韓國強，孫協平，吳鵬飛，陳今朝，陳 春，王 慶*

（長江師范學院現代農業(yè)與生物工程學院，重慶 408100）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，根據香氣成分分為醬香型、濃香型和清香型三大香型白酒。清香型白酒是歷史最久、覆蓋面很廣的白酒種類，而小曲清香型白酒是我國清香型白酒的重要組成，由釀酒小曲釀造生產。傳統小曲多以大米、米糠、麩皮為原材料，經人工接種曲母或根霉、酵母菌培養(yǎng)而成，因曲塊體積小得名。小曲制作過程是開放式的，容易受到自然環(huán)境因素的影響。復配小曲是相對于傳統小曲而言，由多種霉菌制曲后與功能酵母復合配制成的小曲。復配小曲可通過多種功能微生物的協同發(fā)酵，解決單一微生物釀酒小曲釀造風味欠佳的問題。印度毛霉與米根霉協同發(fā)酵米酒可以提高米酒品質，改善酒體香氣融合和協調[1]。純種根霉曲與釀酒酵母復配，提高了酒曲的糖化能力、發(fā)酵能力和酯化能力[2]。

早期微生物多樣性研究多利用傳統微生物培養(yǎng)技術進行，隨著分子生物技術的快速發(fā)展，聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳和高通量測序技術被應用于分析微生物的群落多樣性。其中高通量測序技術快速發(fā)展，具有較高的安全性和準確性，越來越多地被用于分析樣品微生物的豐度和多樣性[3]。近年來，高通量測序技術較多應用在大曲酒的研究中，包括大曲、窖泥和酒醅中微生物多樣性和結構[4-7]，但是對清香型白酒特別是小曲清香型白酒釀造過程中的微生物多樣性和群落結構研究較少。周森等[8]利用高通量測序手段解析了11 份清香型大曲微生物的多樣性，結果表明大曲真菌多樣性較為一致，而細菌的多樣性較為豐富。寧亞麗等[9]對朝鮮族傳統米酒及酒曲微生物群落多樣性進行分析，酒曲中的優(yōu)勢菌種為假單胞菌屬和腸桿菌屬，而米酒發(fā)酵階段乳桿菌屬成為一種優(yōu)勢菌。唐佳代等[10]利用高通量測序技術分析了貴州地區(qū)釀酒小曲細菌的多樣性，貴州地區(qū)釀酒小曲優(yōu)勢細菌為芽孢桿菌、腸桿菌、乳酸桿菌、不動桿菌和片球菌。Wang Jie等[11]利用高通量測序技術分析了中國華西、湖北和四川傳統小曲中細菌的群落結構，結果表明，小曲中的細菌主要是乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬和葡糖桿菌屬。Dong Weiwei等[12]利用高通量測序分析了傳統小曲和純培養(yǎng)小曲微生物發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。Wu Hechuan等[3]分析了我國3 個不同地區(qū)常用的小曲，發(fā)現細菌群落結構比真菌群落相對復雜，小曲細菌和真菌多樣性和群落結構不同造成了不同產地小曲風味的不同。Tang Qiuxiang等[13]探究了小曲微生物多樣性與代謝產物之間的關系，微生物群落多樣性的差異導致了小曲酒揮發(fā)性物質的差異。在小曲白酒的發(fā)酵過程中，小曲是小曲白酒釀造微生物的重要來源，環(huán)境微生物群也是發(fā)酵微生物群的重要來源之一[14]。目前利用高通量測序研究小曲主要集中在各地小曲微生物多樣性的差別上，在發(fā)酵過程中微生物群落結構及多樣性方面研究較少。Dong Weiwei等[12]雖然通過高通量測序分析了純培養(yǎng)小曲微生物的變化，但是只分析了細菌菌群的變化規(guī)律，對真菌菌群結構及變化規(guī)律沒有研究。

