談蘇慧，盧海強(qiáng)，陳 偉，張莉娟，田洪濤，谷新晰*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanase，EC 3.2.1.78）是內(nèi)切水解酶，可隨機(jī)水解甘露聚糖分子內(nèi)部的β-1,4糖苷鍵，將甘露聚糖降解為葡萄糖、甘露寡糖等低聚糖[1-2]。β-甘露聚糖酶在食品行業(yè)應(yīng)用前景廣闊，其可降解角豆膠[3]、瓜兒豆膠[4]、魔芋膠[5]等富含甘露聚糖的植物膠生產(chǎn)甘露寡糖。甘露寡糖具有促進(jìn)腸道有益菌生長、調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫、改善腸道菌群環(huán)境等作用，是一種新型的優(yōu)質(zhì)益生元[6-7]。β-甘露聚糖酶還可用于降低咖啡、巧克力及可可液等的黏性以利于其進(jìn)一步加工[8]。Suryawanshi等[9]發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶的多酶系統(tǒng)固定化后，β-甘露聚糖酶可在澄清蘋果汁、獼猴桃汁、橙汁、桃汁等果汁的同時(shí)，增加其還原糖含量。Singh等[10]的研究結(jié)果表明β-甘露聚糖酶可高效去除含甘露聚糖食物引起的污漬。崔婷婷等[11]研究發(fā)現(xiàn)在面團(tuán)中添加β-甘露聚糖酶處理15 min的體積分?jǐn)?shù)為2.0%魔芋葡甘聚糖，能夠顯著抑制二硫鍵的斷裂和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，防止面團(tuán)的水分散失，維持面團(tuán)的拉伸能力。Comfort等[12]報(bào)道的甘露聚糖酶多為最適反應(yīng)溫度在50～60 ℃之間的中低溫酶，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)中較高的溫度要求。因此，熱穩(wěn)定性較好的嗜熱甘露聚糖酶逐漸成為新的研究熱點(diǎn)[13]。

嗜熱真菌能在45 ℃以上正常生長，且在19 ℃無法生長[14]，嗜熱真菌分泌的酶類大部分為嗜熱酶[15]。嗜熱甘露聚糖酶具有熱穩(wěn)定性好、可提高反應(yīng)的催化效率、高溫時(shí)底物黏度低、促進(jìn)酶與底物的結(jié)合、具有催化等優(yōu)勢(shì)[16]。迄今為止，獲得的近30 種嗜熱甘露聚糖酶僅有少部分來源于嗜熱真菌[17]，如來自黑曲霉Aspergillus nigerBK01的酶Man BK[18]、來自小巢狀曲霉Aspergillus nidulansXZ7的酶Man5XZ7[19]和來自籃狀菌Talaromyces leycettanusJCM12802的酶Man5A[16]。因此，分離鑒定嗜熱真菌并獲得嗜熱甘露聚糖酶，對(duì)提高微生物資源利用率以及解決甘露聚糖酶工業(yè)應(yīng)用受限等問題有較高的理論價(jià)值和指導(dǎo)意義。

碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）是參與復(fù)雜碳水化合物合成或分解蛋白酶的統(tǒng)稱，具有降解、修飾及生成糖苷鍵的功能[20]。根據(jù)氨基酸序列相似性、蛋白結(jié)構(gòu)及催化功能的不同，主要分為5 類催化酶及一類非催化模塊，催化酶分別為碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GTs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、輔助氧化還原酶（auxiliary activities，AAs）、非催化模塊即碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules，CBMs）[21]。近幾年，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，探究真菌編碼碳水化合物酶基因的數(shù)量以及種類，并以此為指標(biāo)篩選高效產(chǎn)碳水化合物酶的菌株，成為分離篩選優(yōu)良產(chǎn)酶菌株新依據(jù)。

本研究以大曲中分離、篩選的嗜熱真菌GZFH7為研究對(duì)象，對(duì)該菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定，并對(duì)其誘導(dǎo)的嗜熱甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究該菌株產(chǎn)碳水化合物活性酶的性能，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株GZFH7篩選自貴州醬香型大曲，并由本實(shí)驗(yàn)室于4 ℃保存；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、真菌通用引物ITS1、ITS4、PCR mix、ddH2O 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；乳酸酚棉藍(lán)染色液 青島海博生物技術(shù)有限公司；Oligo（dT）磁珠 無錫百邁格生物科技有限公司。。

基礎(chǔ)鹽溶液：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2的質(zhì)量濃度分別為1.00、1.00、0.01、5.00、0.20 g/L。

魔芋發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎(chǔ)鹽溶液中加入魔芋膠、酵母浸粉質(zhì)量濃度均為3.00 g/L；多碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎(chǔ)鹽溶液中加入魔芋膠、麩皮、酒糟質(zhì)量濃度均為1.00 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

