宋洋 楊仁義 周德生 傅馨瑩 劉利娟 顏思陽 陸展輝 陳瑤

摘要 目的：利用GEO芯片數(shù)據(jù)及中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)，獲取氣虛血瘀型腦梗死的差異基因及中醫(yī)藥防治方劑，并分析其作用機制，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治策略提供理論依據(jù)。方法：采用生物信息學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等多學(xué)科交叉方法，對氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治策略進行探討。整合基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP）、GeneCards、PubChem、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、STRING、WebGestalt、DAVID多數(shù)據(jù)庫資源及Cytoscape、R語言軟件工具，對氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點、中藥靶點進行篩選，從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集的角度，對中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)數(shù)據(jù)挖掘獲取的氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方的作用機制進行探討。結(jié)果：獲取2 542個氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點，其中差異基因結(jié)果顯示HIF1A、PIK3CA、PIK3R1、TP53、NFKB1、HSP90AA1、CREBBP、CASP8、IL6、TNF、ITGB等表達上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等表達下調(diào)，可作為疾病診斷治療的潛在靶點。58首氣虛血瘀型腦梗死方劑的用藥規(guī)律，包括頻次、關(guān)聯(lián)及新方組合，獲得氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方劑，由黃芪、川芎、當歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實10味中藥組成，具有益氣活血、行氣化痰的功效，其作用機制可能與調(diào)控差異基因以多組分、多功能、多途徑的方式，主要通過HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等通路發(fā)揮作用。結(jié)論：氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當以差異基因靶點為中心，篩選出臨床基礎(chǔ)方，根據(jù)臨床辨證施治加減中藥，同時可采用多學(xué)科交叉方法對氣虛血瘀型腦梗死的方劑從多組分、多途徑、多靶點層面進行臨床與實驗驗證。本研究為中醫(yī)藥治療氣虛血瘀型腦梗死提供了方法理論上的指導(dǎo)，對推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要意義。

關(guān)鍵詞 氣虛血瘀;腦梗死;基因表達綜合數(shù)據(jù)庫;差異基因;中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Analysis of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment Strategy of Cerebral Infarction of Qi Deficiency and Blood Stasis Based on GEO Data and TCM Inheritance Auxiliary System

SONG Yang1，YANG Renyi2，ZHOU Desheng1，F(xiàn)U Xinying2，LIU Lijuan1，YAN Siyang2，LU Zhanhui2，CHEN Yao1

（1 The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China; 2 Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To use GEO chip data and traditional Chinese medicine inheritance auxiliary system to obtain the differential genes and traditional Chinese medicine prevention and treatment prescriptions of cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis type，and to analyze its mechanism，so as to provide theoretical basis for the prevention and treatment strategy of traditional Chinese medicine of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction.Methods：The prevention and treatment strategy of traditional Chinese medicine for cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis was discussed by means of bioinformatics，data mining，network pharmacology and other interdisciplinary methods.Integrate GEO，TCMIP，GeneCards，PubChem，TCMSP，String，WebGestalt，DAVID multi-database resources and Cytoscape，R language software tools to screen disease targets and traditional Chinese medicine targets of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction.From the point of view of PPI network，GO and KEGG enrichment，the mechanism of the basic side of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction obtained by data mining of TCM inheritance auxiliary system were discussed.Results：A total of 2542 disease targets of cerebral infarction with qi deficiency and blood stasis were obtained.The results of differential genes showed that the expressions of HIF1A，PIK3CA，PIK3R1，TP53，NFKB1，HSP90AA1，CREBBP，CASP8，IL6，TNF and ITGB were up-regulated，while the expressions of APOE，IGF1，CXCL5，SRC，ADCY5 and PTGS2 were down-regulated，which can be used as potential targets for disease diagnosis and treatment.A total of 58 the medication rule of the first qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction prescription，including frequency，correlation and new prescription combination，to obtain the basic prescription of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction，which is composed of Astragali Radix，Ligusticum chuanxiong Hort，Angelica sinensis （Oliv.） Diels，Pheretima，Codonopsis Radix，Panacis Quinquefolii Radix，Atractylodes macrocephala Koidz，Persicae Semen，Paeoniae Rubra Radix，Aurantii Immaturus Fructus，which have the effect of replenishing qi and activating blood circulation，promoting qi and resolving phlegm，and its action mechanism may be related to the regulation of differential genes in a multi-component，multi-functional and multi-channel way.It plays a role mainly through HIF-1，TNF，NF-kappaB，Apoptosis，PI3K-AKT and other pathways.Conclusion：The prevention and treatment of cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis type by traditional Chinese medicine should focus on the target of different genes，select the clinical basic prescription，and add or subtract traditional Chinese medicine according to clinical syndrome differentiation.At the same time，multi-disciplinary interdisciplinary method can be used to verify the clinical and experimental results of traditional Chinese medicine in the treatment of qi deficiency and blood stasis cerebral infarction from multi-component，multi-pathway and multi-target levels.This study provides theoretical guidance for the treatment of qi deficiency and blood stasis cerebral infarction with traditional Chinese medicine.It is of great significance to promote the modernization of traditional Chinese medicine.

