韓翌 張愛平 韓建平 吉建 曹文俊

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗科 上海 200031)

眼部標(biāo)本涂片鏡檢是一種經(jīng)典的檢驗學(xué)方法，常用于輔助診斷眼部感染性疾病。眼部感染性疾病可由細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒等引起，其中，細(xì)菌及真菌是最常見的致病菌[1]，臨床上涂片標(biāo)本可分為細(xì)菌涂片及真菌涂片2種。涂片鏡檢不僅可以快速了解標(biāo)本中有無致病菌，而且可以根據(jù)致病菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性對致病菌進(jìn)行初步判斷，從而對眼部感染性疾病的早期診斷和治療有著十分重要的意義。本研究對本院2014年6月~2019年9月間的眼部標(biāo)本細(xì)菌涂片及真菌涂片結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，討論致病菌感染的變遷規(guī)律，并與培養(yǎng)結(jié)果比對來評估涂片結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期對眼部感染性疾病的診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 連續(xù)收集本院2014年6月~2019年9月間送檢的眼部標(biāo)本細(xì)菌涂片5 206例、真菌涂片5 345例，眼部標(biāo)本類型為角膜組織刮片、玻璃體液及房水。其中，3 421份標(biāo)本同時送檢細(xì)菌涂片與細(xì)菌培養(yǎng)；3 327份標(biāo)本同時送檢真菌涂片與真菌培養(yǎng)。

1.2 方法 眼部標(biāo)本的采集方式按照《感染性眼病細(xì)菌學(xué)檢查操作專家共識(2019)》[2]，由經(jīng)過培訓(xùn)的臨床醫(yī)務(wù)工作人員取出，并依照醫(yī)囑制備為涂片或培養(yǎng)。送檢涂片及培養(yǎng)的標(biāo)本組織來源一致。

細(xì)菌涂片使用BASO革蘭染色液進(jìn)行革蘭染色后鏡檢；真菌涂片使用Biomedomics熒光染色液染色后用熒光顯微鏡鏡檢。操作符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》。

細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本于35 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d；真菌培養(yǎng)標(biāo)本接種于沙保弱培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。細(xì)菌鑒定使用全自動細(xì)菌鑒定儀(MicroScanAutoScan-4，貝克曼庫爾特公司，美國)，質(zhì)控菌株選用ATCC 29213金黃色葡萄球菌、ATCC 29212糞腸球菌、ATCC 27853銅綠假單胞菌、ATCC 25922大腸埃希菌；真菌鑒定采用真菌壓片法根據(jù)真菌形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定。操作符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計細(xì)菌涂片、真菌涂片的陽性率情況、菌種分布，各月份的陽性率變化規(guī)律，并與相應(yīng)培養(yǎng)結(jié)果做對比。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料的組間差異應(yīng)用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析 本研究共收集眼部細(xì)菌涂片標(biāo)本5 206份，其中陽性標(biāo)本792份，陽性率為15.21 %。陽性標(biāo)本患者年齡為0~94歲，平均年齡(46.91±22.21)歲。不同年齡段陽性率見表1。792份陽性標(biāo)本中，541份來自男性，251份來自女性，男女比例為1:0.46。陽性標(biāo)本中致病菌主要為革蘭陽性球菌(占89 %)，具體菌種分布見圖1。

表1 眼部細(xì)菌涂片標(biāo)本送檢數(shù)及陽性分布

圖1 792例細(xì)菌涂片陽性菌種分布 致病菌主要為革蘭陽性球菌(占 89 %)。

共收集眼部真菌涂片標(biāo)本5 345份，其中陽性標(biāo)本463份，陽性率為8.66 %。陽性標(biāo)本患者年齡為1~94歲，平均年齡(56.32±14.98)歲。不同年齡段陽性率見表2。463份陽性標(biāo)本中，276份來自男性，187份來自女性，男女比例為1:0.68。

