楊 柳,黨永康,烏 蘭,姜學超,仝向陽,彭戰(zhàn)利

(內蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院血管外科 024000)

下肢深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是臨床常見的外周血管疾病，臨床治療棘手，即使接受正規(guī)抗凝治療，仍有20%～50%的DVT患者會發(fā)生血栓后綜合征，出現(xiàn)肢體腫脹及疼痛、皮膚難愈性潰瘍等表現(xiàn)，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。血管內皮是血管壁與血液循環(huán)間的屏障，在生理狀態(tài)下具有防止血栓形成的作用，在不同病理因素作用下發(fā)生內皮損傷會造成血栓形成[3-4]。因此，促進內皮損傷修復是治療DVT的重要靶點。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，具有修復損傷內皮、促進血管新生的生物學功能。促進EPCs動員及增殖、增強EPCs功能在DVT的治療中具有積極意義[5]。微小RNA(microRNA，miR)在心血管系統(tǒng)中具有廣泛的生物學作用，其中miR-146a-5p是一種具有內皮保護作用的miR，在急性腦梗死小鼠中能夠增強EPCs的功能[6]，在高糖誘導內皮細胞損傷過程中能夠靶向抑制白細胞介素-1受體相關激酶1(interleukin-1 receptor associated kinase 1，IRAK-1)并減輕炎癥[7]。但miR-146a-5p在DVT發(fā)病過程中表達的變化及對EPCs的調控作用尚不清楚。因此，本研究將通過細胞實驗探究miR-146a-5p靶向IRAK-1調控DVT患者EPCs增殖及炎癥的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床標本

選取2018年7月至2019年6月本院診斷為DVT的10例患者及同期體檢的10例健康志愿者為研究對象，抽取靜脈血。納入標準：(1)符合DVT的診斷標準；(2)留取實驗所需的肘靜脈血；(3)取得知情同意。排除標準：(1)合并惡性腫瘤、結締組織病等；(2)既往有心肌梗死、腦梗死等血栓形成基本病史。DVT患者中男7例、女3例，年齡(43.94±9.49)歲；健康志愿者中男6例、女4例，年齡(42.18±10.37)歲。DVT患者與健康志愿者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2試劑

淋巴細胞分離液(美國GE公司)；miR-146-5p模擬物、陰性對照(negative control，NC)模擬物(上海吉瑪公司)；MTS細胞增殖活力檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因及檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)；miR檢測試劑盒(北京天根公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；IRAK-1、核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)一抗(美國Abcam公司)；β-actin一抗(美國Sigma公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(上海西唐公司)。

1.2 方法

1.2.1EPCs的分離培養(yǎng)

取肘靜脈血5 mL，肝素抗凝后按照1∶1加入磷酸鹽緩沖液，混勻后加入淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心20 min，吸取懸浮的單個核細胞層，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，接種在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4 d后棄去未貼壁的細胞，剩余貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)、每2天更換1次培養(yǎng)基，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底面80%～90%后用胰蛋白酶進行消化，而后傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2EPCs分組

取DVT患者第3～4代EPCs進行分組，共5組：miR-NC組轉染NC模擬物，miR-146a-5p組轉染miR-146a-5p模擬物，miR-NC+NC質粒組轉染NC模擬物及NC質粒，miR-146a-5p+NC質粒組轉染miR-146a-5p模擬物及NC質粒，miR-146a-5p+IRAK-1質粒組轉染miR-146a-5p模擬物及IRAK-1質粒。每組均連續(xù)轉染24 h。

1.2.3細胞增殖活力檢測

DVT患者的EPCs在96孔板內培養(yǎng)，2 000個細胞/孔，分組轉染24 h后采用MTS細胞增殖活力試劑盒進行檢測，在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光度值(A490值)。

1.2.4miR-146a-5p表達檢測

DVT患者的EPCs在12孔板內培養(yǎng)，1×106個細胞/孔，分組轉染24 h后采用miR提取試劑盒提取細胞中的miR，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄、以miR為模板合成cDNA，最后采用miR熒光定量PCR檢測試劑盒檢測miR-146-5p的表達，分別使用目的基因miR-146-5p及內參基因U6的引物進行PCR反應，反應程序為：95 ℃預變性3 min、95 ℃ 15 s及60 ℃ 34 s重復40個循環(huán)。反應完成后生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內參、根據(jù)公式2-ΔΔCt計算miR-146a-5p的相對表達水平。

