趙 躍，李春生*，王悅齊，陳勝軍，李來(lái)好*，黃 卉

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300）

羅非魚(yú)（Tilapia）是我國(guó)南方最主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，憑借生長(zhǎng)速度快、繁殖量大、容易養(yǎng)殖、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，逐漸成為全球關(guān)注的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類[1]。2019年我國(guó)羅非魚(yú)的總產(chǎn)量達(dá)到164.2萬(wàn) t，較2018年產(chǎn)量提高了1.05%[2]。近幾年，我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球羅非魚(yú)總產(chǎn)量的近50%[3]。目前，羅非魚(yú)加工產(chǎn)品形式單一，大部分加工成魚(yú)片出口，精深加工產(chǎn)品少，產(chǎn)品附加值低[4]。因此，合理利用羅非魚(yú)資源，開(kāi)發(fā)切實(shí)有效的加工技術(shù)，已成為我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。魚(yú)糜加工是目前國(guó)內(nèi)外發(fā)展較快的魚(yú)制品加工方式。魚(yú)糜制品具有高蛋白、低脂肪、口感嫩爽、食用方便等特點(diǎn)，并且產(chǎn)量逐年增加。由于海水魚(yú)魚(yú)糜具有良好的凝膠特性，市場(chǎng)上魚(yú)糜制品的生產(chǎn)原料多采用海水魚(yú)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)魚(yú)肉中鹽溶性蛋白含量低，應(yīng)用傳統(tǒng)魚(yú)糜加工方式加工形成的魚(yú)糜制品凝膠強(qiáng)度差，極大地限制了羅非魚(yú)魚(yú)糜加工的應(yīng)用[4]。因此提高羅非魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度，開(kāi)發(fā)高品質(zhì)羅非魚(yú)魚(yú)糜制品，已成為羅非魚(yú)魚(yú)糜加工亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

利用微生物發(fā)酵技術(shù)提高淡水魚(yú)魚(yú)糜品質(zhì)是目前研究的熱點(diǎn)。發(fā)酵魚(yú)糜一般使用乳酸菌作為發(fā)酵劑，依靠快速降低的pH值促進(jìn)魚(yú)肉凝膠化，抑制有害微生物的生長(zhǎng)[6-7]。同時(shí)，乳酸菌發(fā)酵作用使魚(yú)糜的蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物發(fā)生不同變化，形成其特有的風(fēng)味與口感[8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜的研究主要集中于利用市售的乳酸菌等微生物菌種作為發(fā)酵劑，分析加菌發(fā)酵對(duì)魚(yú)糜品質(zhì)和風(fēng)味等相關(guān)理化指標(biāo)的影響。楊方[9]利用Lactobacillus plantarum發(fā)酵鰱魚(yú)魚(yú)糜，建立發(fā)酵魚(yú)糜體系和酸性模擬體系，探討魚(yú)肉內(nèi)源酶對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜凝膠特性的影響。Liu Zhongyi等[6]利用L.casei、Streptococcuslactis、Saccharomyces cerevisiae和Monascus anka混合發(fā)酵鳙魚(yú)魚(yú)糜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加菌發(fā)酵后的魚(yú)糜在味道和外觀上都優(yōu)于未加菌的對(duì)照組。王洋等[7]利用L.pentosus、L.plantarum、Staphylococcus sciuri、Staphylococcus xylosus等復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵鱘魚(yú)魚(yú)糜，其產(chǎn)品具有優(yōu)良的感官品質(zhì)和理化特性。然而，目前發(fā)酵魚(yú)糜研究主要集中鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、草魚(yú)、鱘魚(yú)等淡水魚(yú)，對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程品質(zhì)變化的研究鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)酵魚(yú)糜一般采用添加單菌或復(fù)合菌劑的方式進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，然而由于魚(yú)糜原料中微生物菌群比較復(fù)雜，實(shí)際的魚(yú)糜品質(zhì)形成過(guò)程是由復(fù)雜的微生物菌群代謝活動(dòng)引起。明確發(fā)酵魚(yú)糜復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)及其功能調(diào)控是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵魚(yú)糜產(chǎn)業(yè)升級(jí)的重要環(huán)節(jié)。然而，目前絕大部分研究并未考慮微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝活動(dòng)對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)的影響。而且，由于不同淡水魚(yú)魚(yú)糜中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)差異較大，盲目使用微生物發(fā)酵劑不僅不會(huì)改善魚(yú)糜品質(zhì)，而且會(huì)與原料自身優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，大大降低發(fā)酵魚(yú)糜的品質(zhì)。因此，如何篩選適用于特定淡水魚(yú)魚(yú)糜的功能微生物是發(fā)酵魚(yú)糜研究的難點(diǎn)。目前，基于16S/18S/ITS的二代高通量測(cè)序技術(shù)已較為普遍地應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物菌群多樣性研究。朱雯娟等[10]利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)梅香魚(yú)樣品的微生物菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus、Staphylococcus和Tetragenococcus是參與梅香魚(yú)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌屬。Wang Zongmin等[11-12]通過(guò)16S rRNA和ITS高通量測(cè)序技術(shù)，明確了Acetobacter、Lactobacillus、Enhydrobacter、Lactococcus、Gluconacetobacer、Bacillus、Staphylococcus7 個(gè)微生物菌屬是鎮(zhèn)江香醋中產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味的核心微生物菌群。利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)能夠解析羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中的微生物菌群，進(jìn)一步利用Pearson、主成分分析（principal component analysis，PCA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法能夠揭示微生物菌群對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)形成的影響規(guī)律，有利于定向篩選適用于特定淡水魚(yú)魚(yú)糜的功能微生物，避免所用微生物發(fā)酵劑不合適或效果差，降低了發(fā)酵劑選擇盲目性，節(jié)省了發(fā)酵魚(yú)糜生產(chǎn)成本。