表2 眼部真菌涂片標(biāo)本送檢數(shù)及陽性分布

2.2 眼部各類型標(biāo)本陽性率分布 本研究標(biāo)本類型分為角膜組織刮片、玻璃體液及房水。細(xì)菌涂片標(biāo)本中角膜組織刮片3 200/5 206例、玻璃體液1 508/5 206例、房水498/5 206例，真菌涂片標(biāo)本中角膜組織刮片3 507/5 345例、玻璃體液1 334/5 345例、房水504/5 345例。角膜組織刮片主要取自角膜炎患者，其細(xì)菌涂片及真菌涂片的陽性率分別為11.16 %(357/3 200)與12.32 % (432/3 507)；玻璃體液與房水主要取自眼外傷與眼內(nèi)炎患者，其涂片結(jié)果均以細(xì)菌陽性為主，玻璃體液細(xì)菌涂片陽性率為22.61 % (341/1 508)，真菌涂片陽性率僅2.17 % (29/1 334)；房水細(xì)菌涂片陽性率為18.88 %(94/498)，真菌涂片陽性率僅0.40 % (2/504)。

2.3 涂片陽性率隨月份變化趨勢 細(xì)菌涂片陽性率普遍表現(xiàn)為隨氣溫升高而升高，在夏季達(dá)到巔峰；而真菌涂片陽性率則集中表現(xiàn)為秋季(9、10月份)明顯增高。但不同年份之間變化趨勢并不完全一致(圖2)。

圖2 涂片陽性率隨月份變化趨勢 A.細(xì)菌涂片陽性率夏季較高；B.真菌涂片陽性率秋季較高。

2.4 涂片與培養(yǎng)符合性分析 細(xì)菌涂片共檢出陽性551/3 421份，其中與培養(yǎng)陽性相符246/551份；細(xì)菌涂片陰性結(jié)果2 870/3 421份，其中與培養(yǎng)陰性結(jié)果相符2 441/2 870份,由此可見細(xì)菌涂片與培養(yǎng)診斷符合率為78.54 %。真菌涂片共檢出陽性233/3 327例，其中與真菌培養(yǎng)陽性相符159/233例；真菌涂片陰性結(jié)果3 094/3 327份，其中與真菌培養(yǎng)陰性結(jié)果相符2 861/3 094份，由此可見真菌涂片與培養(yǎng)診斷符合率為90.77 %。表3可知角膜組織刮片、玻璃體液標(biāo)本培養(yǎng)陽性率高于涂片(P<0.05)，而房水標(biāo)本培養(yǎng)與涂片陽性率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。305份(9 %)細(xì)菌涂片標(biāo)本為涂片陽性而培養(yǎng)陰性，74份(2 %)真菌涂片標(biāo)本為涂片陽性而培養(yǎng)陰性。

表3 涂片與培養(yǎng)陽性率比較

3 討論

眼部感染性疾病仍然是致盲的重要原因，并已成為世界性的具有挑戰(zhàn)性的公共衛(wèi)生問題[3]。細(xì)菌性角膜炎會在角膜表面形成不規(guī)則瘢痕，導(dǎo)致視力減退[1]；眼部真菌感染病程相對緩慢，致盲率較高，當(dāng)混合細(xì)菌感染時,可加快、加重病情進(jìn)展[4]。因此，早期、準(zhǔn)確的診斷是有效治療眼部感染性疾病的關(guān)鍵[3]。為檢出眼部標(biāo)本中是否存在細(xì)菌、真菌感染，目前臨床上常使用涂片法與培養(yǎng)法，也有文獻(xiàn)提到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)法可作為培養(yǎng)法的補(bǔ)充，PCR法通量高、速度快，但無法檢測出預(yù)期范圍之外的病原體[5]。培養(yǎng)法被認(rèn)為是細(xì)菌、真菌感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，對細(xì)菌、真菌種類可準(zhǔn)確鑒別，同時能有效反映藥物敏感度，為臨床抗菌藥物使用提供重要依據(jù)[6]，但培養(yǎng)法耗時長，且難以觀察細(xì)菌、白細(xì)胞間關(guān)系以及菌群相對量。標(biāo)本涂片鏡檢操作具反復(fù)性、便捷性，可即時獲取檢查結(jié)果，甚至可當(dāng)即得出診斷[7]，對眼部感染性疾病的快速診療及及時用藥意義重大。

本研究表明，眼部細(xì)菌及真菌感染均多見于成人患者，其中男性比例高于女性，這可能與成年男性作為主要勞動人群，更容易產(chǎn)生機(jī)會性外傷有關(guān)[8]。而細(xì)菌涂片陽性率最高的人群為≤14歲的兒童，可能是由于兒童眼外傷較多所致；真菌涂片陽性率最高的人群為＞60歲的老人，可能與老人免疫功能較弱有關(guān)。眼部細(xì)菌涂片陽性的樣本中，絕大部分致病菌為革蘭陽性球菌，這與眼部感染性疾病細(xì)菌培養(yǎng)的既往報道[8-11]結(jié)論一致。近年來，因廣譜抗生素及免疫抑制劑的廣泛使用導(dǎo)致眼表菌群失調(diào)，條件致病菌，尤其是酵母樣真菌的易感性增加[12]。