MJX-250B-Z恒溫霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MODEL YS100電子顯微鏡 日本Nikon公司；TU-1810PC紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；NDJ-5S數(shù)字式黏度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；CR-G立式高速低溫離心機(jī)日本Hitachi公司；Biometra Tprofessional聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

取研碎的大曲樣品10.0 g于100 mL無菌水中，于37 ℃、150 r/min搖床振蕩2 h。靜置后取上清液，用無菌水適當(dāng)稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基，45 ℃倒置培養(yǎng)，挑取單菌落點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基上，分離、純化得到的單一菌株保藏于麩皮管中，4 ℃存放、備用。

1.3.2 粗酶液的制備

將保藏于麩皮管的GZFH7接種于PDB活化培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)1 d。按1%的接菌量從活化培養(yǎng)基中吸取菌液加入魔芋發(fā)酵培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為粗酶液，4 ℃?zhèn)溆弥苽浜玫拇置敢骸?/p>

1.3.3 菌株的鑒定

1.3.3.1 菌株嗜熱性鑒定

將菌株GZFH7點(diǎn)植于PDA平板中心處，分別于19、45 ℃倒置培養(yǎng)，觀察并記錄菌株的生長情況。

1.3.3.2 菌落形態(tài)特征觀察

采用點(diǎn)植法將GZFH7接種于PDA平板中，45 ℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落的形狀、大小、顏色及生長狀況等情況并進(jìn)行記錄，對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)[22]，初步確定菌株的種屬地位。

采用棉藍(lán)染色法[23]進(jìn)行制片觀察：于潔凈的載玻片中央滴一滴乳酸酚棉藍(lán)染色液，用接種環(huán)挑取GZFH7平板中的少量帶有孢子的菌絲置于染液中，細(xì)心地將菌絲挑散開，加蓋玻片，在電子顯微鏡40 倍鏡觀察霉菌形態(tài)，記錄菌株菌絲孢子、孢子囊以及孢子梗的形態(tài)特征。

1.3.3.3 菌株的分子鑒定

采用CTAB法提取菌株GZFH7的基因組DNA；獲得的基因組DNA經(jīng)ITS序列PCR擴(kuò)增后，得到的PCR產(chǎn)物由華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.gov/blast/）進(jìn)行BLAST同源性分析，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析。

1.3.4 生長曲線的測(cè)定

采用菌落直線生長法測(cè)定菌株GZFH7的生長曲線[23]，將菌株GZFH7點(diǎn)植于PDA平板中心處，45 ℃倒置培養(yǎng)，分別在6、11、23、25、29、36、48、54、56 h（菌落長滿整個(gè)平板）測(cè)其菌落直徑，繪制菌株的生長曲線。

1.3.5 甘露聚糖酶活力的測(cè)定

參考Miller[24]的3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）方法。取100 μL適當(dāng)稀釋酶液和900 μL角豆膠（底物由pH 5.0、50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制、體積分?jǐn)?shù)0.5%），以甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度（1.3.6.1節(jié)方法）進(jìn)行水浴反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)。對(duì)照則在加入1.5 mL DNS后，補(bǔ)加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min后冷卻至室溫，在540 nm波長處測(cè)定吸光度。

酶活力單位（U）：以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為1 U。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

酶液與底物在不同溫度（20、30、40、50、60、70、80、90 ℃）進(jìn)行反應(yīng)，按1.3.5節(jié)的方法測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，測(cè)定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.6.2 最適反應(yīng)pH值的測(cè)定

在最適反應(yīng)溫度，酶液與不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的底物進(jìn)行反應(yīng)，按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，測(cè)定酶的最適反應(yīng)pH值。

1.3.6.3 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

在最適反應(yīng)pH值，按照1.3.6.1節(jié)的方法測(cè)酶液在最適反應(yīng)溫度，及最適反應(yīng)溫度浮動(dòng)10 ℃處理不同時(shí)間（0、2、5、10、20、30 min和60 min）的酶活力，以最高酶活力為100%，研究甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.4 pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

用不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的緩沖液稀釋酶液后，冰浴1 h。最適反應(yīng)溫度按1.3.5節(jié)的方法測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，研究甘露聚糖酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.7 酶解產(chǎn)物黏度的測(cè)定

粗酶液與體積分?jǐn)?shù)1%魔芋膠底物1∶2（V/V），70 ℃水浴反應(yīng)1 h后，迅速冷卻至室溫，測(cè)其黏度。通過比較滅活酶液與正常酶液反應(yīng)產(chǎn)物的黏度差異，反映甘露聚糖酶降解甘露聚糖酶的能力大小。