因此，本研究以羅非魚(yú)魚(yú)糜為研究對(duì)象，利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)揭示羅非魚(yú)魚(yú)糜自然發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群變化情況，結(jié)合羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度、色度等品質(zhì)變化結(jié)果，借助Pearson、PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法揭示微生物菌群對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)形成的影響規(guī)律，為定向分離篩選適用于羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜的功能微生物、靶向改善羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)、食鹽、蔗糖和葡萄糖（食品級(jí)） 廣東廣州市海珠區(qū)客村華潤(rùn)萬(wàn)家超市。

PCA培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒 美國(guó)Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司；Biowest Agarose瓊脂糖西班牙Biowest公司；FastPfu Polymerase聚合酶 中國(guó)TransGen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA-T25組織勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)Brookfield公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；SZ-22絞肉機(jī) 湖南省長(zhǎng)沙固利食品機(jī)械有限公司；CR-410全自動(dòng)色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)光學(xué)影像公司；QuantusTMFluorometer微型熒光劑 美國(guó)Promega公司；Illumina MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜制備

在市場(chǎng)購(gòu)買鮮活羅非魚(yú)（500～750 g/條）后，立刻運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，去頭、去鱗、去內(nèi)臟，取背部魚(yú)肉并用冷水沖洗，然后用絞肉機(jī)絞碎成魚(yú)糜。在低溫環(huán)境下（4 ℃），將魚(yú)糜與0.5%葡萄糖、2%食鹽、0.5%蔗糖等輔料斬拌均勻。使用手動(dòng)灌腸機(jī)灌入直徑30 mm的塑料腸衣中，每根長(zhǎng)約15 cm，然后置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵30 h，分別在第0、18、24、30小時(shí)取樣分析（標(biāo)記為C0、C18、C24、C30）。

1.3.2 16 S rRNA高通量測(cè)序

將3.0 g發(fā)酵香腸充分?jǐn)囁楹螅糜?7 mL生理鹽水中充分混勻，取含菌的生理鹽水在12 000 r/min、4 ℃離心10 min，獲得菌體沉淀。16S rRNA高通量測(cè)序參照文獻(xiàn)[8]方法。采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，利用NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度和濃度。采用上游引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，27 個(gè)循環(huán)；然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃進(jìn)行保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化，用QuantusTMFluorometer進(jìn)行檢測(cè)定量，使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，利用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)分析