本研究中角膜組織刮片主要取自角膜炎患者，其細(xì)菌涂片陽性率與真菌涂片陽性率相近。有研究[13]表明，真菌性角膜炎是亞洲地區(qū)失明的主要原因，占感染性角膜炎近一半，尤其是在熱帶和亞熱帶國家；然而，這種感染在溫帶地區(qū)相對罕見，而發(fā)達(dá)國家和北美高比例的角膜潰瘍是由細(xì)菌引起的。本研究中玻璃體液與房水主要取自眼外傷與眼內(nèi)炎患者，而玻璃體液及房水的結(jié)果以細(xì)菌涂片陽性為主，且玻璃體液標(biāo)本的陽性率比同時抽取的房水標(biāo)本高，此結(jié)果與之前培養(yǎng)報道[14]相符。同時提示眼科醫(yī)師送檢眼外傷與眼內(nèi)炎標(biāo)本時，應(yīng)盡量選擇玻璃體液送檢，或者玻璃體液、房水同時送檢。眼內(nèi)炎按其病因可分為外源性和內(nèi)源性，其中以外源性多見。眼外傷由于破壞了眼球的完整性，致使微生物更易進(jìn)入眼內(nèi)，因此是導(dǎo)致外源性眼內(nèi)炎發(fā)生的最常見原因[15]，故而本研究中眼外傷與眼內(nèi)炎的致病菌檢出情況較為相似。由于真菌感染潛伏期長，且發(fā)病緩慢[16]，而眼外傷為眼部急癥，因此這兩種疾病中真菌檢出率較低。

本研究發(fā)現(xiàn)真菌涂片的陽性率具有明顯的季節(jié)變化。由于本研究中真菌檢出主要在角膜組織刮片標(biāo)本中，而真菌性角膜炎的發(fā)病又與氣候因素有關(guān)[16]，梅雨季節(jié)溫暖潮濕，利于曲霉屬等孢子發(fā)達(dá)真菌的孢子播散[17]；且秋季農(nóng)忙，植物性角膜外傷機(jī)會性增多，更容易導(dǎo)致真菌感染，因此在9、10月份真菌感染檢出率明顯增高；細(xì)菌涂片陽性率增高集中表現(xiàn)在夏季，可能與夏季氣候炎熱，適于細(xì)菌生長有關(guān)。

本研究中涂片結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果符合率較高，涂片陽性率低于培養(yǎng)，與既往文獻(xiàn)[18]報道一致。涂片的陽性檢出率與涂片的取材與制備、檢驗人員的染色與鏡檢能力均有關(guān)。涂片陽性率低于培養(yǎng)可能是眼部標(biāo)本量少，一般優(yōu)先用于培養(yǎng)，而涂片所需的菌量遠(yuǎn)大于培養(yǎng)所需的菌量，易造成涂片漏檢的情況；且房水、玻璃體液樣本在經(jīng)過24~48 h的肉湯增菌后，敏感性也會相應(yīng)提升[19]。本研究結(jié)果提示仍有部分標(biāo)本是涂片陽性而培養(yǎng)陰性的，這可能的原因是：①在病原菌培養(yǎng)前，臨床醫(yī)師已使用抗生素，抑制了細(xì)菌的生長；②培養(yǎng)基的選擇錯誤，使某些條件要求高的細(xì)菌可能無法生長或生長緩慢，如L型細(xì)菌、苛養(yǎng)菌及厭氧菌等[20]。此外，涂片結(jié)果陽性率與標(biāo)本的準(zhǔn)確取出有非常重要的關(guān)系，臨床科室良好的取材是涂片結(jié)果準(zhǔn)確的保障。

綜上所述，眼部標(biāo)本涂片檢驗在眼部感染性疾病的早期診斷中有著重要意義。本研究從涂片結(jié)果分析，一定程度上反映了眼部感染性疾病致病菌的分布特征、陽性率、易感人群，以及致病菌的變遷規(guī)律，有助于為臨床診斷、治療提供依據(jù)。