Keywords Qi deficiency and blood stasis; Cerebral infarction; GEO; Differential gene; Inheritance assistant system of traditional Chinese medicine; Network pharmacology

中圖分類號：R285;R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.008

腦梗死屬中醫(yī)“缺血中風(fēng)”范疇[1]，是老年人常見病與多發(fā)病，被歷代醫(yī)家視作“風(fēng)勞鼓膈”四大難證之首。腦梗死發(fā)病率、致殘率排名世界第一，現(xiàn)已超過癌癥，成為我國首位死亡因素[2]。氣虛血瘀是腦梗死的關(guān)鍵病機[3]，歷代醫(yī)家以氣虛血瘀這一病理因素，結(jié)合益氣活血治法，創(chuàng)制了大量臨床有效的方劑（如補陽還五湯），為中醫(yī)藥防治腦梗死疾病做出了巨大貢獻。在長期臨床實踐過程中，益氣活血治法理論指導(dǎo)下的益氣、活血中藥種類繁多且作用機制尚不明確，因此精準篩選新方并探討其潛在作用機制，對提高療效至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代科學(xué)及計算機算法的不斷發(fā)展，本研究整合基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）芯片數(shù)據(jù)，同時應(yīng)用中醫(yī)傳承輔助平臺[4]，探討氣虛血瘀型腦梗死的潛在靶點及中醫(yī)藥防治組方規(guī)律，并對中醫(yī)藥防治氣虛血瘀型腦梗死的潛在靶點進行系統(tǒng)分析，為臨床開發(fā)新藥提供理論及實踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 氣虛血瘀型腦梗死疾病的靶點篩選

通過美國國家生物技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）子數(shù)據(jù)庫，以“Cerebral infarction”為檢索詞，獲取GSE100235數(shù)據(jù)集，下載sham組與QDBS/MCAO（QXXY）組大鼠基因芯片數(shù)據(jù)。采用R語言對正常組，即sham組（GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545）;氣虛血瘀型腦梗死組，即QDBS/MCAO組（GSM2675546、GSM2675547、GSM2675548）進行差異性分析。對數(shù)據(jù)進行歸一化處理及主成分分析，并繪制箱式圖與主成分分析圖，以logFC≥1與adj.P.Val<0.05為差異基因篩選條件，篩選出氣虛血瘀型腦梗死的靶點，并繪制火山圖。

通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）[5]（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）數(shù)據(jù)庫，采用“整合藥理學(xué)分析工具集合”中證型靶點分析工具，以“反向篩選”為方式，檢索并導(dǎo)出“氣虛血瘀證”相關(guān)靶點。同時通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Cerebral infarction”為檢索詞，檢索并導(dǎo)出“腦梗死”疾病相關(guān)靶點。繪制“氣虛血瘀證”與“腦梗死”相關(guān)靶點韋恩圖，交集獲得氣虛血瘀型腦梗死的靶點。

取GEO數(shù)據(jù)庫與GeneCards、TCMIP數(shù)據(jù)庫中分別獲取的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點的并集，采用Excel去除重復(fù)值保留唯一值，最終獲取整合后氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點。

1.2 氣虛血瘀型腦梗死方劑組方規(guī)律及基礎(chǔ)方探討

檢索國家知識基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）中收錄的氣虛血瘀型腦梗死的方劑，采用中醫(yī)傳統(tǒng)輔助平臺系統(tǒng)中數(shù)據(jù)挖掘功能，以分析其用藥規(guī)律。

方劑來源：以“腦梗死”“氣虛血瘀”“缺血性中風(fēng)”“缺血性腦卒中”“缺血中風(fēng)”“缺血卒中”為檢索詞，在CNKI中獲取氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)有效方劑。

