方 平，王 婭，吳 迪，趙 婧

(1.川北醫(yī)學院，四川 南充 637100 2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，四川 南充 637000)

呼吸機相關性肺炎(VAP)是一種常見的醫(yī)院獲得性感染疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率。目前，支氣管肺泡灌洗(BAL)是醫(yī)院診斷VAP并指導治療的常用方案[1]。近年來，VAP經(jīng)常在新生兒機械通氣治療后出現(xiàn)，嚴重影響新生兒治療效果及安全。有相關文獻顯示，VAP是新生兒重癥監(jiān)護室中僅次于敗血癥的第二大院內(nèi)感染性疾病[2]。因此明確新生兒VAP進展情況并及時采取合理有效的治療措施是提高新生兒VAP存活率的關鍵。因為目前關于影響新生兒VAP發(fā)病因素的研究很少，所以本研究通過構建新生VAP小鼠模型，研究和肽素(Copeptin)、IL-32、IL-17水平變化與VAP發(fā)病因素的關系，為新生兒VAP在臨床上的診斷提供更可靠的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料:實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，4周齡，雄性，體重(18±2)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030，使用許可證號：SYXK(川)2014-189。實驗細菌：銅綠假單胞菌，菌種編號：CCTCC AB 200053，來源：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。實驗試劑：Copeptin、IL-32、IL-17 Elisa測定試劑盒購于上海茁彩生物科技有限公司，NF-κB、TLR2與TLR4抗體購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。實驗儀器：MD3000小動物肺功能測定儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)；RM2235切片機(德國徠卡公司)；Multiskan Sky酶標儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；BX43光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方 法

1.2.1實驗分組及構建VAP小鼠模型:取健康BALB/c雌性小鼠54只，隨機分為空白組、輕癥組(1×106cfu/L菌液)、重癥組(6×106cfu/L菌液)，每組18只，適應性喂養(yǎng)一周后進行實驗。除空白組外，其余各組在進行氣管插管前禁食12h，然后腹腔注射4%戊巴比妥鈉進行麻醉，固定在動物手術臺上，取仰臥位，將自制備的氣管導管在喉鏡的幫助下插入聲門，通過聽雙肺呼吸音確定導管插在氣管內(nèi)，然后將氣管導管外層與小鼠上唇縫合固定，連接小動物呼吸機控制呼吸，呼吸機設置為：潮氣量(V)5mL/kg，呼吸頻率90次/min，吸入氧濃度(FiO2)100%。為防止體位引起的肺不張，每隔30min行2～3次大VT通氣。通過股靜脈插管以3～5mL/h輸入5%的葡萄糖鹽水溶液。機械通氣持續(xù)24h后，進行肺部感染：使用微量注射器經(jīng)氣管導管快速注入0.05mL銅綠假單胞菌(PA)菌液和0.05mL的無菌氣體，并保持體位并持續(xù)5min，空白組同法給予等量生理鹽水。

1.2.2小鼠肺功能檢測:造模后第1、3、7天，各組每個時間點取6只小鼠進行麻醉，通過小動物肺功能測定儀檢測用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1)，記錄數(shù)值并計算FEV1/FVC%值。

1.2.3小鼠肺臟組織病理學檢測:造模后第7天，各組小鼠處死后采集肺臟保存于4%多聚甲醇中進行固定，用于HE染色觀察病理學改變。

1.2.4小鼠血清Copeptin、IL-32、IL-17的含量檢測:造模后第1、3、7天通過摘眼球法收集小鼠血液分離血清，使用Elisa法測定Copeptin、IL-32、IL-17的含量。

1.2.5小鼠血清Copeptin、IL-32、IL-17與肺功能指標相關性分析:根據(jù)Copeptin、IL-32、IL-17水平的檢測結(jié)果及肺功能指標，計算相關系數(shù)r和P值分析Copeptin、IL-32、IL-17與FVC，F(xiàn)EV1，F(xiàn)EV1/FVC%的相關性。

1.2.6小鼠血清Copeptin、IL-32、IL-17的ROC分析:根據(jù)Copeptin、IL-32、IL-17水平的檢測結(jié)果，采用ROC曲線分析分別計算出Copeptin、IL-32、IL-17相關AUC及95%CI值。