根據濃香型白酒和醬香型白酒的研究，細菌菌群對白酒產量和品質起重要作用[4]。細菌能夠代謝產生酸類、醛類等物質影響白酒風味，也可通過淀粉酶、酯化酶的合成影響白酒的出酒率和香氣成分[15]，小曲中功能細菌也以芽孢桿菌居多[16]。本研究通過純種復配小曲，研究小曲釀造過程中細菌的多樣性和變化規(guī)律，可以更好地了解小曲白酒功能細菌的來源及作用，對發(fā)酵過程中的功能菌進行深度挖掘并將其應用于小曲白酒釀造，對提高小曲酒品質有良好的促進。研究旨在為后續(xù)利用開發(fā)復配小曲微生物資源以及提高復配小曲白酒品質提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗樣品均采集自重慶市望仙酒業(yè)有限公司制酒車間，海拔900 m，小曲白酒原料為糯高粱。

十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）基因組DNA提取試劑盒 賽默飛世爾科技公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 德國Qiagen公司；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒 美國Illumina公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 美國New England Biolabs公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋 上海恒躍醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺 上海智城分析儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機德國Beckman公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統 美國伯樂公司；水平電泳儀 北京六一儀器廠；NovaSeq 6000測序系統 美國Illumina公司；渦旋混合器 德國IKA公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與收集

將黑曲霉、黑根霉、米根霉和米曲霉的霉菌孢子分別接種到已滅菌帶有麩皮的培養(yǎng)瓶中，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，待麩皮表面長滿菌絲時，扣瓶培養(yǎng)3～6 d，待麩皮全部長滿菌絲取出，在40 ℃干燥4 h，將黑曲霉、黑根霉、米根霉和米曲霉按照質量比7∶2∶3∶1混勻制備成復配小曲，按照高粱投料干質量的0.4%進行下曲。

高粱經泡糧、蒸糧、攤涼、下曲、拌勻、收堆糖化24 h后于2019年12月17日入窖池并進行泥封，窖池為水泥材質，發(fā)酵周期為7 d，入窖池當天溫度為8～13 ℃，相對濕度為76%～80%。入窖池前開始采集樣品，當天記為采樣的第0天，標記為D0。由于發(fā)酵周期短，在發(fā)酵前期微生物種類及豐度變化較大，發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定變化相對較小，所以在入窖池后前3 d每天取樣，發(fā)酵后期第5天和第7天分別進行采樣，采樣點為酒醅表面以下30 cm左右，每次采樣約50 g，標記為D1、D2、D3、D5、D7。每次樣品取2 個重復，上述樣品采集后迅速置于液氮中冷凍，之后于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

1.3.2 樣品總DNA提取及PCR

采用CTAB方法對樣品基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和質量濃度，取適量的樣品DNA于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR。

1.3.3 PCR擴增及測序

細菌PCR擴增引物：515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3’）；真菌PCR擴增引物：1737F（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。PCR體系：10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，正反引物各0.8 μL，PhusionDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補水至20 μL。PCR條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 高通量測序

隨著人們生活水平的提高以及經濟的快速發(fā)展，對煤炭的需求量也在不斷增加，但是由于缺乏先進的掘進設備，施工工藝和技術相對落后，制約著我國煤礦相關產業(yè)的發(fā)展。在開采中選擇合適的掘進線路，制定合理的掘進工序并配備高效的掘進設備才能提高工作效率，減少開采風險，保證開采人員的安全。為了有效應對各種因素對煤礦巷道掘進的影響，提高煤礦巷道掘進效率，從而提升整個煤礦開采作業(yè)的質量和開采效益，必須對存在的各種影響因素進行分析，然后研究如何應對這些因素產生的不利影響。

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和real-time PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。分別對細菌V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)序列進行測序分析（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

1.4 數據處理

基于Illumina NovaSeq 6000測序平臺，使用FLASH對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始數據，經過嚴格的過濾處理得到高質量數據，經過Tags截取和長度過濾得到最終有效數據。利用Uparse軟件對所有樣品的有效數據進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的代表序列。對OTU序列進行物種注釋，用Mothur方法比對數據庫進行物種注釋分析，同時計算該OTU在各樣品中的相對含量。使用Qiime軟件對樣品的α多樣性指數進行分析，使用R軟件繪制群落組成圖。

