曾偉雄,曾金財,方快發(fā)

(廣東省惠州市第六人民醫(yī)院心內(nèi)科 516200)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是影響人類健康的頭號殺手[1-2]。如不及時診斷和治療，病情會逐步進展導(dǎo)致治療難度增大，死亡風(fēng)險增加，部分患者極易發(fā)生猝死[3-4]。冠狀動脈造影是目前臨床診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于有創(chuàng)檢測，且對冠心病早期診斷和病情嚴(yán)重程度評估價值不足，患者接受度不高，因此存在一定局限性[5-6]。

最近研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)參與動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等心血管疾病的發(fā)生和進展過程，其在循環(huán)中可穩(wěn)定存在并可被檢測[7-10]。lncRNA CHAST屬于最新鑒定的lncRNA之一，研究顯示其參與心力衰竭后左心室的重構(gòu)過程，參與冠心病患者缺血缺氧心肌細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程，可望成為參與冠心病發(fā)病過程的關(guān)鍵lncRNA分子[11-12]。絲氨酸蛋白酶抑制劑A3(serpina3)又稱作α-1抗糜蛋白酶，最先鑒定為急性期血漿蛋白酶抑制劑[13]，其在先兆子癇患者循環(huán)中水平明顯增加，可能與慢性炎癥和孕婦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[14]。最近研究顯示serpina3是主動脈鈣化的早期診斷標(biāo)志物[15]。盡管如此，目前尚無研究探討冠心病患者血清serpina3水平及其臨床意義。本研究探討冠心病患者循環(huán)中l(wèi)ncRNA CHAST和serpina3水平并分析其對冠心病的臨床診斷及在預(yù)后評估中的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2019年7月本院心內(nèi)科收治的115例冠心病患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)符合2020國際心臟病學(xué)會和世界衛(wèi)生組織(WHO)對冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均行冠狀動脈造影檢查，至少1支冠狀動脈血管狹窄程度大于或等于50%；(3)不存在其他部位癌癥或血液系統(tǒng)惡性疾病；(4)臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的肝、腎、肺等臟器功能障礙者；(2)合并惡性血液系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病需要長期藥物治療者；(3)嚴(yán)重精神疾病或存在溝通障礙；(4)既往有冠心病且接受過內(nèi)科血管重建或外科冠狀動脈旁路移植術(shù)者；(5)孕婦和哺乳期婦女。115例冠心病患者作為冠心病組，其中男65例，女50例，年齡44～72歲，平均(59.22±6.39)歲；疾病類型：穩(wěn)定型心絞痛66例，不穩(wěn)定型心絞痛34例，急性心肌梗死15例；單支、2支和多支血管病變分別有47、33和35例。從同期本院體檢科常規(guī)健康體檢人員中選取年齡和性別相匹配的健康體檢者65例為對照組，其中男43例，女22例，年齡44～73歲，平均(57.20±7.23)歲。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1分組

根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果所得的Gensini評分對冠心病組進行亞組分組。Gensini評分標(biāo)準(zhǔn)[16]：冠狀動脈無狹窄為0分，冠狀動脈狹窄程度在0～<26%為1分，26%～<51%為2分，51%～<76%為4分，76%～<91%為8分，91%～<100%為16分，而冠狀動脈狹窄100%為32分。冠心病患者最終Gensini評分為每例患者的各個分支積分相加。Gensini評分0～25分為輕度病變組，26～49分為中度病變組，≥50分為重度病變組，115例冠心病患者中，輕度病變組32例、中度病變組45例、重度病變組38例。

1.2.2臨床標(biāo)本收集

兩組入選的研究對象均采集清晨空腹靜脈血，采血時保持平臥位，采集患者外周上肢靜脈血8 mL,3 000 r/min在5 ℃離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待統(tǒng)一檢測。

1.2.3循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平檢測

實時熒光定量PCR檢測兩組循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平：按血清/血漿miRNA提取分離試劑盒說明書(德國Qiagen公司)進行RNA提取后檢測RNA純度，選擇吸光度1.8～2.1的合格RNA標(biāo)本,使用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司)，從1 μg總RNA中合成cDNA，并將標(biāo)本保存于-20 ℃冰箱中。采用RealQ Plus 2x Master Mix for Probe(無ROXTM)進行3次重復(fù)實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)在Rotor-Gene Q(德國Qiagen公司)上進行,lncRNA CHAST正向引物為5′-TGC TGC ACT TTA CAA CCA CTG-3′,反向引物為5′-ATG GTG TCT TTG ATG TTG GGC-3′,PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。于60 ℃時采集熒光信號，以U6為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA CHAST相對表達水平，每份標(biāo)本均連續(xù)測定3次，取平均值。

1.2.4血清serpina3水平檢測

采用ELISA檢測血清serpina3水平，試劑盒購自北京優(yōu)爾生科技公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，所有標(biāo)本統(tǒng)一檢測，最小的檢測水平為0.01 μg/mL，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)分別為3.5%和5.0%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

冠心病組循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

2.2 不同嚴(yán)重程度冠心病組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

輕、中、重度病變組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

2.3 lncRNA CHAST、serpina3與Gensini評分的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析示：lncRNA CHAST與Gensini評分呈正相關(guān)(r=0.783，P<0.05)，serpina3與Gensini評分呈正相關(guān)(r=0.726，P<0.05)，lncRNA CHAST與serpina3也呈正相關(guān)(r=0.901，P<0.05)，見圖1。

