李思寧，唐善虎*，任 然

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）和德氏保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）作為傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑，常被應(yīng)用于乳品工業(yè)中。然而，這兩株乳酸菌既不能自然棲息于消化道，也不能為消化道提供任何保健功能[1]。因此，一些益生菌，如乳酸桿菌和雙歧桿菌屬（Bifidobacteriumspp.）或者這兩類(lèi)乳酸菌的混合菌種被廣泛地用于開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵乳制品[2-4]。據(jù)報(bào)道，益生菌因缺乏蛋白水解能力，在牛乳中生長(zhǎng)緩慢[5]。為了縮短發(fā)酵時(shí)間和增加產(chǎn)品中活菌數(shù)，益生菌通常與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共同發(fā)酵牛乳[2,6]，這會(huì)導(dǎo)致菌種間相互影響，引起發(fā)酵乳品質(zhì)及功能特性的改變[7]。

Bifidobacteriumspp.和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）是人體腸道中的微生物，其中大部分菌株也是發(fā)酵乳制品中常用的益生菌[8-9]。Belkaaloul等[10]觀察到Lp和B.longum聯(lián)合發(fā)酵，表現(xiàn)出優(yōu)良的蛋白水解能力，且這兩株菌共培養(yǎng)后均能存活更長(zhǎng)時(shí)間。Li Sining等[11]報(bào)道，Lp和B.animalissubsp.lactis（Ba）在牛乳中共發(fā)酵，存在明顯的共生關(guān)系，且能夠改善S.thermophilus發(fā)酵乳的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。推測(cè)將Lp和Bifidobacteriumspp.復(fù)合使用可能是益生菌發(fā)酵乳的優(yōu)良菌種組合。

在好氧生物體內(nèi)，因氧化產(chǎn)生的大量自由基和活性氧會(huì)損害細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷[12]。氧化還會(huì)增加人體患動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[13]。據(jù)報(bào)道，酪蛋白來(lái)源的肽和乳清蛋白水解物有較強(qiáng)螯合過(guò)渡金屬和清除自由基的能力[14-15]；乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）具有抗氧化活性[16]。Farvin等[17]認(rèn)為發(fā)酵乳制品的抗氧化穩(wěn)定性主要?dú)w因于抗氧化肽，這些肽作為電子供體可以與自由基反應(yīng)形成更穩(wěn)定的產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Lp發(fā)酵的牛乳螯合Fe2+的能力為89.7%～97.6%[12]；Bifidobacteriumspp.發(fā)酵乳可較好地清除氧自由基[18]。這些研究表明，Lp和Bifidobacteriumspp.作用于牛乳產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有良好的抗氧化能力。

目前，還鮮見(jiàn)Ba和Lp與傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑共培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵乳抗氧化特性影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究Ba、Lp與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)條件下，發(fā)酵乳在4 ℃冷藏28 d過(guò)程中酸化特性、蛋白水解活力、EPS含量、肽含量及抗氧化能力變化，旨在探討不同菌種組合對(duì)發(fā)酵乳在冷藏過(guò)程中抗氧化特性的影響，為益生菌發(fā)酵乳工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛乳（3.5%脂肪、3.1%蛋白質(zhì)、15%乳固體）新希望乳業(yè)股份有限公司；BaCICC-21715 （特征特性：呈小細(xì)棒狀、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢；嚴(yán)格厭氧、化能異養(yǎng)型；能利用乳糖、果糖、半乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，不利用甘露醇；生長(zhǎng)需有機(jī)氮）和LpCICC-20265（特征特性：表面光滑有光澤、隆起、邊緣完整、黏稠乳白色不透明圓形菌落；好氧，能利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能使牛奶酸化，耐6.5%NaCl）凍干菌粉 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；S.thermophilus和L.bulgaricus混合（1∶1）直投式商業(yè)發(fā)酵劑（Y） Danisco（北京）菌種有限公司。

酚酞、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、甲醇、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、檸檬酸、葡萄糖、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、氯化亞鐵（均為分析純） 成都科龍?jiān)噭S；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰菲啰啉、菲啰嗪（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇（分析純） 百靈威科技有限公司；三氟乙酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Mreda公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國(guó)Waters公司；5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UV-1200紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海翱藝公司；MP511 pH計(jì) 上海三信儀表廠；DHP-9162D恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；MLS-3020高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