2 結果與分析

2.1 細菌多樣性分析

為研究各樣品的物種組成，對所有樣品的有效序列以97%的一致性進行OTU聚類，然后對OTU的序列進行物種注釋。16S rRNA V4區(qū)高通量測序結果經過濾和雙端拼接后，共得到376 126 條有效序列，通過聚類得到2 387 個OTU。為直觀顯示小曲白酒發(fā)酵過程中的共有OTU和特有OTU，對所有小曲酒樣細菌的OTU進行統計和比較。由圖1可知，小曲釀造過程中共有OTU為178 個。在入窖池前，樣品中特有的OTU數為171 個，進入窖池發(fā)酵后，OTU數快速下降，發(fā)酵第5天特有OTU數僅為2 個。而發(fā)酵結束后，樣品在環(huán)境中獲得了大量的菌體，特有OTU增加為418 個。再將每個OTU與細菌分類學數據庫進行比對，得到每個OTU的物種注釋，共注釋得到35 個門、378 個屬和216 個種水平的細菌。復配小曲由4 種霉菌組成，釀酒車間可能是發(fā)酵細菌菌群的重要來源，這也說明了環(huán)境中微生物菌群的多樣性。

圖1 小曲發(fā)酵酒樣細菌OTU的統計和比較Fig.1 Unique and shared bacterial OTUs among different times of fermentation

α多樣性測定結果見表1。每個樣品的覆蓋率、Chao1指數和Shannon指數分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。覆蓋率結果表明測序數據能夠覆蓋目前狀態(tài)下樣品中細菌的種類，釀造過程中樣品中覆蓋率均不低于0.996，說明樣品中被測出的概率較高，能真實反映樣品中細菌物種豐度及多樣性[10]。OTU數可以代表樣品物種的豐度[9]，ACE指數用來估計群落中OTU數目。Chao1指數是群落豐度指數，指數越大，表明樣品中微生物群落豐度越高。小曲白酒發(fā)酵7 d，樣品中OTU數、ACE指數和Chao1指數在發(fā)酵中第1天有所增加，其后逐漸降低，在發(fā)酵第5天為最低。Shannon指數是群落分布多樣性指數，指數越大，表明樣品微生物多樣性越高。Simpson指數同樣可用于估算樣品中微生物多樣性指數，數值越大，群落多樣性越低。物種豐富度和物種多樣性都是發(fā)酵第1天最高，第5天最低。

表1 小曲發(fā)酵酒樣細菌α多樣性指數測定結果Table 1 Bacterial α-diversity indexes

2.2 細菌群落結構差異性分析

2.2.1 基于門水平小曲白酒釀造中群落結構分析

在門水平下，小曲酒樣品一共鑒定出35 個門類細菌物種，圖2顯示豐度水平前10的物種，其他物種合并為others。由圖2可知，主要的細菌優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。在發(fā)酵前期，優(yōu)勢菌為厚壁菌門和變形菌門，隨著小曲白酒的發(fā)酵，變形菌門相對豐度下降，厚壁菌門相對豐度占絕對優(yōu)勢。這可能因為變形菌門的有些好氧菌可能在低氧、酸性和高醇的環(huán)境中難以生存[9]。而厚壁菌門的乳酸菌可以適應這種環(huán)境，這也說明厚壁菌門在小曲白酒發(fā)酵中發(fā)揮了重要作用。

圖2 基于門水平小曲發(fā)酵酒樣的細菌群落結構Fig.2 Bacterial community structure at phylum level

2.2.2 基于屬水平小曲白酒釀造中群落結構分析

在屬水平下，小曲酒樣品共檢測出378 個屬細菌物種，圖3顯示相對豐度前10的物種，其他物種合并為others。由圖3可知，相對豐度排名前10為乳桿菌屬（Lactobacillus）、不明立克次體菌屬（unidentifiedRickettsiales）、亮光素體屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、普氏菌屬（Prevotellaceae）、泛菌屬（Pantoea）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、赤蘚菌屬（Erysipelatoclostridium）、梭菌屬（Clostridioides）。進入窖池發(fā)酵前2 d乳桿菌屬相對豐度變化不大，發(fā)酵3 d后乳桿菌屬菌相對豐度迅速增加，在發(fā)酵第5天達到最高。隸屬于乳酸菌的乳桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌隨著發(fā)酵進行，在樣品中的相對豐度大幅增加，成為小曲酒樣品的優(yōu)勢菌，特別是乳桿菌屬。而立克次體菌屬在進入窖池前占比較大，隨著發(fā)酵的進行，其占比不斷減少。魏斯氏菌屬相對豐度在發(fā)酵前2 d先增加后又減少。泛菌屬菌在發(fā)酵第1天相對豐度有所增加，其后不斷降低。泛菌屬菌群是重要的具有代謝和發(fā)酵類型的化能異養(yǎng)菌，是芝麻香型高溫大曲[17]和醬香型郎酒高溫大曲[4]作為第一優(yōu)勢菌群存在。

