李新軍，鐘敏華，吳展陵，曹玲莉，邱 琦，涂平華，汪娜娜，彭閃閃，高 飛

(湖北省孝感市中心醫(yī)院，湖北 孝感 432000)

在我國(guó)肺癌發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤首位[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)占肺癌的85%以上，據(jù)報(bào)道我國(guó)有逾2/3的患者臨床確診時(shí)已錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，5年生存率較低[2]。因此，積極探索并發(fā)現(xiàn)影響NSCLC患者疾病發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)機(jī)制具有十分重要的意義。近年來(lái)，大量證據(jù)表明 miRNA在包括NSCLC在內(nèi)癌癥發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[3,4]。miR-145和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如膽管癌、口腔癌、胰腺癌、前列腺癌等[5]，然而，miR-145對(duì)NSCLC發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制尚未得到闡明。因此，我們研究的目的是評(píng)估m(xù)iR-145-5p與NSCLC的關(guān)聯(lián)，嘗試發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在NSCLC疾病進(jìn)展中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本:2019年10月至2021年1月間，收集孝感市中心醫(yī)院14例NSCLC患者癌組織及其相鄰的非癌組織。每位參與者均知悉研究?jī)?nèi)容并簽署了知情同意書(shū)。所有材料和方法均獲得孝感市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):NSCLC細(xì)胞系(A549)和非腫瘤細(xì)胞系(BEAS-2B)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassass，弗吉尼亞州，美國(guó))。將細(xì)胞培養(yǎng)在加有10%胎牛血清(Hyclone，美國(guó))和100U/mL青霉素-鏈霉素(Hyclone，美國(guó))的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))中，置于5%CO2的37℃的潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:miR-145-5p模擬物及其陰性對(duì)照；pcDNA-PHB2及其陰性對(duì)照分別購(gòu)自GenePharma(中國(guó)上海)。按照制造商(Invitrogen，美國(guó))的說(shuō)明，使用Lipofectamine?2000進(jìn)行質(zhì)粒和pc-DNA轉(zhuǎn)染。

1.4細(xì)胞活力測(cè)定

1.4.1進(jìn)行MTT測(cè)定以分析細(xì)胞的存活力。將細(xì)胞接種到96孔板中，加入20μL MTT(5mg/mL，Sigma-Aldrich;Merck KGaA，Darmstadt，德國(guó))。將細(xì)胞在37℃下再孵育4h，然后加入150μL DMSO。在室溫下反應(yīng)10min后，在570nm處通過(guò)Multiskan FC酶免疫測(cè)定分析儀測(cè)量光密度(OD)，檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。

1.4.2為了評(píng)估細(xì)胞增殖，將A549細(xì)胞接種到48孔板中。將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%FBS的DMEM)中溫育。如上所述，第2天進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h，收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。使用EDU Cell Proliferation Assay Kit(Ribobio，Guangzhou，China)通過(guò)摻入5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)檢測(cè)細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞與50μM EDU一起溫育8h，然后根據(jù)制造商的方案進(jìn)行固定，透化和EDU染色。細(xì)胞核用DAPI(Ribobio，Guangzhou，China)染色。通過(guò)熒光顯微鏡確定EDU陽(yáng)性的有核細(xì)胞的比例。

1.5細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn):用8.0μm探針(BD Falcon)將2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)小室的上部。用未涂覆的基質(zhì)膠(遷移)和涂覆的基質(zhì)膠(侵襲)進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定。24h后，用棉簽除去小室表面的細(xì)胞。隨后，在冷甲醇中固定并用DAPI溶液對(duì)培養(yǎng)皿表面的細(xì)胞染色。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量。

1.6RNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR分析(qRT-PCR):根據(jù)制造商(Invitrogen，美國(guó))的方法，用Trizol分離來(lái)自組織和細(xì)胞的總RNA。然后使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，美國(guó))將總RNA(2μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR預(yù)混液(美國(guó)羅氏公司)評(píng)估基因表達(dá)。U6和GAPDH分別用作miRNA和mRNA的內(nèi)部對(duì)照。