Ba和Lp分別在MRS肉湯中于37 ℃厭氧條件下復(fù)活24 h，再在MRS肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)活化2 代后，轉(zhuǎn)移至滅菌牛乳中，37 ℃培養(yǎng)6～7 h，使活菌數(shù)達(dá)到108CFU/g。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用Y、Y-Ba、Y-Lp和Y-Ba/Lp（Ba和Lp比例為1∶1）4 個(gè)發(fā)酵劑組合制備發(fā)酵乳。在所有處理中，商業(yè)發(fā)酵劑Y按牛乳質(zhì)量的0.1%（m/m）添加，而Lp與Ba單獨(dú)或混合使用，按初始濃度107CFU/g（牛乳質(zhì)量計(jì)）添加。制備的發(fā)酵乳于冷藏第1、7、14、21、28天取樣，用于指標(biāo)測(cè)定。

在郭村我也拍過(guò)一些人，并因此記住了他們的模樣。再次去郭村，路上遇見(jiàn)會(huì)有特別的親切感，仿佛他們是我住在鄉(xiāng)下的親人。

1.3.3 發(fā)酵乳制備

新鮮牛乳在90 ℃殺菌10 min，立即冷卻至43～45 ℃。在牛乳中分別加入4 種發(fā)酵劑并混合均勻，分裝于100 mL已滅菌的玻璃杯中，于42 ℃培養(yǎng)至pH 4.6。隨后，將發(fā)酵乳轉(zhuǎn)移至（4±1）℃冰箱冷藏，備用。

1.3.4 pH值測(cè)定

使用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。

1.3.5 滴定酸度測(cè)定

發(fā)酵乳樣品5.0 g與5 mL去離子水混勻，加入2 滴0.5%酚酞（95%乙醇溶液作為溶劑），用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至持續(xù)的淡粉色。以去離子水作為對(duì)照。根據(jù)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計(jì)算滴定酸度（°T）。

1.3.6 蛋白水解活力測(cè)定

參考Church等[19]的方法，并略作修改。鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）試劑配制：100 mmol/L四硼酸鈉溶液50 mL、20%十二烷基硫酸鈉溶液5 mL、OPA（80 mg鄰苯二甲醛溶解于2 mL甲醇，加入β-巰基乙醇200 μL與之混勻）2.2 mL混合后，用去離子水定容至100 mL。發(fā)酵乳樣品2.0 g和去離子水1 mL混勻，加入0.75 mol/L三氯乙酸5 mL，混合均勻并靜置10 min，4 ℃、4 000×g離心10 min，收集上清液。取上清液或去離子水（對(duì)照）200 μL，加入OPA試劑4 mL，混勻，室溫下反應(yīng)10 min后于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.7 EPS含量測(cè)定

參照Ramchandran等[20]的方法。5 g發(fā)酵乳4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液。將上清液與2 倍體積預(yù)冷乙醇混合，4 ℃靜置18～20 h，沉淀EPS，然后4 ℃、10 000×g離心15 min。沉淀用20 mL去離子水溶解后，加入80%檸檬酸溶液500 μL，在4 ℃靜置18～20 h。隨后，4 ℃、2 000×g離心15 min，收集無(wú)蛋白上清液。將上清液與2 倍體積預(yù)冷乙醇混合，4 ℃靜置18～20 h，重新沉淀EPS。再4 ℃、2 000×g離心15 min，收集EPS沉淀。重復(fù)蛋白沉淀和EPS再沉淀步驟。收集的粗EPS在40 ℃干燥20 min，溶解于10 mL去離子水中，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果以mg/100 g表示。制備0～0.16 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=14.899x+0.008（R2=0.997 1）計(jì)算EPS含量，其中y為吸光度，x為葡萄糖含量。

1.3.8 肽含量測(cè)定

參照Nielsen等[21]的方法，并略作修改。發(fā)酵乳經(jīng)4 ℃、50 000×g離心10 min，收集上清液。用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上清液pH 7.5，并貯存于-20 ℃冰箱中。使用前，乳清樣品在0～4 ℃解凍，4 ℃、12 000×g離心3 min，過(guò)0.45 μm親水濾膜。取20 μL乳清樣品用于高效液相色譜分析。肽在30 ℃被C18色譜柱分離。洗脫程序：0～10 min，0.1%三氟乙酸溶液；10～90 min，乙腈由0%逐步上升至48%。流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。通過(guò)肽譜中210 nm峰面積的累加表示發(fā)酵乳樣品中肽含量。測(cè)定保留時(shí)間在10.0～90.0 min肽的面積。