將發(fā)酵香腸切成高25 mm且切面平整的圓柱體，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定發(fā)酵魚(yú)糜的硬度、彈性、黏性、內(nèi)聚力、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性。選用4 mm TA44平底圓柱形探頭，TA-RT-KIT夾具，測(cè)試速率1 mm/s，距離目標(biāo)值15 mm，每個(gè)樣品進(jìn)行軸向壓縮2 次，2 次下壓間隔時(shí)間1 s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g。每次實(shí)驗(yàn)做5 次平行，取平均值。

1.3.4 凝膠強(qiáng)度分析

將發(fā)酵香腸切成高25 mm且切面平整的圓柱體，采用質(zhì)構(gòu)儀分析魚(yú)糜凝膠的凝膠強(qiáng)度。選用壓縮模式測(cè)定香腸凝膠的破斷強(qiáng)度（g）和凹陷深度（cm），選用直徑5 mm球形探頭壓縮樣品，下壓位移設(shè)置為15 mm，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g，測(cè)試速率1 mm/s。每次實(shí)驗(yàn)做5 個(gè)平行，取平均值。凝膠強(qiáng)度按式（1）計(jì)算：

1.3.5 色差分析

將發(fā)酵香腸切成25 mm且切面平整的圓柱體，采用全自動(dòng)色彩色差儀在457 nm波長(zhǎng)處用標(biāo)準(zhǔn)白板對(duì)儀器進(jìn)行校對(duì)，然后測(cè)定魚(yú)糜凝膠的亮度（L*）值、紅/綠（a*）值、黃/藍(lán)（b*）值，按式（2）計(jì)算白度值（W）：

1.3.6 pH值測(cè)定

將5.0 g發(fā)酵香腸置于45 mL超純水中勻漿，10 000 r/min離心10 min取上清液，用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.7 菌落總數(shù)測(cè)定

將3.0 g發(fā)酵香腸充分?jǐn)囁楹?，置?7 mL生理鹽水中充分混勻，梯度稀釋后，涂布于PCA培養(yǎng)基上，將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

采用Fastp（v0.19.6）軟件對(duì)16S rRNA高通量測(cè)序原始序列進(jìn)行質(zhì)控，利用Flash（v1.2.11）軟件將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads進(jìn)行組裝拼接。使用UPARSE（v7.0.1090）軟件在97%相似度條件下進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類并剔除嵌合體，利用RDP classifer（v2.11）軟件比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（v138）進(jìn)行物種分類注釋。分別采用Mothur（v1.30.2）和QIIME（v1.9.1）軟件計(jì)算樣品的α多樣性值和β多樣性值。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用單因素方差分析中的Tukey-Kramer檢驗(yàn)方法，“*”表示不同微生物菌群在不同發(fā)酵時(shí)間下菌群差異顯著（P＜0.05），利用Pearson、PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析微生物菌群與發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)變化的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)研究羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，如表1所示。8 個(gè)樣品共得到368 664 條序列，平均每個(gè)樣品46 083 條序列，平均長(zhǎng)度約為428 bp。序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU。8 個(gè)樣品共獲得246 種OTU，其中發(fā)酵24 h的OTU種類最多，平均值達(dá)到117 種。

表1 羅非魚(yú)魚(yú)糜自然發(fā)酵過(guò)程中微生物16S rRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of bacterial 16S rRNA gene sequencing data for tilapia surimi during natural fermentation