圖3 基于屬水平小曲發(fā)酵酒樣的細菌群落結構Fig.3 Bacterial community structure at genus level

在傳統小曲和純種培養(yǎng)小曲研究中，發(fā)酵周期為15 d，9～15 d乳酸菌相對豐度超過枯草芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬[12]。在本研究中，由于發(fā)酵周期較短，乳桿菌屬在發(fā)酵3 d后已經成為優(yōu)勢菌。乳酸菌作為白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌，其種類、數量以及動態(tài)變化對于白酒釀造過程至關重要[18]。乳酸菌大多是兼性厭氧或厭氧菌[19]，在發(fā)酵中具有重要的生物學結構調節(jié)功能[20]。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵體系內酸度和乙醇濃度的升高，氧氣含量逐漸減少，大部分的微生物不能耐受高酸度、高乙醇濃度、厭氧等不利條件而逐漸衰亡，而乳酸菌則成為絕對優(yōu)勢的細菌。小曲酒體系中的乳酸菌在利用糖產生乳酸、乙酸等。乳酸和乙酸可以和乙醇發(fā)生反應生產乳酸乙酯和乙酸乙酯，其中乙酸乙酯是小曲白酒中重要的風味物質。同時乳酸菌可以產生細菌素等拮抗物質以及與其他微生物競爭底物等途徑影響其他微生物的生長[5,21-22]。種類豐富的乳酸菌在小曲白酒釀造發(fā)酵后期占據絕對優(yōu)勢地位，影響小曲白酒的品質。

2.3 真菌多樣性分析

ITS1區(qū)高通量測序結果經過濾和雙端拼接后，共得到391 303 條有效序列，通過聚類得到177 個OTU。為直觀顯示小曲白酒發(fā)酵過程中的真菌共有OTU和特有OTU，對所有小曲酒糟醅樣品的OTU進行統計和比較。由圖4可知，釀造過程中糟醅樣品共有的OTU為20 個。在入窖池前，樣品中特有的OTU數為3 個，進入窖池發(fā)酵后，特有OTU數都比較低，只有1～2 個。而發(fā)酵結束后，樣品在環(huán)境中獲得了大量菌體，特有OTU增加為19 個。再將每個OTU與真菌分類學數據庫進行比對，得到每個OTU的物種注釋，共注釋得到4 個門、38 個屬和47 個種水平的真菌。

圖4 小曲發(fā)酵酒樣真菌OTU的統計和比較Fig.4 Unique and shared fungal OTUs among different times of fermentation

由表2可知，覆蓋率均為1，說明樣品中被測出的概率較高。小曲白酒發(fā)酵7 d，樣品中OTU數和ACE指數在發(fā)酵中第1天有所增加，第2天降低，隨后又有所增加。Chao1指數是群落豐度指數，發(fā)酵第1天該指數最高為45.43。Shannon指數是群落分布多樣性指數，該指數發(fā)酵開始時最小，發(fā)酵結束時最大。Simpson指數同樣可用于估算樣品中微生物多樣性指數，同樣也是在發(fā)酵開始時該指數最低。這說明了發(fā)酵第1天群落豐度最高。

表2 小曲發(fā)酵酒樣真菌α多樣性指數測定結果Table 2 Fungal α-diversity indexes

2.4 真菌群落結構差異性分析

2.4.1 基于門水平小曲白酒釀造中群落結構分析

在門水平下，小曲酒樣品共鑒定出4 個門類真菌物種。由圖5可知，真菌優(yōu)勢菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。子囊菌門的真菌群落在發(fā)酵過程中增加并占據絕對主導地位，這說明子囊菌門在小曲白酒發(fā)酵中起到重要作用。毛霉菌門真菌群落的相對豐度在發(fā)酵過程中有所降低，毛霉在小曲酒發(fā)酵過程中有一定的糖化力[23]。隨著發(fā)酵的進行，基質中的淀粉越來越低，其相對豐度也不斷降低。