1.3.9 抗氧化能力測(cè)定

1.3.9.1 乳清的制備

參照Virtanen等[22]的方法分離乳清。調(diào)整發(fā)酵乳pH值為4.6，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液并過(guò)0.45 μm濾膜，獲得乳清樣品。

1.3.9.2 DPPH自由基清除率

參照Li Wende等[23]的方法。3 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L，95%甲醇作為溶劑）與1 mL的乳清樣品或95%甲醇（對(duì)照）混合均勻，在室溫下反應(yīng)20 min。4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算：

1.3.9.3 羥自由基清除率

參考De Avellar等[24]的方法，并略作修改。1.5 mL鄰菲啰啉溶液（5 mmol/L）與2.0 mL乳清樣品或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）混合，加入1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻。在反應(yīng)體系中加入0.1%過(guò)氧化氫溶液1 mL，并用去離子水定容至10 mL。反應(yīng)體系在37 ℃保溫60 min后于536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。羥自由基清除率按式（2）計(jì)算：

式中：As為樣品和過(guò)氧化氫均存在的吸光度；A1為不加入樣品的吸光度；A0為樣品和過(guò)氧化氫均不存在的吸光度。

1.3.9.4 Fe2+螯合能力

參照Dorman等[25]的方法。乳清樣品1 mL、2.0 mmol/L氯化亞鐵溶液0.05 mL、5.0 mmol/L菲啰嗪溶液0.2 mL和去離子水2.75 mL混勻。體系在室溫下反應(yīng)10 min后，于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。Fe2+螯合能力按式（3）計(jì)算：

式中：A0為對(duì)照（去離子水代替樣品）的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為樣品干擾（去離子水代替FeCl2溶液）的吸光度。

1.3.9.5 還原能力

參照Wang等[26]的方法。乳清樣品或去離子水（對(duì)照）1 mL與0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）1 mL及1%鐵氰化鉀1 mL混勻?；旌弦涸?0 ℃孵育20 min后，加入10%三氯乙酸溶液1 mL，4 ℃、4 000×g離心10 min。取上清液2 mL，與去離子水2 mL及0.1%氯化鐵溶液0.4 mL混合，靜置反應(yīng)10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。吸光度越高，表明還原能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵乳的酸化性能

測(cè)定酸化能力可以了解Ba和Lp對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵劑代謝模式的影響。不同菌種發(fā)酵乳的pH值和滴定酸度變化結(jié)果見(jiàn)圖1、2。所有樣品在發(fā)酵過(guò)程中都表現(xiàn)出相似的pH值下降趨勢(shì)，于發(fā)酵后期（2 h之后）pH值下降幅度最大（圖1a）。不同發(fā)酵劑具有不同的乳糖代謝能力，表現(xiàn)出不同的酸化速率，如圖1a所示，不同菌種發(fā)酵乳到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.6）所需時(shí)間不同。發(fā)酵劑Y單獨(dú)作用于牛乳時(shí)酸化速率最慢，經(jīng)4.33 h發(fā)酵后牛乳酸化至pH 4.6。而Lp和Ba可一定程度促進(jìn)牛乳酸化，縮短發(fā)酵時(shí)間，經(jīng)發(fā)酵劑Y-Ba/Lp發(fā)酵4 h后，發(fā)酵乳pH值降至4.6；而Y-Ba發(fā)酵乳和Y-Lp發(fā)酵乳pH值下降到4.6分別經(jīng)歷了4.25 h和4.08 h。圖1b顯示，隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵乳pH值快速下降（P＜0.05）。Tian Huaixiang等[2]在傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑與益生菌的共發(fā)酵乳中也觀察到了類(lèi)似的pH值變化趨勢(shì)。Lp或Ba與Y共發(fā)酵，加快了發(fā)酵乳在冷藏期間pH值的下降，其中Lp的酸化能力強(qiáng)于Ba（P＜0.05）。整個(gè)冷藏期間，Y-Ba/Lp發(fā)酵乳具有相對(duì)更低的pH值（P＜0.05）。

圖1 不同發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳的pH值Fig.1 Change in pH of fermented milks made with different starter cultures during fermentation and refrigerated storage