2.2 羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性變化

2.2.1α多樣性分析

α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性進(jìn)行分析，Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則同時(shí)考慮群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。覆蓋率反映各樣本文庫(kù)的覆蓋程度，即樣本中序列被測(cè)出的概率。如表2所示，Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)結(jié)果顯示，發(fā)酵到第24小時(shí)，樣品中的微生物豐富度最高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果顯示，未發(fā)酵時(shí)物種的均勻度最高，自然發(fā)酵能降低物種的均勻度，發(fā)酵后期（24～30 h）物種的均勻度最??；所有發(fā)酵時(shí)間樣品的序列被捕獲概率均大于0.999，表明測(cè)序結(jié)果的完整度較高。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜微生物α多樣性分析Table 2 α-Diversity analysis of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

2.2.2 獨(dú)有和特有的OTU組成分析

如圖1所示，4 個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)共有的微生物種類為54 種；發(fā)酵后期即發(fā)酵24 h和30 h共有微生物種類最多，達(dá)到105 種；發(fā)酵24 h時(shí)，獨(dú)有的微生物種類最多，達(dá)到47 種。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜微生物群落Venn圖Fig.1 Venn diagram analysis of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

2.2.3β多樣性分析

在OTU分類水平上采用Bray-Curtis、unweighted UniFrac和weighted UniFrac距離算法比較不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜β多樣性，結(jié)果如圖2所示。Bray-Curtis的計(jì)算只考慮樣品中物種的存在情況，而不考慮序列間的進(jìn)化距離。結(jié)果顯示，平行樣品間微生物菌群差異較小，發(fā)酵18、24 h和30 h樣品的微生物菌群差異較小，而與未發(fā)酵魚(yú)糜中微生物菌群的差異較大（圖2A）。UniFrac是利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息比較不同樣品間物種群落差異，其中unweighted UniFrac不考慮物種豐度，而weighted UniFrac考慮物種豐度。在不考慮物種豐度（圖2B）和考慮物種豐度（圖2C）的情況下，其分析結(jié)果均與Bray-Curtis結(jié)果相似，平行樣品間微生物菌群差異最小，羅非魚(yú)魚(yú)糜自然發(fā)酵后（18～30 h）與未發(fā)酵魚(yú)糜的菌群差異較大。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜微生物菌群β多樣性熱圖Fig.2 Heatmap for β-diversity of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

2.3 羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化

羅非魚(yú)魚(yú)糜在自然發(fā)酵條件下微生物菌群變化較為明顯（圖3）。在門水平上（圖3A），F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria為整個(gè)發(fā)酵過(guò)程主要微生物菌門，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)irmicutes中的微生物相對(duì)含量逐漸增加，而Proteobacteria相對(duì)含量逐漸下降。這與傳統(tǒng)豬肉干制香腸[13]和自然發(fā)酵魚(yú)露[14]發(fā)酵過(guò)程門水平上微生物菌群變化結(jié)果相似。自然發(fā)酵30 h后，F(xiàn)irmicutes成為最主要微生物菌群，相對(duì)含量接近90%。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜微生物菌群在門（A）和屬（B）水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages at phylum (A) and genus (B) levels

