王 樂，王衛(wèi)杰，楊曉娟，黃 云，盧大雷

(1.河南省開封市醫(yī)學科學研究所，河南 開封 475000 2.河南省開封市醫(yī)用細胞生物學重點實驗室，河南 開封 475000)

高血壓是目前心血管和腎臟疾病的主要危險因素，其發(fā)病機制非常復雜[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin- angiotensin-aldosterone system，RAAS)中的一個關鍵調控酶，其表達量及活性異?？赡軈⑴c高血壓的發(fā)病過程[2,3]。Collectrin是RAAS中的孤立成員，是ACE2的同源物，同樣在高血壓的發(fā)生中起著重要的作用[4]。本研究擬通過測定ACE2和Collectrin在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)體內的表達情況，探討ACE2和Collectrin與高血壓的關系，以期對高血壓的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1動物:12周齡SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)12只和雄性WKY大鼠(WKY)12只，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。大鼠隨機分為兩組：WKY對照組(n=12)和SHR組(n=12)，然后分別從WKY對照組和SHR組隨機抽取6只，處死后迅速取其腎臟組織放入液氮，隨后轉入-80℃保存，檢測ACE2與Collectrin mRNA和蛋白表達水平。其余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)12周后處死進行相同檢測。

1.2方 法

1.2.1血壓的測定:在大鼠清醒狀態(tài)下，采用ZH恒溫式無創(chuàng)尾壓動脈血壓測量儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)，間接測量尾動脈收縮壓(SBP)。每只鼠連續(xù)測3次，取平均值。

1.2.2實時定量RT-PCR檢測大鼠腎臟組織ACE2與Collectrin mRNA表達水平:采用Trizol法提取腎臟組織總RNA。以總RNA為模板按照反轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA第一鏈。以GAPDH作為內參照，根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中ACE2、Collectrin和GAPDH的基因序列設計上下游引物(見表1)。Real-time PCR擴增總體積為25μL，反應條件為95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 45s，72℃ 30s，共40個循環(huán)；72℃ 10 min。以2-△△Ct表示ACE2 mRNA或Collectrin mRNA的相對表達水平。

表1 實時定量RT-PCR擴增引物序列

1.2.3Western blot檢測大鼠腎臟組織ACE2與Collectrin 蛋白表達水平:使用RIPA裂解液提取腎臟組織的總蛋白，采用二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將凝膠中的蛋白轉入PVDF膜中，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5min；隨后加入相應的HRP標記的二抗，37℃孵育1h，TBST洗滌3次，每次5min；最后用ECL化學發(fā)光檢測蛋白條帶。以GAPDH作為內參，分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達。

2 結 果

2.1大鼠血壓和體重:與12周齡和24周齡 WKY對照組相比，同周齡SHR組收縮壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與12周齡SHR組比較，24周齡SHR組收縮壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 WKY和 SHR大鼠收縮壓(mmHg)比較

2.2大鼠腎臟組織ACE2 mRNA的表達:與12周齡和24周齡 WKY對照組相比，同周齡SHR組大鼠腎臟組織中ACE2 mRNA 表達明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；與12周齡 SHR組相比，24周齡 SHR組ACE2 mRNA 表達明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)。詳見表3和圖1。

表3 腎臟組織中兩組ACE2 mRNA表達水平比較

圖1 腎臟組織ACE2 mRNA表達水平注：與WKY對照組同周齡相比，*P<0.01；與組內12周齡大鼠相比，#P<0.01

2.3大鼠腎臟組織Collectrin mRNA的表達:與12周齡WKY對照組相比，同周齡SHR組Collectrin mRNA 表達有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；與24周齡WKY對照組相比，同周齡SHR組Collectrin mRNA 表達顯著升高，有顯著性差異(P<0.01)；與12周齡 SHR組相比，24周齡SHR組Collectrin mRNA 表達明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)。詳見表4和圖2。

表4 腎臟組織中兩組Collectrin mRNA表達水平比較

圖2 腎臟組織Collectrin mRNA表達水平注：與WKY對照組同周齡相比，*P<0.01；與SHR組12周齡大鼠相比，#P<0.01

2.4大鼠腎臟組織ACE2蛋白表達:與12周齡和24周齡 WKY對照組相比，同周齡SHR組大鼠腎臟組織中ACE2 蛋白表達明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；與12周齡 SHR組相比，24周齡 SHR組ACE2 蛋白表達明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)。詳見圖3。

圖3 CE2蛋白表達水平注：與WKY對照組同周齡相比，*P<0.01；與SHR組12周齡大鼠相比，#P<0.01

2.5大鼠腎臟組織Collectrin蛋白表達:與12周齡WKY對照組相比，同周齡SHR組Collectrin蛋白表達有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；與24周齡WKY對照組相比，同周齡SHR組Collectrin蛋白表達顯著升高，有顯著性差異(P<0.01)；與12周齡SHR組相比，24周齡SHR組Collectrin蛋白表達升高，有顯著性差異(P<0.01)。詳見圖4。

圖4 大鼠腎臟組織Collectrin的蛋白表達水平注：與WKY對照組同周齡相比，*P<0.01；與SHR組12周齡大鼠相比，#P<0.01

3 討 論

高血壓是我國比較常見、發(fā)病率較高的心血管疾病之一。有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)ACE2是血壓調節(jié)的重要基因，其作為候選基因，為高血壓等疾病的藥物治療和防治提供了新的靶點[5]。Collectrin(Tmem27)是一種跨膜糖蛋白，與ACE2的的同源性約為50%，有研究表明Collectrin可解耦聯(lián)內皮型一氧化氮合酶，導致高血壓和血管功能障礙，刪除Collectrin基因可能導致高血壓、鹽敏感性增高和壓力-排鈉利尿受損[6]。可見ACE2和Collectrin在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，在腎臟組織中，同周齡SHR組與WKY對照組相比，ACE2 mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.01)，且隨著周齡的增加，ACE2 mRNA和蛋白表達水平有明顯下降的趨勢。與佟倩[7]等研究結果一致。研究人員發(fā)現(xiàn)Collectrin在高血壓和鹽敏感性小鼠品系的血壓調節(jié)中發(fā)揮作用[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在腎臟組織中，SHR組與WKY對照組相比，Collectrin mRNA和蛋白表達均有所升高，但只有24周齡Collectrin mRNA和蛋白表達有顯著性差異(P<0.01)；且隨著周齡的增加，Collectrin mRNA 和蛋白表達有明顯升高的趨勢。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腎臟中ACE2 mRNA和蛋白表達下降時，Collectrin mRNA 和蛋白表達卻明顯升高，提示ACE2的低表達和Collectrin的高表達可能參與血壓的調節(jié)。

綜上所述，腎臟組織中的ACE2和Collectrin mRNA和蛋白表達可能與血壓升高有關，且這兩種基因在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中均起著重要的作用，但具體的作用機制還不清楚，所以下一步將通過研究與人類高血壓相關基因的相互作用，有可能為人類高血壓的發(fā)病機制、預防和治療研究提供參考。