1.3.8 平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）的測(cè)定及計(jì)算

聚合度是指組成寡糖的單糖單位的個(gè)數(shù)，mDP越接近于1則底物水解越徹底。直接還原糖與總還原糖參照Somogyi等[25]的方法測(cè)定，mDP按下式計(jì)算：

式中：C1、C2分別為酶解液中總糖和還原糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.9 菌株GZFH7的碳源譜測(cè)定分析

不同碳源固體培養(yǎng)基的配制參照Hüttner等[26]的方法，將菌株點(diǎn)分別植于含有不同單一碳源（果膠、纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)、可溶性淀粉、殼聚糖、魔芋精粉）的固體培養(yǎng)基上，相同條件培養(yǎng)相同時(shí)間，以PDA平板作為對(duì)照，觀察菌株GZFH7的生長狀況。

1.3.10 菌株GZFH7的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

菌株GZFH7接入多碳源發(fā)酵培養(yǎng)基，45 ℃搖床培養(yǎng)3 d后收集菌體。采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)其濃度及純度，完整性采用RNA專用瓊脂糖電泳或者Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測(cè)定、分析。通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷約長度為300 bp的片段，并以此為模板構(gòu)建表達(dá)文庫。

采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集，之后根據(jù)片段長度進(jìn)行文庫選擇，文庫長度在450 bp。通過Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫進(jìn)行質(zhì)檢，再對(duì)文庫總濃度及有效濃度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)文庫的有效濃度及文庫所需數(shù)據(jù)量，將含有不同Index序列的文庫按比例進(jìn)行混合?；旌衔膸旖y(tǒng)一稀釋到2 nmol/L通過堿變性，形成單鏈文庫。

采用第2代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)這些文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得長度約380 bp測(cè)序reads。對(duì)獲得的原始測(cè)序序列進(jìn)行分析，去除帶接頭、長度小于50 bp、序列平均質(zhì)量低于Q20的Reads。對(duì)得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行從頭拼接得到轉(zhuǎn)錄本序列。對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類，挑選最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，最后用Unigene進(jìn)行后續(xù)無參轉(zhuǎn)錄組分析，并依據(jù)CAZymes數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org/）分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，利用Excel和SPSS19.0軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

在19 ℃培養(yǎng)3 d，菌株GZFH7幾乎不生長。45 ℃培養(yǎng)3 d后，該菌株生長旺盛，菌絲如圖1A所示，可鋪滿整個(gè)平皿。生長初期菌落呈白色絨毛狀，后期變成灰褐色厚氈狀，且菌落表面粗糙。如圖1B所示，顯微鏡可觀察到菌絲有較多分支，且匍匐絲彼此有間隔，囊軸呈球形，孢囊孢子的形狀有球形，橢圓形以及其他形狀。對(duì)菌株GZFH7的ITS PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果如圖1C所示。菌株GZFH7與微小根毛霉（Rhizomucor pusillusT3B）的相似度為100%，并且位于進(jìn)化樹的同一分支中，親緣關(guān)系相近，因此判斷該菌為微小根毛霉，命名為R.pusillusGZFH7。

圖1 菌株GZFH7菌落特征（A）、微觀鏡像（B）及系統(tǒng)發(fā)育樹（C）Fig.1 Colony characteristics (A), microscopic image (B), and phylogenetic tree (C) of strain GZFH7

2.2 菌株生長和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

如圖2所示，0～10 h為該菌株的生長停滯期，10～54 h之間菌株迅速生長，生物量迅速增加，此階段為快速生長期，此后隨培養(yǎng)時(shí)間延長，菌株的生物量趨于平穩(wěn)，即進(jìn)入穩(wěn)定期。通過對(duì)GZFH7甘露聚糖酶活力測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)該菌在迅速生長期開始進(jìn)行產(chǎn)酶，其產(chǎn)酶量隨菌株自身的生長而增加。直至穩(wěn)定期，甘露聚糖酶產(chǎn)酶量達(dá)到穩(wěn)定值9.5 U/mL，之后隨發(fā)酵時(shí)間延長，產(chǎn)酶量幾乎不再增加。因此，GZFH7菌株在45 ℃生長迅速，能夠短周期發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶。

圖2 菌株GZFH7生長及產(chǎn)酶曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production curve of strain GZFH7