在屬水平上（圖3B），Lactococcus、Macrococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus等微生物菌屬在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的變化具有顯著差異（P＜0.05）。未發(fā)酵前羅非魚(yú)魚(yú)糜原料中Macrococcus（29.0%）、Acinetobacter（22.2%）、Lactococcus（12.6%）、Floricoccus（11.5%）、Streptococcus（6.9%）為主要微生物菌群。Lactococcus在自然發(fā)酵18 h內(nèi)的相對(duì)豐度顯著增長(zhǎng)到64.9%，并在隨后的發(fā)酵過(guò)程中（18～30 h）相對(duì)豐度保持穩(wěn)定，因而是羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中主要的微生物菌屬。Lactococcus在魚(yú)茶[15]、豆腐乳[16]等其他發(fā)酵食品中也是主要的發(fā)酵菌屬。值得注意的是，Pediococcus在羅非魚(yú)魚(yú)糜原料中的相對(duì)豐度較低（0.02%），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)迅速，發(fā)酵30 h的相對(duì)含量?jī)H次于Lactococcus，達(dá)到13.2%。此外，Enterococcus和Lactobacillus等微生物菌屬的相對(duì)豐度也隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等微生物菌屬均可適應(yīng)羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵環(huán)境，這些微生物的代謝作用可能對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)的形成有很大的影響。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Macrococcus、Acinetobacter、Streptococcus、Floricoccus、Rothia、Enhydrobacter、Psychrobacter、Pseudomonas、Chryseobacterium等微生物菌屬的相對(duì)含量呈降低趨勢(shì)，同時(shí)，Enterobacter、Citrobacter、Photobacterium、Aeromonas、Plesiomonas、Vagococcus、Vibrio在發(fā)酵18 h時(shí)呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，但發(fā)酵后期（24～30 h）含量又逐漸下降。由此可見(jiàn)，這些微生物菌屬可能不適應(yīng)羅非魚(yú)魚(yú)糜的弱酸性厭氧發(fā)酵環(huán)境。Yin等[17]相關(guān)研究報(bào)道表明添加乳酸菌能顯著抑制發(fā)酵鯖魚(yú)糜中Pseudomonas、Staphylococcus和Enterobacteriaceae的生長(zhǎng)，并在發(fā)酵12 h后即成為優(yōu)勢(shì)菌種。因此，發(fā)酵后期羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中有害微生物豐度的顯著降低可能與Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等乳酸菌的大量繁殖有關(guān)。

2.4 羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中品質(zhì)特征變化

如圖4所示，凝膠強(qiáng)度是衡量魚(yú)糜凝膠制品品質(zhì)最基本的指標(biāo)之一。一般來(lái)說(shuō)，具有令人愉悅的彈性口感的凝膠強(qiáng)度在300 g·cm以上[18]，而使用加熱法生產(chǎn)的羅非魚(yú)魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度只有200 g·cm左右[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵能夠顯著提高羅非魚(yú)魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度，發(fā)酵18 h羅非魚(yú)魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度超過(guò)450 g·cm，發(fā)酵30 h超過(guò)670 g·cm。而且，利用發(fā)酵方法得到的羅非魚(yú)魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度也優(yōu)于加熱法生產(chǎn)的混合海水魚(yú)（馬鮫魚(yú)、海鱸魚(yú)、金鯧魚(yú)等）的羅非魚(yú)魚(yú)糜[19]。白度也是評(píng)價(jià)魚(yú)糜凝膠制品的標(biāo)準(zhǔn)之一，它直接影響消費(fèi)者對(duì)商品的可接受程度，對(duì)于魚(yú)糜制品而言，白度越高產(chǎn)品越受消費(fèi)者喜愛(ài)[20]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵能顯著提高魚(yú)糜的白度，且發(fā)酵時(shí)間（18～30 h）對(duì)魚(yú)糜白度的影響無(wú)顯著性差異。發(fā)酵后羅非魚(yú)魚(yú)糜的白度值明顯優(yōu)于加熱法生產(chǎn)的羅非魚(yú)魚(yú)糜，且優(yōu)于海鱸魚(yú)、黃花魚(yú)、金鯧魚(yú)、紅三魚(yú)、馬鮫魚(yú)等海水魚(yú)魚(yú)糜[4]。羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中菌落總數(shù)呈逐漸上升趨勢(shì)，可能與Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等乳酸菌的大量繁殖有關(guān)。同時(shí)，羅非魚(yú)魚(yú)糜的pH值在18 h內(nèi)迅速下降，發(fā)酵后期（24～30 h）則降速減緩。菌落總數(shù)和pH值變化結(jié)果與自然發(fā)酵鰱魚(yú)魚(yú)糜的結(jié)果一致[21]。pH值是影響魚(yú)糜凝膠形成的重要因素，研究表明，由于pH值的變化可以改變氨基酸殘基側(cè)鏈的電荷分布，蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)處所帶的靜電荷為0，蛋白質(zhì)分子間就失去了靜電斥力作用，使蛋白分子相互迅速聚集，使產(chǎn)品產(chǎn)生較佳的硬度與彈性[22]。本研究中，羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中pH值的下降對(duì)其凝膠強(qiáng)度的改善起著重要作用。