1.7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):包含PHB2的3'UTR的互補(bǔ)DNA片段被亞克隆到pGL3-Baisc熒光素酶報(bào)道載體(Promega)中的熒光素酶基因的下游。將細(xì)胞與報(bào)告質(zhì)粒(100ng)和miR-145-5p minic / miR-NC minic共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h后，使用雙螢光素酶試劑盒(Promega)測(cè)定螢光素酶含量。

1.8蛋白質(zhì)印跡分析:用冷PBS洗滌后收集組織和細(xì)胞，然后在帶有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的RIPA裂解緩沖液(Solarbio)中裂解。使用Lowry蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(Solarbio)確定蛋白濃度。將每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行8-15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。采用一抗PHB2(1∶500，Proteintech)和GAPDH(1∶1000，Proteintech)分別孵育過(guò)夜并與二抗HRP-綴合的兔/小鼠抗-IgG(1∶10000，Proteintech)一起在室溫下孵育2h并洗滌。隨后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Biorad，美國(guó))檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

2 結(jié) 果

表1 非小細(xì)胞肺癌組織非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及過(guò)表達(dá)miR-145-5p A549細(xì)胞系中miR145-5p的表達(dá)水平(n=10)

2.1miR-145-5p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中下調(diào):首先我們檢測(cè)了14對(duì)NSCLC組織和癌旁組織中miR-145-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-145-5p水平在肺癌組織中與非癌組織顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。另外我們發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞系中miR-145-5p水平顯著低于BEAS-2B(P<0.001)，見(jiàn)表1。最后，我們進(jìn)行了mimic轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)，用miR-145-5p mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并與轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞對(duì)比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染可以有效增加細(xì)胞miR-145-5p的水平(P<0.001，表1)。基于此結(jié)果我們進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-145-5p抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲:為了研究miR-145-5p作為抑癌miRNA的作用，我們?cè)贏549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)miR-145-5p，使用MTT和EdU測(cè)定其相對(duì)吸光度及陽(yáng)性細(xì)胞的百分比來(lái)驗(yàn)證miR-145-5p對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic后的相對(duì)吸光度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低(圖1A、B、表2)，提示過(guò)表達(dá)miR-145-5p可以有效降低NSCLC細(xì)胞的增殖水平。隨后，我們通過(guò)劃痕試驗(yàn)及transwell試驗(yàn)測(cè)試了miR-145-5p在NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-145-5p顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲(圖1C、表2)?？傊?，我們的結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-145-5p可以在體外有效抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖1 miR-145-5p抑制NSCLC的增殖、遷移和侵襲A.轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic后，MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞的活力B.轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic 的A549細(xì)胞24h后進(jìn)行EdU增殖測(cè)定及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬物)用作陰性對(duì)照。具有紅色熒光的細(xì)胞處于有絲分裂的S期，具有藍(lán)色熒光的細(xì)胞代表所有細(xì)胞。比例尺=300μm。C.轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic后，A549細(xì)胞的遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)。

表2 兩組A549細(xì)胞增殖遷移侵襲能力(n=10)

2.3PHB2是miR-145-5p的直接靶標(biāo):由于miR-145-5p促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，我們進(jìn)一步研究了其促進(jìn)NSCLC進(jìn)展的機(jī)制。通過(guò)在線算法TargetScan進(jìn)行信息學(xué)分析，以預(yù)測(cè)miR-145-5p的潛在靶標(biāo)。并預(yù)測(cè)PHB2是miR-145-5p的靶點(diǎn)。我們首先對(duì)人NSCLC組織、癌旁組織及A549細(xì)胞中PHB2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人NSCLC組織及A549細(xì)胞中PHB2中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，僅約為癌旁組織的62%。為了證實(shí)PHB2是miR-145-5p的真正靶標(biāo)，我們?cè)贏549細(xì)胞中，將PHB2和miR-145-5p的野生型(WT)或突變體(Mut)3'-UTR共轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-145-5p顯著降低了A549細(xì)胞中野生型PHB2的熒光素酶活性，而使用突變體則無(wú)上述現(xiàn)象(表3)；另外，使用miR-145-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后顯著增加了A549細(xì)胞中野生型PHB2的熒光素酶活性，同樣使用突變體則無(wú)上述現(xiàn)象(表4)。隨后，我們進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)研究了用miR-145-5p或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的PHB2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與miR-NC組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p后，細(xì)胞中COPB2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)(表5)。上述結(jié)果聯(lián)合證明，PHB2是miR-145-5p抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的直接靶標(biāo)。