1.2.7免疫組織化學:造模后第7天，處死小鼠收集肺臟，使用免疫組織化學法檢測肺臟中NF-κB、TLR2與TLR4的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1小鼠肺功能檢測:對第1、3、7天各組動物進行肺功能測定發(fā)現(xiàn)，輕癥組與重癥組的FVC與FEV1均比空白組顯著性下降(P<0.05)，在7d內(nèi)下降程度隨時間的增加而增大，同時，重癥組的FVC與FEV1均比輕癥組顯著性下降(P<0.05)。計算FEV1/FVC%后發(fā)現(xiàn)，重癥組第1、3天的FEV1/FVC均小于空白組與輕癥組(P<0.05)，雖然第7天數(shù)值有所回升，但總體趨勢依然是下降，說明VAP的特征之一是肺功能下降，具體結(jié)果見表1～3。

表1 各組小鼠FVC測定情況

表2 各組小鼠FEV1測定情況

表3 各組小鼠FEV1/FVC%測定情況

2.2小鼠肺臟病理學:結(jié)果顯示，空白組肺組織外膜完整，肺臟各級支氣管分支結(jié)構正常，支氣管上皮細胞排列較為整齊，形態(tài)正常，胞質(zhì)染色均勻，未見明顯壞死；肺泡結(jié)構正常，未見明顯萎縮或肺氣腫；輕癥組肺組織外膜完整，肺臟各級支氣管分支結(jié)構較正常；肺泡結(jié)構正常，少量上皮細胞壞死；肺間質(zhì)輕微增寬，內(nèi)見少量淋巴細胞浸潤，主要分布在血管、支氣管或細支氣管周圍，未見明顯纖維組織增生；重癥組：肺組織外膜完整，肺臟各級支氣管分支結(jié)構較正常，支氣管上皮細胞排列較為整齊，未見明顯壞死；肺泡結(jié)構較正常，部分上皮細胞壞死或脫落，胞質(zhì)空泡化，胞核固縮；部分區(qū)域肺間質(zhì)明顯增寬，見大量炎細胞浸潤，主要為淋巴細胞和中性粒細胞，集中分布在血管周圍，少量分布在支氣管或細支氣管周圍；少量纖維組織增生。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠肺臟組織病理學結(jié)果(HE染色)

2.3小鼠血清Copeptin、IL-32、IL-17水平表達:Elisa檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，輕癥組與重癥組血清Copeptin、IL-32、IL-17水平在7d內(nèi)均明顯升高(P<0.05)；與輕癥組相比，重癥組的Copeptin、IL-32、IL-17水平在7d內(nèi)均明顯升高(P<0.05)，結(jié)果見表4～6。

表4 各組小鼠Copeptin測定情況

表5 各組小鼠IL-32測定情況

表6 各組小鼠IL-17測定情況

2.4小鼠血清中細胞因子與肺功能指標的相關性分析:將Copeptin、IL-32、IL-17的檢測結(jié)果與肺功能指標檢測結(jié)果進行Pearson相關性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠VAP模型中，Copeptin、IL-32、IL-17與FVC、FEV1、FEV1/FVC的關系均為負相關(P<0.01)，即肺功能指標隨Copeptin、IL-32、IL-17含量的升高而下降，結(jié)果見表7。

表7 各組小鼠細胞因子與肺功能指標的相關性分析

2.5小鼠血清中細胞因子的ROC分析:對各組的Copeptin、IL-32、IL-17檢測結(jié)果進行ROC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Copeptin、IL-32、IL-17的AUC分別為0.823、0.761與0.807(P<0.05)，詳細結(jié)果見表8。

2.6小鼠肺臟中TRL2、TRL4、NF-κB的表達結(jié)果:免疫組織化學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，輕癥組的TRL2、NF-κB與重癥組的TRL2、TRL4、NF-κB的表達水平均顯著性升高(P<0.05)；與輕癥組相比，重癥組的TRL2、NF-κB表達水平顯著性升高(P<0.05)，結(jié)果見表9，圖2。

表9 各組小鼠肺臟中TRL2 TRL4 NF-κB的表達結(jié)果

圖2 各組小鼠肺臟組織免疫組織化學結(jié)果(400×)