質(zhì)構(gòu)特性是影響發(fā)酵香腸品質(zhì)的重要因素，優(yōu)良發(fā)酵香腸的組織結(jié)構(gòu)應(yīng)該是緊密且切片富有彈力，其中，硬度、彈性和黏性能比較好反映魚(yú)糜制品的感官適口性，是表征香腸質(zhì)地特征的重要力學(xué)參數(shù)[23]。如圖4所示，羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵前的黏性較高，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，魚(yú)糜由溶膠狀態(tài)變?yōu)槟z狀組織，使其黏性逐漸下降。硬度是指第1次壓縮樣品時(shí)的壓力峰值，可衡量其熟化程度，通常是由魚(yú)肉蛋白的變性和凝膠化以及水分的損失引起。羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜的硬度在發(fā)酵過(guò)程中始終保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，并在第30小時(shí)達(dá)到最大。彈性反映的是試樣在第1次壓縮形變后能夠再?gòu)?fù)原的程度；內(nèi)聚性反映形成食品形態(tài)所需內(nèi)部結(jié)合力的大小[24]；咀嚼性反映了魚(yú)糜制品從咀嚼的狀態(tài)到可吞咽狀態(tài)所需要的能量，咀嚼性越高“咬感”就越好[25]。羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜的彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)相同，表現(xiàn)為在發(fā)酵前18 h明顯下降并在24 h達(dá)到最大值。發(fā)酵24 h時(shí)，羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜具有更佳的硬度與彈性，此特性有助于發(fā)酵魚(yú)肉香腸被切成薄片。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚(yú)魚(yú)糜的品質(zhì)特征變化Fig.4 Changes in quality characteristic of tilapia surimi at different fermentation stages

2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)特性變化的影響規(guī)律

為研究微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)特性變化的影響規(guī)律，篩選相對(duì)豐度前10的菌屬（Lactococcus、Macrococcus、Acinetobacter、Enterobacter、Pediococcus、Citrobacter、Floricoccus、Streptococcus、Enterococcus、Rothia），結(jié)合發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)指標(biāo)（凝膠強(qiáng)度、白度、菌落總數(shù)、pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、硬度），利用Pearson和PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法研究微生物群落結(jié)構(gòu)與魚(yú)糜品質(zhì)的相關(guān)性。

如圖5A所示，凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚(yú)糜品質(zhì)指標(biāo)之間具有顯著正相關(guān)（P＜0.05），同時(shí)與菌落總數(shù)、Pediococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus、Lactococcus表現(xiàn)出正相關(guān)，特別是與Lactococcus的正相關(guān)最為顯著（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.907、0.980、0.957；與內(nèi)聚性、彈性和pH值以及Acinetobacter、Rothia、Floricoccus、Streptococcus、Macrococcus等菌屬具有顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與咀嚼性和黏性均無(wú)顯著相關(guān)。PCA作為一種多變量的相關(guān)性分析方法，已被應(yīng)用于分析中國(guó)米酒[26]和韓國(guó)Saeu-jeot[27]等發(fā)酵食品中主要的菌群與化學(xué)物質(zhì)之間的關(guān)系。本研究中，利用PCA方法比較微生物菌群與魚(yú)糜品質(zhì)的相關(guān)性，如圖5B所示。結(jié)果顯示，PCl的方差貢獻(xiàn)率為77.7%，PC2的方差貢獻(xiàn)率為9.6%，這2 個(gè)PC可以反映全部信息的87.3%，提取較為完全，說(shuō)明這2 個(gè)PC能夠替代原始19 個(gè)成分反映樣品信息。結(jié)果顯示，就不同發(fā)酵階段而言，羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵后（18、24、30 h）的樣本與魚(yú)糜原料（0 h）的差異性較大。PCA相關(guān)性分析結(jié)果與Pearson聚類結(jié)果類似，19 個(gè)成分明顯分為兩大類，一類為凝膠強(qiáng)度、白度、菌落總數(shù)、硬度、Lactococcus、Enterobacter、Pediococcus、Citrobacter、Enterococcus，另一類為pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、Macrococcus、Acinetobacter、Floricoccus、Streptococcus、Rothia，每個(gè)類別內(nèi)的成分之間呈正相關(guān)，2 個(gè)類別間的成分呈負(fù)相關(guān)，其中發(fā)酵過(guò)程中Lactococcus相對(duì)豐度的增加與凝膠強(qiáng)度、白度、硬度的提高以及魚(yú)糜pH值的下降相關(guān)性最為顯著（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析和PCA結(jié)果表明，羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中Lactococcus、Pediococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus等產(chǎn)酸菌的代謝作用導(dǎo)致發(fā)酵魚(yú)糜的pH值逐漸下降，從而促進(jìn)了凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚(yú)糜品質(zhì)指標(biāo)的改善。