表3 過(guò)表達(dá)miR-125-5p后野生型(WT)或突變體(Mut)A549熒光素酶活性(n=10)

表4 抑制miR-125-5p表達(dá)后野生型(WT)或突變體(Mut)A549熒光素酶活性(n=10)

2.4miR-145-5p通過(guò)靶定PHB2，在體外抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲:為了進(jìn)一步驗(yàn)證PHB2對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響，我們采用miR-145-5p和PHB2共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并評(píng)估其增殖、遷移和侵襲的水平。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-145-5p mimic與pcDNA-PHB2的共轉(zhuǎn)染部分恢復(fù)了PHB2蛋白的表達(dá)水平，并有效地恢復(fù)了NSCLC的細(xì)胞活力(表6)。細(xì)胞的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-145-5p mimic與pcDNA-PHB2的共轉(zhuǎn)染顯著恢復(fù)了NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2)。上述結(jié)果說(shuō)明，miR-145-5p是通過(guò)靶定PHB2，有效抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

表5 過(guò)表達(dá)miR-125-5p后A549細(xì)胞中PHB2的表達(dá)(n=10)

表6 蛋白質(zhì)免疫印跡及EDU染色檢測(cè)3組A549細(xì)胞PHB2的表達(dá)水平(n=10)

圖2 miR-145-5p通過(guò)靶定PHB2，在體外抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3 討 論

研究已證實(shí)miRNA參與了包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6,7]。Zhang等指出miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)，參與包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。miR-145是miRNA家族的一員,屬于抗癌基因,位于染色體5q32-33。其中miR-145-5p在多種癌癥組織及細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，如甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、腸癌、肺癌等，被認(rèn)為是腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物，miR-145-5p的表達(dá)量與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后顯著相關(guān)，恢復(fù)其表達(dá)對(duì)于增強(qiáng)癌細(xì)胞的化療藥物敏感性、抑制癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)[9,10]。表明miR-145-5p在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮復(fù)雜的作用。近年與研究顯示miR-145-5p在甲狀腺癌、為此，我們?cè)噲D確定miR-145在NSCLC中的潛在作用。結(jié)果表明，miR-145-5p在NSCLC組織和細(xì)胞株中的表達(dá)明顯下調(diào)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在NSCLC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以明顯地降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此我們的研究可表明，miR-145-5p可作為NSCLC一種新型的生物標(biāo)志物。

miRNA需要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，我們利用公共生物信息學(xué)算法篩選了miR-145-5p的靶基因，并確定了PHB2，PHB2屬于抗增殖蛋白，隨著對(duì)PHBs研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)PHBs與多種細(xì)胞功能相關(guān)，如：細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡等，近年來(lái)對(duì)PHBs研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均有參與[11,12]。利用雙熒光素酶測(cè)定法進(jìn)一步證實(shí)，PHB2是miR-145-5p的直接靶標(biāo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)與miR-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，PHB2的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了miR-145-5p轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。我們的研究結(jié)果顯示miR-145-5p可通過(guò)抑制PHB2表達(dá)水平調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上，miR-145-5p可通過(guò)抑制PHB2表達(dá)水平，進(jìn)而在NSCLC疾病中發(fā)揮其抑癌作用，這可能為NSCLC的臨床診療提供新的思路。