皮膚改變、腋窩淋巴結中以及乳頭或乳暈異常等[5]。目前臨床多采用手術、放療、化療、內分泌治療乳腺癌等，盡管治療手段不斷進步，仍有部分乳腺癌患者出現(xiàn)遠處轉移現(xiàn)象，進而導致治療失敗，故從分子角度闡明乳腺癌的轉移、復發(fā)機制，尋找乳腺癌新的分子靶標，對于完善乳腺癌患者的治療和提高預后意義重大[6]。

臨床研究證實，癌癥的發(fā)生與細胞增殖、凋亡等生物學行為相關，其中細胞中病理、生理因子可通過不同的初級信號介導凋亡，而凋亡的最終通路均為胱天蛋白酶的激活[7]。CARD9是CARD蛋白酶家族主要成員之一，具有胱天蛋白酶激活的作用，在多種原發(fā)性腫瘤組織中呈異常高表達，通過形成CARD-CARD結構，實現(xiàn)細胞內信號傳導并參與細胞生物學行為[8]。有研究顯示[9]，CARD9是一個調節(jié)核轉錄因子-KB等信號通路的重要的因子，CARD9高表達可促進乳腺癌細胞的增殖，提示其可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，研究結果證實CARD9與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小無關，但與患者淋巴結轉移、臨床分期相關。在本文研究中，CARD9在癌組織中表達顯著高于癌旁組織，說明其在乳腺癌中呈高表達；高中分化程度CARD9高于低分化程度，有淋巴結轉移CARD9高于無淋巴結轉移，Ⅲ～Ⅳ期CARD9高于Ⅰ～Ⅱ期，說明隨著分化程度加重、淋巴結轉移、臨床分期加重，CARD9越高。

PKM2是一種限速酶，在糖酵解途徑中顯得尤為重要，其在腫瘤細胞中呈高表達，在腫瘤的代謝過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在賀帥[10]等研究中，糖代謝異常在乳腺癌進展中起重要作用，糖酵解可產(chǎn)生大量乳酸，為糖異生提供原料，此外導致外周組織對葡萄糖的利用障礙，有氧糖酵解和糖代謝異常相互作用促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，PKM2在有氧糖酵解的建立以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移中起重要作用。姚奧[11]等研究，PKM2在細胞質中與其他糖酵解酶共同構成糖酵解酶復合體，為癌細胞的生長代謝提供能量并保證其長時間繁殖。本研究PKM2在乳腺癌患者中呈高表達，參與腫瘤細胞的有氧糖酵解的催化作用，促進細胞糖酵解、增殖，且為癌細胞提供生長所需能量。本文研究結果表明，PKM2在乳腺癌組織中高表達，高中分化程度PKM2高于低分化程度，有淋巴結轉移PKM2高于無淋巴結轉移，Ⅲ～Ⅳ期PKM2高于Ⅰ～Ⅱ期，說明隨著分化程度加重、淋巴結轉移、臨床分期加重，PKM2越高。

CMTM6是CMTM家族主要成員之一，可激活和趨化大量免疫細胞并對腫瘤細胞的增殖和侵襲產(chǎn)生影響。臨床實踐表明，CMTM6在肺腺癌患者中表達上調，且與患者臨床分期、遠處轉移相關，且與PD-L1水平密切相關[12]。馮曉波[13]等研究，CMTM6在口腔鱗癌中呈高表達，且與PD-1、PD-L1表達呈正相關，表明其與PD-1、PD-L1在調控腫瘤微環(huán)境的免疫反應中具有協(xié)同作用，其機制可能為激活或加強PD-1/PD-L1信號通路，發(fā)揮免疫抑制的作用。楊小駿[14]等研究，CMTM6在乳腺癌中表達顯著高于癌旁組織，且與乳腺癌病理分型、HER2陽性顯著、患者預后相關，CMTM6高表達是乳腺癌預后評估的獨立危險因素。在本文研究中，CMTM6癌組織中表達高于癌旁組織，說明其在乳腺癌中呈高表達，高中分化程度CMTM6高于低分化程度，有淋巴結轉移CMTM6高于無淋巴結轉移，Ⅲ～Ⅳ期CMTM6高于Ⅰ～Ⅱ期，說明隨著分化程度加重、淋巴結轉移、臨床分期加重，CMTM6越高。

綜上所述，CARD9、PKM2、CMTM6與乳腺癌患者分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有關，CARD9、PKM2、CMTM6兩兩之間呈線性相關，且均參與乳腺癌的發(fā)生和演變過程，有望成為乳腺癌無創(chuàng)診斷的一種新手段，為乳腺癌的早期診治提供一定的理論參考。但本文研究存在樣本量較少、病例來源受地域限制、指標不夠全面不足，故在后續(xù)研究中需開展多中心、多樣本的研究，為臨床提供可靠依據(jù)。