圖5 利用Pearson（A）和PCA（B）方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)與羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)的相關(guān)性Fig.5 Correlation analysis of microbial community with quality indexes in fermented tilapia surimi using Pearson correlation analysis (A) and PCA (B)

Lactobacillus、Pediococcus等乳酸菌屬經(jīng)常被用作商業(yè)發(fā)酵劑用于淡水魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵，有助于發(fā)酵魚(yú)糜形成良好的品質(zhì)[21,28-29]。而本研究中相對(duì)豐度最高的Lactococcus在淡水魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜的應(yīng)用較少。盡管Enterococcus并未列入歐盟安全合理推定和美國(guó)公認(rèn)安全認(rèn)證的安全性菌屬名單，但有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Enterococcus是奶酪和香腸發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)的微生物菌屬，對(duì)其品質(zhì)和風(fēng)味形成起著重要的作用[28,30]。本研究表明，Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus等乳酸菌屬，特別是Lactococcus和Pediococcus與羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)形成密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究羅非魚(yú)魚(yú)糜自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性變化。羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性較為豐富，并在發(fā)酵第24小時(shí)的OTU總數(shù)和獨(dú)有的種類最多，發(fā)酵18、24和30 h樣品的微生物菌群差異較小，而與發(fā)酵初期（0 h）菌群差異較大。Firmicutes和Proteobacteria為整個(gè)發(fā)酵過(guò)程主要微生物菌門，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)irmicutes中的微生物相對(duì)含量逐漸增加，而Proteobacteria相對(duì)含量逐漸下降。Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等微生物菌屬均可適應(yīng)羅非魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵環(huán)境，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增長(zhǎng)。Lactococcus是羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中主要的微生物菌屬，在自然發(fā)酵18 h內(nèi)的相對(duì)豐度從12.6%顯著增長(zhǎng)到64.9%，并在隨后的發(fā)酵過(guò)程中保持穩(wěn)定，其次是Pediococcus，發(fā)酵第30小時(shí)的相對(duì)含量達(dá)到13.2%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠強(qiáng)度、白度、硬度、菌落總數(shù)等品質(zhì)指標(biāo)逐漸增加，pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性等品質(zhì)指標(biāo)與發(fā)酵前相比有所下降。Pearson相關(guān)性分析和PCA發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜中Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Enterobacter、Citrobacter等產(chǎn)酸菌屬與凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚(yú)糜品質(zhì)指標(biāo)呈正相關(guān)而與pH值呈負(fù)相關(guān)，這些菌的代謝作用（特別是產(chǎn)酸特性）對(duì)于發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)可以從Lactococcus、Pediococcus等乳酸菌中定向分離篩選菌株，開(kāi)發(fā)適用于羅非魚(yú)魚(yú)糜的發(fā)酵劑，用于靶向改善羅非魚(yú)發(fā)酵魚(yú)糜品質(zhì)，本研究結(jié)果也為其他淡水魚(yú)魚(yú)糜發(fā)酵菌株的定向篩選提供了重要技術(shù)參考。