由圖2a看出，發(fā)酵乳在發(fā)酵前期（0～2 h）滴定酸度變化不大，之后產(chǎn)酸能力大大提升，這與pH值變化結(jié)果一致（圖1a）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，Y、Y-Ba、Y-Lp及Y-Ba/Lp發(fā)酵乳的滴定酸度分別為69.14、69.27、68.81 °T和70.16 °T。隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵乳的滴定酸度先增加后減少（P＜0.05），于14 d達(dá)到最大值。類(lèi)似的滴定酸度變化趨勢(shì)也被Li Sining等[11]和Shori[27]報(bào)道。滴定酸度值下降是因?yàn)槿樗峋暮笏峄绊懮L(zhǎng)能力、代謝過(guò)程和產(chǎn)酸性能，可能涉及到部分有機(jī)酸被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成非酸代謝物。冷藏1～28 d，Lp參與發(fā)酵的樣品Y-Lp和Y-Ba/Lp比其不參與發(fā)酵的樣品Y和Y-Ba產(chǎn)生了更多的滴定酸（P＜0.05）；而Y-Ba/Lp發(fā)酵乳的滴定酸度值最高（P＜0.05）。

圖2 不同發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳的滴定酸度Fig.2 Change in titratable acidity of fermented milks made with different starter cultures during fermentation and cold storage

2.2 不同菌種發(fā)酵乳的蛋白水解活力

基于OPA的分光光度法檢測(cè)牛乳蛋白質(zhì)水解后釋放的游離氨基，從而表征蛋白質(zhì)的水解活力[20]。隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同菌種水解牛乳蛋白質(zhì)釋放游離氨基基團(tuán)的能力增強(qiáng)（P＜0.05），發(fā)酵乳蛋白水解活力在冷藏結(jié)束時(shí)是初始時(shí)的2 倍以上（圖3）。冷藏期間，Lp參與發(fā)酵樣品Y-Lp和Y-Ba/Lp的蛋白水解活力顯著高于Lp不參與發(fā)酵的樣品Y和Y-Ba（P＜0.05），且所有共發(fā)酵乳的蛋白水解活力均高于Y發(fā)酵乳（P＜0.05）；不同菌種發(fā)酵乳的蛋白水解活力由高到低依次為Y-Ba/Lp、Y-Lp、Y-Ba、Y（P＜0.05）。Li Sining等[28]報(bào)道，Lp和S.thermophilus的發(fā)酵乳中是否加入Ba，都對(duì)發(fā)酵乳在冷藏期間的蛋白水解活力無(wú)顯著影響，這與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)長(zhǎng).bulgaricus參與發(fā)酵影響了各菌株的蛋白水解模式。Shihata等[29]發(fā)現(xiàn)，相較于S.thermophilus和其他乳桿菌，Bifidobacteriumspp.表現(xiàn)出更低的游離氨基釋放能力；而Lp被認(rèn)為是在乳品發(fā)酵中具有較高蛋白水解活力的菌株[30-31]，這些結(jié)論與本研究發(fā)現(xiàn)一致。

圖3 發(fā)酵乳在冷藏期間的蛋白水解活力Fig.3 Change in proteolytic activity of fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

2.3 不同菌種發(fā)酵乳中EPS含量

乳酸菌產(chǎn)生的EPS需要累積到一定量才能發(fā)揮良好的抗氧化作用[16]。不同發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳中EPS含量見(jiàn)表1。發(fā)酵乳中EPS含量與冷藏時(shí)間有關(guān)（P＜0.05），但與發(fā)酵菌種相關(guān)性不大（P＞0.05）。推測(cè)，EPS主要由S.thermophilus和L.bulgaricus（傳統(tǒng)發(fā)酵劑）產(chǎn)生。冷藏初期，發(fā)酵乳中EPS含量為10.59～11.22 mg/100 g；至冷藏結(jié)束時(shí)，EPS含量降至1.85～2.02 mg/100 g。所有處理樣品中EPS含量隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降（P＜0.05）。EPS含量減少可能是發(fā)酵乳中存在能夠降解EPS的酶[32]。Purwandari等[33]觀察到了類(lèi)似的下降趨勢(shì)，但Doleyres等[34]報(bào)道酸奶中EPS含量在4 周冷藏期內(nèi)趨于穩(wěn)定。這些差異可能是由發(fā)酵菌種不同造成的。

表1 發(fā)酵乳在冷藏期間的EPS含量Table 1 EPS contents in fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

綜上，發(fā)酵乳中EPS的產(chǎn)生與傳統(tǒng)發(fā)酵劑密切相關(guān)，Ba和Lp是否參與發(fā)酵對(duì)EPS含量無(wú)顯著影響。這進(jìn)一步說(shuō)明，在不同乳酸菌發(fā)酵條件下，發(fā)酵乳抗氧化活性的差異不是源于所形成的EPS。所以，本研究進(jìn)一步探討了肽對(duì)發(fā)酵乳抗氧化特性的影響。