方劑篩選：1）符合公認的氣虛血瘀型腦梗死的診斷標準;2）納入中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療氣虛血瘀型腦梗死的文獻、醫(yī)案、思想研究所提供的方藥;3）排除慢性繼發(fā)性疾?。ㄈ缣悄虿。┑纫鹉X梗死的文獻，排除資料不完整、無明確藥物組成或藥物不全的文獻。

錄入及分析：采用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）錄入上述方劑，參照《中華人民共和國藥典》對中藥藥名進行歸一化處理，由雙人審核以確保數(shù)據(jù)錄入準確性。采用“數(shù)據(jù)-方劑”分析功能對方劑藥物頻次統(tǒng)計、組方規(guī)律進行分析，并篩選出氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)防治新方劑，即為氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方。

1.3 氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點篩選

基于中醫(yī)傳承輔助平臺頻次統(tǒng)計、關(guān)聯(lián)分析及熵層次聚類分析，同時結(jié)合新方劑中各中藥功效主治及益氣活血治法，篩選出黃芪、川芎、當歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實10味中藥作為防治氣虛血瘀型腦梗死的基礎(chǔ)方。

氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方有效成分收集：1）利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[6]（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以人體藥代動力學(xué)ADMT[7]參數(shù)中口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%;藥物類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件，獲取黃芪、川芎、當歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實10味中藥有效成分。2）通過PubChem[8]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫收集各有效成分SDF結(jié)構(gòu)式。

氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點收集：通過Swiss Target Prediction[9]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，將有效成分導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，獲取氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點。

將材料與方法1.1中氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點（以下稱：疾病靶點）與氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點（以下稱：中藥靶點）取交集，獲取氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治靶點（以下稱：防治靶點），并繪制韋恩圖。

1.4 氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將防治靶點導(dǎo)入String[10]（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)定模式為“Multiple Protenin”、物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)信息，同時采用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化及Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析。

1.5 防治靶點基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

采用WebGestalt[11]（http：//www.webgestalt.org/#）數(shù)據(jù)庫，采用ORA（Over-Representation Analysis，ORA）算法，將防治靶點導(dǎo)入，進行基因本體（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，收集生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細胞成分（Cell Component，CC）、KEGG富集分析數(shù)據(jù)，同時進行權(quán)重分析，并繪制火山圖[12]。

采用DAVID[13]（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫對防治靶點進行KEGG富集分析，結(jié)合校正P值及文獻報道選取氣虛血瘀型常用通路與防治靶點關(guān)系，并繪制弦圖，以進一步對防治靶點與通路進行關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 氣虛血瘀型腦梗死疾病的靶點篩選結(jié)果

通過GEO數(shù)據(jù)集，采用R語言affyPLM與limma包對數(shù)據(jù)集進行歸一化及差異分析，并繪制箱式圖（、主成分分析圖及火山圖。對差異基因進行ID轉(zhuǎn)換及K最近鄰（K-Nearest Neighbor，KNN）法補充缺失值后，共篩選出2 080個氣虛血瘀型腦梗死相關(guān)靶點，其中1 817個表達上調(diào)（如：SAMD9L、CAST、IGSF6、HIF-1A等），263個表達下調(diào)（如APOE、FGG、IGF1等）。見圖1A～C。

通過TCMIP數(shù)據(jù)庫證型檢索與GeneCards數(shù)據(jù)庫疾病檢索，結(jié)合韋恩圖分析，獲取數(shù)據(jù)庫中氣虛血瘀型腦梗死相關(guān)靶點共543個（如：AKT1、APP、JUN、VEGFA等）。采用Excel軟件去除重復(fù)值保留唯一值，整合GEO芯片數(shù)據(jù)及GeneCards、TCMIP數(shù)據(jù)庫中分別獲取的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點共2 542個。見圖2。

2.2 氣虛血瘀型腦梗死方劑組方規(guī)律及基礎(chǔ)方探討

2.2.1 中藥頻次統(tǒng)計結(jié)果

本研究共納入58首方劑，含中藥95味，采用“頻次統(tǒng)計”方法，得到頻次≥9次的中藥共16味，位列前3的分別為黃芪、川芎、當歸。見表1。

2.2.2 氣虛血瘀型腦梗死組方規(guī)律關(guān)聯(lián)分析結(jié)果? 采用關(guān)聯(lián)規(guī)則分析方法，支持度=11，獲取常用中藥藥對、藥串共243組，其中有42組頻次≥25;繪制關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡(luò)圖。見表2，圖3。