圖5 基于門水平小曲發(fā)酵酒樣的真菌群落結構Fig.5 Fungal community structure at phylum level

2.4.2 基于屬水平小曲白酒釀造中群落結構分析

在屬水平下，小曲酒樣品共檢測出38 個屬真菌物種，圖6顯示相對豐度前10的物種，其他物種合并為others。由圖6可知，相對豐度前8 位菌屬為伊薩酵母屬（Issatchenkia）、根霉屬（Rhizopus）、酵母菌屬（Saccharomyces）、曲霉屬（Aspergilus）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、絲孢酵母屬（Trichosporon）。在入窖池前，伊薩酵母屬和根霉屬為絕對優(yōu)勢菌屬，發(fā)酵后期釀酒酵母屬為絕對優(yōu)勢菌屬。根霉屬和曲霉屬的相對豐度隨著發(fā)酵時間的延長不斷降低。伊薩酵母屬在發(fā)酵1 d后相對豐度有所增加，其后隨著發(fā)酵的進行，其相對豐度不斷降低。而酵母菌屬相對豐度不斷增加。伊薩酵母屬是白酒釀造過程的功能菌，在多種不同香型的白酒大曲和酒醅中有報道[14,24-25]。該菌屬在土壤和酒醅中都比較豐富，有一定的耐酸、耐高溫和耐乙醇特性，同時可發(fā)酵產乙醇和乙酸乙酯。米根霉具有很高的淀粉酶生產能力[9,26]，能夠降解高粱中的淀粉，被廣泛用于制曲、釀酒生產中。根霉一般也參與一些低沸點物質的合成[27]。曲霉是產酶能力較強的一類菌，可以分泌糖化酶[28]，對高粱中淀粉的水解糖化起到重要作用。曲霉還可以促進某些酯類的合成，提高酒質。隨著發(fā)酵時間的延長，小曲白酒體系中有機酸和醇類濃度不斷增加，破壞了根霉和曲霉的生長環(huán)境，因而其相對豐度不斷降低。釀酒酵母是白酒釀造過程中的主要功能菌株，可在厭氧條件下生長繁殖，在厭氧條件下有很強的乙醇發(fā)酵能力[29-30]，是產酒的關鍵功能菌，因此在小曲白酒發(fā)酵過程中比例不斷增加。同時，釀酒酵母和其他微生物如霉菌、細菌等可能發(fā)生相互作用[31]。釀酒酵母可以通過其強大的發(fā)酵力提高小曲白酒的出酒率和品質。在本研究所用復配小曲中沒有釀酒酵母的添加，在發(fā)酵開始時其相對豐度也比較低，可能通過釀酒車間進入發(fā)酵體系中。

圖6 基于屬水平小曲發(fā)酵酒樣的真菌群落結構Fig.6 Fungal community structure at genus level

3 結 論

本研究通過高通量測序技術對復配小曲白酒發(fā)酵過程中細菌和真菌群落多樣性進行了分析。結果表明，小曲白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、子囊菌門和毛霉菌門；細菌多樣性比真菌豐富。在屬水平上，發(fā)酵過程中的細菌菌群在數量和結構分布上多樣性變化較大。小曲白酒發(fā)酵前2 d最主要優(yōu)勢細菌屬為不明立克次體菌屬，發(fā)酵第3～7天主要優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬。優(yōu)勢真菌屬為伊薩酵母屬、根霉屬、酵母菌屬、曲霉屬。根霉屬和曲霉屬在整個發(fā)酵過程中相對豐度不斷降低，而酵母菌屬在發(fā)酵第2天到發(fā)酵結束相對豐度不斷提高。酸度和乙醇含量的提高可能抑制芽孢桿菌屬、根霉屬和曲霉屬菌體的生長。本研究分析了復配小曲白酒生產過程中的微生物群落結構及變化規(guī)律，可為復配小曲的生產和工藝改進提供理論基礎。