2.4 不同菌種發(fā)酵乳中肽含量

酪蛋白在發(fā)酵過(guò)程中可被乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶水解成大分子肽并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，再被乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)肽酶進(jìn)一步分解為小肽[22]。

圖4顯示了Y發(fā)酵乳在冷藏1 d的肽譜圖。不同發(fā)酵乳在冷藏期間肽含量見(jiàn)圖5。冷藏1 d，發(fā)酵乳中肽含量為6.69×104～8.21×104mAU·s。冷藏7 d，所有處理發(fā)酵乳中肽含量迅速上升至最大值8.01×104～9.51×104mAU·s（P＜0.05）；峰值后，肽含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，于28 d下降至7.02×104～8.21×104mAU·s。冷藏1～28 d，共培養(yǎng)發(fā)酵乳Y-Ba、Y-Lp和Y-Ba/Lp中肽含量顯著高于Y發(fā)酵乳（P＜0.05），這是混合菌種具有較高蛋白水解活力造成的，與圖3結(jié)果具有一致性。然而在整個(gè)冷藏期，Y-Ba、Y-Lp和Y-Ba/Lp發(fā)酵乳間肽含量無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05）。發(fā)酵劑組成不同，不僅會(huì)引起發(fā)酵乳中肽含量的差異，同時(shí)也會(huì)造成發(fā)酵乳中生物活性肽類(lèi)別的不同，從而使這些生物活性肽表現(xiàn)出不同的生理功能[35]。

圖4 Y發(fā)酵乳在冷藏1 d的肽譜圖Fig.4 Peptide profile of fermented milk made with Y during storage at 4 ℃ for 1 day

圖5 發(fā)酵乳在冷藏期間的肽含量Fig.5 Peptide contents in fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

2.5 不同菌種發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率

由表2可見(jiàn)，不同菌種發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率在冷藏過(guò)程中先上升后下降，于冷藏第7天達(dá)到最大值（P＜0.05）。Amirdivani[36]和Muniandy[37]等在酸奶冷藏過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的DPPH自由基清除率變化趨勢(shì)。DPPH自由基清除率下降可能涉及到具有清除DPPH自由基的肽發(fā)生了降解[38]。共發(fā)酵乳樣品的DPPH自由基清除率顯著高于Y發(fā)酵乳（P＜0.05）；而在共發(fā)酵乳中，Y-Ba/Lp的DPPH自由基清除活性最高，其次為Y-Ba，再次是Y-Lp。相關(guān)性分析表明，冷藏期內(nèi)，發(fā)酵乳的DPPH自由基清除活性與肽含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，肽作為一種氫供體，能夠與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻止DPPH自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

表2 發(fā)酵乳在冷藏期間的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH radical scavenging activity of fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

2.6 不同菌種發(fā)酵乳的羥自由基清除率

不同菌種發(fā)酵乳的羥自由基清除率見(jiàn)表3。Y、Y-Ba、Y-Lp和Y-Ba/Lp發(fā)酵乳的羥自由基清除率在冷藏前7 d呈增加趨勢(shì)，于第7天達(dá)到最大值，分別為89.65%、90.35%、94.85%和96.41%。在隨后的冷藏時(shí)間，發(fā)酵乳羥自由基清除率逐漸下降，在28 d下降至75.43%～77.13%。羥自由基清除效果降低可能是由于抗氧化活性肽發(fā)生了進(jìn)一步水解和裂解。不同菌種發(fā)酵乳的羥自由基清除率從21 d后沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），這說(shuō)明發(fā)酵劑組成對(duì)羥自由基清除活性似乎沒(méi)有持久的影響。在整個(gè)冷藏期內(nèi)，不同發(fā)酵乳的羥自由基清除活性由高到低依次為Y-Ba/Lp、Y-Lp、Y-Ba、Y（P＜0.05）。Li Yun等[39]研究發(fā)現(xiàn)，與單一乳酸菌發(fā)酵乳相比，多株乳酸菌共培養(yǎng)提高了發(fā)酵乳的羥自由基清除率，這與本研究結(jié)果一致。統(tǒng)計(jì)分析表明，羥自由基清除活性與發(fā)酵乳中肽含量有很強(qiáng)的正相關(guān)（P＜0.05）。肽將電子提供給羥自由基后，將其還原為OH-，從而導(dǎo)致羥自由基被清除。

表3 發(fā)酵乳在冷藏期間的羥自由基清除率Table 3 Hydroxyl radical scavenging capacity of fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