1.2.5IRAK-1、NF-κB表達檢測

DVT患者的EPCs在12孔板內培養(yǎng)，1×106個細胞/孔，分組轉染24 h后采用RIPA裂解液提取細胞內的蛋白，蛋白定量后取含有30 μg蛋白的標本進行Western blot實驗。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在1∶1 000稀釋的IRAK-1、NF-κB一抗或1∶3 000稀釋的β-actin一抗中4 ℃孵育過夜。次日，PVDF膜放入1∶2 000稀釋的二抗中，室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶計算IRAK-1、NF-κB與β-actin灰度值的比值作為蛋白相對表達水平。

1.2.6TNF-α、IL-1β水平檢測

DVT患者的EPCs在12孔板內培養(yǎng)，1×106個細胞/孔，分組轉染24 h后采用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β水平，采用BCA試劑盒檢測細胞中總蛋白水平，計算每毫克細胞蛋白對應的TNF-α、IL-1β水平。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗

設計野生型IRAK-1雙熒光素酶報告基因，對野生型基因第40～47位堿基進行突變，得到突變型IRAK-1雙熒光素酶報告基因-1；對野生型基因第56～63位堿基進行突變，得到突變型IRAK-1雙熒光素酶報告基因-2；將雙熒光素酶報告基因與NC模擬物或miR-146a-5p模擬物共轉染進入DVT患者的EPCs，24 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光和海腎熒光，計算螢火蟲熒光/海腎熒光比值作為雙熒光素酶報告基因的熒光活力。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 DVT患者與健康志愿者EPCs中miR-146a-5p及IRAK-1相對表達水平比較

與健康志愿者比較，DVT患者miR-146a-5p相對表達水平更低，IRAK-1相對表達水平更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 過表達miR-146-5p對DVT患者EPCs增殖活力及炎性反應的影響

與miR-NC組比較，miR-146-5p組miR-146-5p相對表達水平、A490值更高，NF-κB、TNF-α、IL-1β表達水平更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 miR-146-5p靶向DVT患者EPCs中IRAK-1

在TargetScan網(wǎng)站進行在線生物信息學分析，IRAK-1基因mRNA 3′UTR中含有miR-146-5p的互補結合堿基；采用Western blot檢測IRAK-1的表達水平，miR-146-5p組細胞中IRAK-1的表達水平低于miR-NC組(P<0.05)；采用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，miR-146-5p組細胞中野生型IRAK-1基因的熒光活力低于miR-NC組(P<0.05)，兩種突變型IRAK-1基因的熒光活力與NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

A：熒光定量PCR法檢測miR-146a-5p相對表達水平；B：Western blot檢測IRAK-1相對表達水平;a：P<0.05，與健康志愿者比較。

A：熒光定量PCR檢測miR-146-5p相對表達水平；B：MTS法檢測細胞增殖活力A490值；C：Western blot檢測NF-κB表達水平；D：ELISA法檢測TNF-α表達水平；E：ELISA法檢測IL-1β表達水平;a：P<0.05，與miR-NC組比較。

2.4 過表達IRAK-1對miR-146-5p調控 DVT患者EPCs增殖活力及炎性反應的影響

miR-146a-5p+NC質粒組IRAK-1、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達水平低于miR-NC+NC質粒組，miR-146a-5p+IRAK-1質粒組IRAK-1、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達水平高于miR-146a-5p+NC質粒組(P<0.05)。miR-146a-5p+NC質粒組A490值高于miR-NC+NC質粒組，miR-146a-5p+IRAK-1質粒組A490值低于miR-146a-5p+NC質粒組(P<0.05)，見圖4。

A：TargetScan網(wǎng)站在線生物信息學分析；B：Western blot檢測IRAK-1相對表達水平；C：野生型IRAK-1雙熒光素酶報告基因實驗；D：突變型IRAK-1雙熒光素酶報告基因-1實驗；E：突變型IRAK-1雙熒光素酶報告基因-2實驗；a：P<0.05，與miR-NC組比較。

A：Western blot檢測IRAK-1相對表達水平；B：MTS法檢測細胞增殖活力A490值；C：Western blot檢測NF-κB表達水平；D：ELISA法檢測TNF-α表達水平；E：ELISA法檢測IL-1β表達水平；a：P<0.05，與miR-NC+NC質粒組比較；b：P<0.05，與miR-146a-5p+NC質粒組比較。