2.2.3 氣虛血瘀型腦梗死熵層次聚類新方分析結(jié)果

采用“新方分析”，相關(guān)度=8，懲罰度=3，基于核心組合進行熵層次聚類分析，獲得3味藥核心組合17個;藥物組合聚合成新方，形成氣虛血瘀型腦梗死的5個新方，處方1：全蝎，蜈蚣，赤芍，桃仁，白芍，丹參，三七;處方2：桃仁，當歸，赤芍，枳實，白術(shù);處方3：川芎，黨參，西洋參，黃芪;處方4：牛膝，甘草，木瓜，枳實;處方5：黃芪，地龍，西洋參，白術(shù)，繪制網(wǎng)絡(luò)展示圖。見表3，圖4。

2.3 氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共獲取904個中藥靶點，將疾病靶點與中藥靶點進行韋恩圖分析，獲取防治靶點共314個（如HIF1A、BCL2、JAK1等）。見圖5A。

PPI網(wǎng)絡(luò)中共314個節(jié)點，1 306條邊，平均節(jié)點度為8.32，平均聚類系數(shù)為0.49，P值<1.0e-16，根據(jù)PPI次數(shù)（即：Degree值）多少設(shè)置節(jié)點大小，Degree值越大節(jié)點越大。見圖5B。Degree、Closeness、Betweenness算法前20靶點結(jié)果見表4，拓撲分析結(jié)果見圖5C～E。

2.4 氣虛血瘀型腦梗死防治靶點GO和KEGG富集分析結(jié)果 通過WebGestalt與DAVID數(shù)據(jù)集對防治靶點進行BP、CC、MF、KEGG分析，BP結(jié)果顯示，314個防治靶點富集于468個生命進程，主要與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、白細胞分化、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)控等有關(guān);CC結(jié)果顯示，314個防治靶點富集于29個細胞組分，主要與膜區(qū)、突觸膜、受體復(fù)合物等有關(guān);MF結(jié)果顯示，314個防治靶點富集于77個分子功能，主要與神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、銨離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子與受體DNA結(jié)合調(diào)控等有關(guān);KEGG結(jié)果顯示，314個防治靶點富集于166個信號通路，主要與神經(jīng)活性受體-配體相互作用通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路等有關(guān)。見圖6A～D。

對KEGG富集信號通路結(jié)果進一步關(guān)聯(lián)分析，篩選出P<0.05的常見氣虛血瘀型腦梗死信號通路12條，整合Degree、Closeness、Betweenness算法前20防治靶點，刪除無通路對應(yīng)的靶點并保留唯一靶點后，根據(jù)通路與靶點對應(yīng)關(guān)系繪制“防治靶點-通路”弦圖，以尋找12條常見通路中富集的防治靶點。見圖6E。

3 討論

腦梗死是臨床常見病、多發(fā)病，氣虛血瘀型腦梗死理論源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認為其發(fā)生發(fā)展與氣血相關(guān)，氣血虧虛，血流無力，氣凝血滯，瘀阻腦絡(luò)，發(fā)為中風(fēng)，故而半身不遂，發(fā)為偏枯。清代王清任基于氣虛血瘀理論辨治腦梗死，創(chuàng)立經(jīng)典的補陽還五湯，奠定了臨床氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的理論實踐基礎(chǔ)。歷代醫(yī)家認為氣虛血瘀是腦梗死的重要病機，同時整合臨床實踐創(chuàng)立了大量的氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的方劑，如當歸補血湯、清陽湯等臨床常用方劑，但辨證論治理論指導(dǎo)下的臨床加減及客觀化相對局限，作用機制尚不明確，因此精準篩選氣虛血瘀型腦梗死疾病的中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方，并探討其作用機制具有重要意義。