表2 不同嚴(yán)重程度冠心病組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

A：lncRNA CHAST與Gensini評分的相關(guān)性；B：serpina3與Gensini評分的相關(guān)性；C：lncRNA CHAST與serpina3的相關(guān)性。

2.4 lncRNA CHAST、serpina3對冠心病的診斷價值分析

ROC曲線分析顯示，當(dāng)lncRNA CHAST的最佳截斷值為0.92時，曲線下面積(AUC)為0.801(95%CI：0.765～0.847，P<0.001),靈敏度為75.1%，特異度為87.9%。當(dāng)serpina3的最佳截斷值為99.37 μg/mL時，AUC為0.914(95%CI：0.876～0.946，P<0.001),靈敏度為87.1%，特異度為93.9%。二者聯(lián)合診斷冠心病的AUC為0.946(95%CI：0.897～0.982,P<0.001),靈敏度為91.1%，特異度為97.9%，見圖2。

圖2 lncRNA CHAST、serpina3對冠心病診斷的ROC曲線

3 討 論

近年來我國冠心病發(fā)病率和病死率均逐年上升，且發(fā)病年齡更趨于年輕化[17]。鑒于我國人口基數(shù)巨大，研究顯示每年因冠心病死亡的人數(shù)高達700萬人，給家庭和社會造成巨大的負(fù)擔(dān)[18]。如何早期有效對冠心病患者進行診斷，并對其病情進展進行有效監(jiān)測顯得尤為重要，是降低患者潛在血管事件發(fā)生及改善預(yù)后的重要途徑[18]。

lncRNA可通過調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、凋亡、損傷、自噬[19]和分化等過程[20],進而在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[21]。lncRNA CHAST定位在人類染色體7q32.2上，以細(xì)胞溶質(zhì)﹑核可溶物和染色質(zhì)相關(guān)形式廣泛存在[22]。也可被激活的T細(xì)胞信號的核因子所激活。缺血再灌注損傷和永久性梗死后，心肌細(xì)胞中活化T細(xì)胞核因子的核易位增加[11]。本研究顯示冠心病患者血清lncRNA CHAST表達水平明顯高于對照組，其表達水平在不同嚴(yán)重程度的冠心病患者中存在明顯差異，且隨著疾病的進展，表達水平呈增加的趨勢。有研究報道，在急性心肌梗死患者血清lncRNA CHAST表達水平較對照組明顯增加，特別是在心肌梗死早期改變最為明顯[12]，提示可能和心肌缺血密切相關(guān)，其水平和心肌梗死患者左心室射血分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，在心肌梗死的恢復(fù)期，其表達水平逐步下降。盡管冠心病患者血清lncRNA CHAST表達水平增加的機制尚不清楚，推測可能為冠心病的心肌細(xì)胞在缺血缺氧刺激下導(dǎo)致其表達水平增高。

serpina3是位于14q32上編碼的約為3.0×109的蛋白質(zhì)，是由人體肝、心、肺和腎臟組織和細(xì)胞合成的急性期蛋白[23]。有研究顯示其可參與慢性阻塞性肺疾病、帕金森病、腦出血和多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮疾病的發(fā)展[24]。有研究報道在動脈粥樣硬化病變中，serpina3水平增加，在輕度卒中或短暫性腦缺血發(fā)作的患者中serpina3水平增加更為明顯[25]。本研究顯示冠心病患者血清serpina3水平高于對照組，隨著冠心病患者Gensini評分增加，serpina3水平明顯增加，在不同嚴(yán)重程度的冠心病患者中存在明顯差異，提示其可作為評估冠心病患者病情嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。文獻報道顯示，與對照組比較，急性心肌梗死患者基礎(chǔ)血漿serpina3水平升高[26]。急性心肌梗死后激活的嗜中性白細(xì)胞和肥大細(xì)胞衍生蛋白，產(chǎn)生炎性因子瀑布效應(yīng)，可能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞對于serpina3的表達[26]。在心肌梗死的血管平滑肌細(xì)胞中serpina3水平也明顯增加，其可能是在冠心病患者的缺血心肌細(xì)胞和供應(yīng)心臟血供的微循環(huán)中，血管平滑肌細(xì)胞serpina3水平增加導(dǎo)致冠心病患者血清循環(huán)的serpina3水平增加[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著冠心病嚴(yán)重程度增加，冠狀動脈造影所得的Gensini評分增加[28]，發(fā)現(xiàn)冠心病患者循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平也逐漸增加，Gensini評分增加和循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平呈正相關(guān)，同時冠心病循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平也呈正相關(guān)，上述結(jié)果顯示冠心病循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平可作為評價冠心病嚴(yán)重程度的潛在的生物標(biāo)志物，臨床上可通過檢測循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度來評估冠心病的嚴(yán)重程度。

ROC曲線分析顯示通過檢測循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度均能夠很好地區(qū)分是否為冠心病患者，二者診斷冠心病患者的ROC曲線的AUC值分別為0.801和0.914，而兩者聯(lián)合檢測的ROC曲線AUC值可達0.946，上述結(jié)果提示循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度對冠心病具有較好的診斷效能，其相對于冠心病其他診斷手段如冠狀動脈造影，具有無創(chuàng)的優(yōu)勢。

綜上所述，冠心病患者循環(huán)血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度均明顯高于健康對照人群，單獨和聯(lián)合檢測lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平可對冠心病進行早期診斷和病情嚴(yán)重程度評估，二者可能成為冠心病患者潛在的無創(chuàng)生物標(biāo)志物。