3 討 論

血管內皮對維持正常血流狀態(tài)、防止血栓形成具有重要意義。在DVT的發(fā)病過程中，血管內皮受損有利于血栓形成，因此，防止內皮損傷、促進內皮修復是治療DVT的關鍵環(huán)節(jié)之一。EPCs是一種多功能干細胞，在內皮損傷、缺血缺氧等病理因素的刺激下，骨髓中的EPCs開始動員并遷移至損傷部位，參與內皮損傷修復、新生血管形成[8]。多項基礎研究表明，在DVT的發(fā)病過程中，EPCs存在增殖及遷移活力減弱、炎性反應增強，進而影響EPCs對內皮損傷的修復、有利于血栓形成[9-10]。

目前，DVT發(fā)病過程中EPCs功能的調控機制尚不十分清楚。miR是一類在轉錄后水平調節(jié)基因表達并發(fā)揮生物學作用的非編碼小分子RNA，多種miR在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮心肌保護、內皮保護等作用。miR-146a-5p的心血管保護作用在阿霉素誘導心肌損傷[11]、膿毒癥誘導心肌損傷[12]、心肌梗死模型[13]中均得到證實。另有血管內皮相關的研究證實，miR-146a-5p對高糖誘導的內皮細胞損傷及炎癥具有改善作用[7]。本研究對外周血中EPCs進行了分離，檢測miR-146a-5p的表達并分析發(fā)現(xiàn)DVT患者EPCs中miR-146a-5p的表達水平低于健康體檢者，表明EPCs中miR-146a-5p低表達可能與DVT的發(fā)病有關，進而推測與之相關的分子機制可能是miR-146a-5p表達降低后內皮保護作用減弱，進而影響了EPCs的功能。

為了驗證上述推測，本研究以DVT患者的EPCs進行了實驗，在轉染miR-146a-5p模擬物使miR-146a-5p過表達后，EPCs的增殖活力明顯增強，表明miR-146a對DVT患者EPCs的增殖具有促進作用。miR-146a對心肌細胞及內皮細胞的保護作用均與其抑制炎性反應有關，NF-κB 是介導炎性反應的關鍵轉錄因子，通過促進TNF-α、IL-1β等炎性因子的表達及釋放來激活炎性反應[14-15]。本研究在過表達miR-146a-5p后觀察到DVT患者的EPCs中NF-κB的表達水平及TNF-α、IL-1β水平均明顯降低，表明miR-146a對DVT患者EPCs的炎性反應具有抑制作用。以上miR-146a-5p過表達的實驗結果驗證了miR-146a在EPCs中促進增殖、抑制炎癥的作用，進而表明DVT患者EPCs中miR-146a-5p低表達可能與增殖活力減弱、炎性反應激活有關。

miR發(fā)揮生物學作用的方式是與靶基因mRNA的3′UTR結合并使基因表達下調，根據(jù)LO等[7]及AN等[12]在內皮細胞、心肌細胞中的實驗結果，IRAK-1是miR-146a-5p的靶基因。IRAK-1是Toll樣受體4信號轉導途徑中的關鍵分子，能夠起到信號傳導作用并引起下游TRAF6激活，最終導致NF-κB激活及TNF-α、IL-1β大量釋放[16]。本研究已經證實miR-146a-5p抑制NF-κB的表達及TNF-α、IL-1β的釋放，進一步分析IRAK-1的表達發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a-5p后DVT患者EPCs中IRAK-1表達水平降低。同時，本研究還通過生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因實驗確認了miR-146a-5p在EPCs中靶向結合IRAK-1基因mRNA 3′UTR的第40～47位堿基及第56～63位堿基，與miR-146a-5p在心肌細胞及內皮細胞中靶向IRAK-1的結果一致。最后，通過轉染IRAK-1質粒的方式進行IRAK-1過表達，在過表達miR-146a-5p的同時過表達IRAK-1后，miR-146a-5p促進EPCs增殖、抑制EPCs炎性反應的作用發(fā)生逆轉。

綜上所述，DVT患者EPCs中miR-146a-5p呈低表達趨勢，過表達miR-146a-5p促進DVT患者EPCs的增殖、抑制炎性反應，靶向抑制IRAK-1是miR-146a-5p發(fā)揮上述作用的相關分子機制之一。本實驗的以上結果有助于闡明DVT的發(fā)病機制并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，EPCs中miR-146a-5p低表達可能通過抑制細胞增殖、促進炎癥激活的途徑參與DVT的發(fā)生，過表達miR-146a-5p可能改善EPCs的功能并成為未來治療疾病的新靶點。