GEO數(shù)據(jù)庫收集了大量微陣列芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)及統(tǒng)計方法，分析疾病差異表達基因譜，為疾病防治提供基因靶點，是靶點分析常用數(shù)據(jù)庫之一。中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)以數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)拓撲分析為基礎(chǔ)，能對中醫(yī)藥原始數(shù)據(jù)進行二次的聚類熵層次分析，以關(guān)聯(lián)方式篩選出新的方劑。本研究綜合GEO芯片、TCMIP、GeneCards等多數(shù)據(jù)庫資源，采用生物信息學(xué)方法，篩選出氣虛血瘀型腦梗死的差異基因，為臨床診斷及防治提供了靶點依據(jù)。同時采用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治方劑進行數(shù)據(jù)挖掘及規(guī)律分析，篩選出臨床基礎(chǔ)方，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供藥物依據(jù)。最后關(guān)聯(lián)靶點與藥物分析結(jié)果，通過GO與KEGG富集分析，初步探討氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方的作用機制。

本研究通過GEO、TCMIP、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取2 542個氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點，其中差異基因結(jié)果顯示HIF1A、PIK3CA、PIK3R1、TP53、NFKB1、HSP90AA1、CREBBP、CASP8、IL6、TNF、ITGB等表達上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等表達下調(diào)，能在氣虛血瘀型腦梗死疾病中差異表達，可作為疾病診斷治療的潛在靶點。已有研究證實，益氣活血理論指導(dǎo)下的方劑、中藥、有效成分能通過調(diào)控差異基因，在氣虛血瘀型腦梗死疾病的防治中發(fā)揮重要作用。張芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)益氣活血治法立方的益血方能上調(diào)HIF1A與Ang-2表達，促進腦梗死后血管新生，從而改善腦梗死后腦組織損傷。付蓓蓓等[15]研究發(fā)現(xiàn)益氣中藥黃芪中主要有效成分黃芪甲苷能降低白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、核因子κB等分子表達水平，改善腦梗死后炎癥反應(yīng)，促進急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，基于GEO等數(shù)據(jù)庫差異分析的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點，可為氣虛血瘀型腦梗死證型、疾病、診斷、治療提供潛在靶點，為后續(xù)臨床及基礎(chǔ)實驗驗證提供理論依據(jù)。

本研究基于中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)分析了58首氣虛血瘀型腦梗死方劑的用藥規(guī)律，包括頻次、關(guān)聯(lián)及新方組合。中藥頻次分析結(jié)果以活血化瘀藥、補虛藥為主，如川芎、紅花、桃仁、丹參、三七、雞血藤活血化瘀，黃芪、當歸、黨參、甘草補虛，兼以全蝎、地龍平肝熄風(fēng)，桂枝解表，赤芍清熱等，因此氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當以益氣補虛、活血化瘀為主，隨證加減可增強其療效。其中中藥頻次結(jié)果中最高的3味中藥依次為黃芪、川芎及當歸，藥對、藥串頻次結(jié)果中補氣-活血的藥對、藥串為多，如桃仁、黃芪，黃芪、水蛭，桃仁、黃芪、地龍，桃仁、黃芪、當歸，黃芪、當歸、地龍。單純活血化瘀的藥對、藥串頻次也較高，如桃仁、當歸，川芎、紅花、當歸。新方聚類藥物組合中，亦以活血化瘀與補虛為基礎(chǔ)，類似中風(fēng)經(jīng)方如補陽還五湯、桃紅四物湯。同時分析其他治療原則包括：開竅、化痰、滋補肝腎、健脾除濕等功效，提示方藥并非全以補氣活血為主，同時配伍呈現(xiàn)出多樣性，如處方1以活血開竅藥物組合為主，處方2以理氣活血藥物組合為主，處方4以化痰活血通絡(luò)藥物組合為主?？梢姡钛?、補氣在中風(fēng)氣虛血瘀證中極其重要，臨證選擇以益氣活血為主法，同時輔以開竅、清熱、解表、化痰等治法。

腦梗死屬于中醫(yī)“缺血中風(fēng)”范疇，《醫(yī)林改錯》云：“人過半百元氣已虛，氣虛無力推動血行，使之瘀血偏滯于體，乃罹患偏癱?！碧岢鰵馓撗鰧W(xué)說。中老年人，臟腑虧虛，或久病體虛，氣虛無力，氣行則血運，氣虛則血瘀，瘀阻腦絡(luò)而不通，腦竅失養(yǎng)，發(fā)為中風(fēng);陰血虧虛，陰陽失衡，陰無以制陽，虛陽上浮，肝陽上亢，肝風(fēng)內(nèi)動，瘀血、痰濁隨風(fēng)而動，阻滯腦竅，發(fā)為中風(fēng)，故氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當以益氣活血為主，輔以行氣、化痰、通絡(luò)的中藥，整合本研究頻次、關(guān)聯(lián)及新方結(jié)果，提出黃芪、川芎、當歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實10味中藥可作為氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的基礎(chǔ)方，方中黃芪、川芎、當歸為君，行益氣、活血化瘀之功;地龍、黨參、西洋參為臣，主以通絡(luò)、益氣生津之效;桃仁、赤芍為佐，輔以活血、行氣化瘀之功;白術(shù)、枳實為使，配以祛濕、行氣化痰之效，共奏益氣活血、行氣化痰之功效，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供了藥物治療方案。