3 討 論

據(jù)估計，所有使用機械通氣的患者中約有9.27%會出現(xiàn)VAP，約占所有醫(yī)院獲得性肺炎病例的一半[3]。在過去的幾十年中，雖然改進機械通氣患者的綜合管理在理論上降低VAP發(fā)病率的可能性，但實際上與VAP相關的死亡率和發(fā)病率并沒有降低。目前有研究發(fā)現(xiàn)，患者在接受機械通氣超過48h后的發(fā)生肺炎的可能性比重癥監(jiān)護病房的非通氣患者高出約10倍[4]。因此機械通氣是引起潮氣量依賴性呼吸機誘發(fā)的肺部炎癥因素之一。本實驗構建了VAP小鼠改良模型，通過檢測呼吸功能與組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，VAP造成的損傷主要是呼吸功能受損與炎癥反應，具體表現(xiàn)為7d內(nèi)FVC、FEV1、FEV1/FVC%均呈明顯下降的趨勢，組織內(nèi)炎性細胞大量浸潤，淋巴細胞與中性粒細胞聚集程度嚴重，同時還伴有部分肺泡上皮細胞壞死，損傷程度與病重程度呈正比。所以，治療VAP的首要目的應該是減少炎癥反應、提高肺功能為主。

VAP造成肺部炎癥的原因是激活促炎TH1細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素1(IL-1)、γ干擾素(IFN-γ)和白介素6(IL-6)，以及肺部中性粒細胞和巨噬細胞等的聚集[5,6]。其中，Copeptin是一種與呼吸和代謝條件疾病嚴重程度密切相關的生物標志物。有研究發(fā)現(xiàn)，Copeptin在成人慢性阻塞性肺病和兒童重癥肺炎患者血清中處于高水平[7]，而且是兒童社區(qū)獲得性肺炎并發(fā)癥的良好預測因子。IL-17是一種促炎細胞因子，在中性粒細胞和其他免疫細胞到感染部位的招募中發(fā)揮重要作用[8]。IL-32則是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎因子，廣泛存在于人體的肺、結(jié)腸、肌肉、大腦等器官中，在免疫細胞和非免疫細胞中均有表達，與肺癌、關節(jié)炎、哮喘、心肌梗死和心血管疾病具有相關性[9]。因此，本實驗重點探討Copeptin、IL-32、IL-17在VAP發(fā)病進程中的作用及關聯(lián)，實驗結(jié)果顯示，輕癥組與重癥組的Copeptin、IL-32、IL-17在VAP發(fā)病的7d內(nèi)均呈上升的趨勢，說明VAP的發(fā)病伴隨著Copeptin、IL-32、IL-17的上升，屬于正向調(diào)控。進一步與肺功能進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，Copeptin、IL-32、IL-17水平與FVC、FEV1、FEV1/FVC%呈負相關，間接說明VAP通過誘導Copeptin、IL-32、IL-17上升促使肺功能下降。而隨后ROC特征結(jié)果則顯示Copeptin、IL-32、IL-17三者曲線下面積(AUC)均大于0.5，且敏感性較高，因此，臨床上對VAP的診斷可參考Copeptin、IL-32、IL-17等指標的變化，可輔助診斷早期VAP。

TLR/NF-κB通路是一條經(jīng)典的炎癥通路，通過激活NF-κB促進基因的表達，介導下游炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄大量的炎性與免疫蛋白，從而引發(fā)疾病。TLR2與TLR4均是此通路中的關鍵蛋白，TLR2與TLR4在炎癥與免疫反應中對IL-17、IL-32均有調(diào)控作用[10]。在本研究中，通過免疫組織化學法對小鼠肺臟中的TRL2、TRL4、NF-κB蛋白表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)VAP持續(xù)7d后，輕癥組與重癥組這3個蛋白的表達量均有所上升，且重癥組比較明顯。由此說明，持續(xù)的VAP可以激活肺臟中的TLR/NF-κB信號通路，導致炎癥細胞聚集，Copeptin、IL-32、IL-17的分泌增多，最終引發(fā)炎癥反應，降低肺功能。

綜上所述，本研究從肺功能、病理改變與炎癥反應3方面探討了VAP的發(fā)病因素，初步明確了VAP的發(fā)病與機體內(nèi)TLR/NF-κB信號通路的激活，Copeptin、IL-32、IL-17含量增加以及肺功能下降三者間具有密切關聯(lián)性，但具體調(diào)控機制尚未明確，后續(xù)實驗將進一步探討VAP與Copeptin、IL-32、IL-17以及TLR/NF-κB信號通路的關系。