2.7 不同菌種發(fā)酵乳的Fe2+螯合能力

不同菌種發(fā)酵乳Fe2+螯合能力見(jiàn)表4。發(fā)酵乳的Fe2+螯合能力隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，呈下降-上升的趨勢(shì)，且受發(fā)酵劑影響，其值在53.04%～93.84%之間。Muniandy等[37]觀察到與本研究結(jié)果一致的趨勢(shì)。Saiga等[40]報(bào)道，肽中酸性氨基酸（Asp和Glu）主要參與過(guò)渡金屬離子的螯合。冷藏7 d，發(fā)酵乳螯合金屬離子的能力顯著低，可能與肽中酸性氨基酸含量低有關(guān)。1～7 d，Y-Ba發(fā)酵乳Fe2+螯合能力與Y-Lp無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05），但在隨后的冷藏時(shí)間，Y-Ba發(fā)酵乳的Fe2+螯合能力強(qiáng)于Y-Lp樣品（P＜0.05）。貫穿整個(gè)冷藏期，Y發(fā)酵乳的Fe2+螯合能力最差，而Y-Ba/Lp發(fā)酵乳Fe2+螯合能力最強(qiáng)（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)分析表明，Y-Ba、Y-Lp、Y-Ba/Lp共發(fā)酵乳的Fe2+螯合能力與肽含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而Y樣品的Fe2+螯合能力與肽含量相關(guān)性較差（P＞0.05）。Pa?a-Ramos等[41]認(rèn)為，對(duì)促氧化金屬離子的螯合活性可能是由于抗氧化肽的特定氨基酸殘基終止了某些自由基鏈反應(yīng)所致。

表4 發(fā)酵乳在冷藏期間的Fe2＋螯合能力Table 4 Ferrous ion chelating capacity of fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

2.8 不同菌種發(fā)酵乳的還原能力

還原能力作為一個(gè)重要的抗氧化指標(biāo)，表征總抗氧化能力[42]。由表5可看出，不同菌種發(fā)酵乳的還原能力在冷藏前7 d顯著增加，隨后減少。還原能力下降通常是由于抗氧化物質(zhì)的降解造成的[43]。冷藏1～14 d，共發(fā)酵乳樣品的還原能力優(yōu)于Y發(fā)酵乳（P＜0.05），但14 d之后所有處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Madhu等[44]發(fā)現(xiàn)，包含Lp的益生菌共發(fā)酵乳還原能力顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳，這與本研究結(jié)果一致。益生菌與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)后提高了發(fā)酵乳的還原能力，這可能是由于微生物代謝物的相互作用導(dǎo)致具有抗氧化活性的肽增加[37]。冷藏期間，發(fā)酵乳樣品的還原能力與肽含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 發(fā)酵乳在冷藏期間的還原能力Table 5 Reducing power of fermented milks made with different starter cultures during refrigerated storage

共發(fā)酵乳在整個(gè)冷藏過(guò)程中，Y-Ba/Lp發(fā)酵乳具有最高的還原能力，其次為Y-Ba發(fā)酵乳，而Y-Lp處理的還原能力最差（P＞0.05）。Y-Lp發(fā)酵乳蛋白水解活力高于Y-Ba發(fā)酵乳（圖3），但其還原能力卻低于Y-Ba發(fā)酵乳，這表明抗氧化能力并未與發(fā)酵劑的蛋白水解能力緊密相關(guān)。Sarmadi等[45]認(rèn)為，食品中蛋白肽的抗氧化性能與肽的組成、結(jié)構(gòu)和疏水性密切相關(guān)?；赟armadi等[45]報(bào)道的結(jié)果，推測(cè)自由基清除能力與從微生物菌株中獲得的特異性蛋白水解酶有關(guān)。

3 結(jié) 論

隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵乳的酸化能力和蛋白水解活力均增加；Lp發(fā)酵乳（Y-Lp和Y-Ba/Lp）的酸化能力和蛋白水解活力顯著高于非Lp發(fā)酵乳（Y和Y-Ba）。在28 d冷藏期間，發(fā)酵乳肽含量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力均先上升后下降，于第7天達(dá)到最大值。添加Ba或Lp，提高了發(fā)酵乳肽含量，增強(qiáng)了發(fā)酵乳抗氧化能力。Y-Ba/Lp發(fā)酵乳具有最強(qiáng)的抗氧化能力。本研究表明，益生菌Ba和Lp與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共培養(yǎng)，可有效改善發(fā)酵乳的抗氧化能力。