為進一步探討氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方在中醫(yī)藥防治中的作用機制，本研究整合TCMSP、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt、DAVID數(shù)據(jù)庫，篩選出基礎(chǔ)方的中藥靶點，取中藥靶點與疾病靶點獲取共同的防治靶點，并對防治靶點進行PPI、GO、KEGG作用機制探討，結(jié)果顯示共有314個防治靶點在氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方防治中發(fā)揮作用。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)Degree、Closeness、Betweenness算法拓撲分析結(jié)果提示，其防治作用主要與APP、PIK3CA、PIK3R1、TP53、CASR、SRC、AKT1、ADCY5、ADCY1、MAPK3、NFKB1、HSP90AA1、JUN、VEGFA、NR3C1、CASP8、IL6、TNF等靶點有關(guān)。結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果提示其防治作用機制：主要在膜區(qū)、突觸膜、受體復(fù)合物等細胞組分，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、銨離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子與受體DNA結(jié)合調(diào)控等分子功能，通過神經(jīng)活性受體-配體相互作用通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路等，參與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、白細胞分化、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)控等生命進程。

整合氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，結(jié)合“防治靶點-通路”弦圖分析，12條氣虛血瘀型腦梗死常見通路與前20個防治靶點關(guān)聯(lián)，如HIF-1信號通路中主要富集PIK3CA、PIK3R1、AKT1、MAPK3、NFKB1、CREBBP、VEGFA、IL6;TNF信號通路、NF-kappa B信號通路、Apoptosis信號通路、PI3K-AKT信號通路、Toll樣受體信號通路、Rap1信號通路、AMPK信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路、Wnt信號通路靶點富集結(jié)果如弦圖所示。以HIF-1信號通路為例，進一步結(jié)合GEO芯片數(shù)據(jù)差異基因分析結(jié)果，可初步得出氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方能通過上調(diào)HIF1A（HIF-1α）、PIK3CA（PI3K）、PIK3R1、NFKB1（NF-κB）、CREBBP、IL6、TNF等靶點，下調(diào)APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等靶點，從而在氣虛血瘀型腦梗死疾病中發(fā)揮作用。已有研究證實在益氣活血理論指導(dǎo)下的方劑，如復(fù)方景川片[16]能上調(diào)HIF1A表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，從而改善腦缺血損傷;益氣通脈湯[17]輔助西醫(yī)綜合干預(yù)在腦梗死急性期能調(diào)控HIF1A與TNF靶點水平，改善缺血區(qū)腦血流灌注障礙，降低急性腦梗死患者神經(jīng)功能損傷，改善患者認知水平及昏迷狀態(tài)。陳博威等[18]采用Cav-1基因敲除小鼠證實補陽還五湯能通過上調(diào)PI3K/AKT信號通路促進氣虛血瘀型腦梗死小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方可能通過調(diào)控差異基因，以多組分、多功能、多途徑的方式，主要通過HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等通路發(fā)揮作用，為進一步探討氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供了通路機制理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究分析GEO數(shù)據(jù)庫中氣虛血瘀型腦梗死芯片數(shù)據(jù)，篩選出差異基因（如：HIF1A、PIK3CA、TP53等上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5等下調(diào)），為診斷及治療提供靶點依據(jù)。同時基于中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治方劑進行數(shù)據(jù)挖掘及規(guī)律分析，篩選出臨床基礎(chǔ)方，由黃芪、川芎、當歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實10味中藥組成，具有益氣活血、行氣化痰之功效。最后對氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方進行作用機制預(yù)測分析，得出其可能通過調(diào)控防治靶點（如HIF1A、NF-κB、PI3K、IL6、TNF等），以多組分、多功能、多途徑的形式，介導(dǎo)HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等信號通路在氣虛血瘀型腦梗死疾病中發(fā)揮重要作用。

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（2020-05-19收稿 責(zé)任編輯：楊燕）