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

由圖3A可知，菌株GZFH7誘導(dǎo)甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，屬于嗜熱酶。在50～80 ℃范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力均可達(dá)到50%以上。如圖3B所示，甘露聚糖酶在60 ℃熱處理1 h，其相對(duì)酶活力在90%以上；70 ℃處理1 h，酶活力基本保持不變；當(dāng)該酶在80 ℃處理30 min，能保持高于50%的酶活力，且在處理1 h后，依然能夠維持大約50%的酶活力。因此，菌株GZFH7所產(chǎn)的甘露聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性。如圖3C所示，甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為5.0，底物pH 4.0～6.0范圍內(nèi)時(shí)，能夠維持50%以上的酶活力，具有一定的pH值適應(yīng)性。如圖3D所示，甘露聚糖酶在pH 2.0～12.0范圍內(nèi)均表現(xiàn)一定的酶活力，在酸性范圍內(nèi)（2.0＜pH＜6.0）酶活力較高，能夠維持70%以上的酶活力。酶活力隨pH值從5.0開始增加而降低。

圖3 甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig.3 Enzymatic properties of mannanase

2.4 酶解產(chǎn)物黏度及mDP計(jì)算

經(jīng)酶水解后，魔芋膠溶液的黏度由125 mPa·s降低為74 mPa·s，該結(jié)果表明菌株GZFH7產(chǎn)生的甘露聚糖酶可有效降解魔芋膠，使其由黏度較高的甘露聚糖降解為黏度較低的甘露低聚糖。測(cè)得酶解產(chǎn)物的直接還原糖質(zhì)量濃度為0.39 mg/mL，總還原糖質(zhì)量濃度為0.37 mg/mL，mDP為0.96，接近于1。該結(jié)果表明由菌株GZFH7產(chǎn)生的甘露聚糖酶可較徹底的降解魔芋膠，酶的水解能力較高。

2.5 菌株GZFH7的碳源譜分析

對(duì)菌株的碳源譜進(jìn)行探究，根據(jù)其在不同碳源平板上的生長狀況，可對(duì)該菌株的產(chǎn)酶能力進(jìn)行初步判斷。菌株GZFH7在不同碳源上的生長情況如圖4所示，45 ℃培養(yǎng)相同時(shí)間后，分別以果膠、纖維素、木聚糖、淀粉、魔芋精粉為單一碳源的生長情況分別如圖4B、C、D、F、H所示，菌株長勢(shì)良好，菌絲均布滿整個(gè)平板。以幾丁質(zhì)、殼聚糖為單一碳源的生長情況分別如圖4E、G所示，菌株長勢(shì)較差。另外菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致，但產(chǎn)生色素情況差異較大。因此，菌株GZFH7碳源譜較廣，除了產(chǎn)生甘露聚糖酶外，還具有產(chǎn)果膠酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶等的可能性，是待開發(fā)利用的理想菌株，在食品工業(yè)酶制劑生產(chǎn)中有較大應(yīng)用潛能。

圖4 菌株GZFH7在單一碳源平板上的生長情況Fig.4 Growth status of strain GZFH7 on single carbon source plates

2.6 菌株GZFH7的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.6.1 Unigene的功能注釋分析

對(duì)Unigene進(jìn)行基因功能注釋。在Nr數(shù)據(jù)庫中被注釋到的Unigene最多，共8 586 個(gè)，占總數(shù)的69.73%；其次為eggNOG數(shù)據(jù)庫和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，分別為6 876、6 543 個(gè)，占總數(shù)的55.84%和53.13%；在數(shù)據(jù)庫Pfam中被注釋到的最少為1 588 個(gè)，僅占12.90%。778 個(gè)Unigene在所有的數(shù)據(jù)庫中都被注釋到，占總數(shù)的6.32%。

通過BLAST程序，將Unigene序列與Nr數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共有8 586 個(gè)Unigene被注釋到，占總Unigene的69.73%。微小根毛霉GZFH7轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝的Unigene與橫梗霉的相似性最多，為2 810 個(gè)，占32.75%；其次是傘狀毛霉菌，比對(duì)上的Unigene為2 262 個(gè)，占26.36%。值得注意的是，有19.75%的Unigene屬于其他序列，可能包含微小根毛霉與大多數(shù)物種不同的、自身特有的基因序列。

對(duì)微小根毛霉Unigene進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能分析。有4 987 個(gè)Unigene被注釋到，共分為3 類41 個(gè)分支。統(tǒng)計(jì)每一類的基因數(shù)量發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞組成類的13 個(gè)分支中，涉及本轉(zhuǎn)錄組的Unigene最多，為11 124 個(gè)；生物過程類次之，為9 951 個(gè)；分子功能類最少，為5 452 個(gè)。其中細(xì)胞過程（2 645 個(gè)）、代謝過程（2 491 個(gè)）、催化活性（2 398 個(gè)）、細(xì)胞（2 367 個(gè)）、細(xì)胞組分（2 354 個(gè)）及連接（2 267 個(gè)）功能組涉及的Unigene較多，多細(xì)胞生物過程（8 個(gè)）、病毒（8 個(gè)）、病毒組分（8 個(gè)）、擬核（5 個(gè)）、通道調(diào)節(jié)活性（2 個(gè)）、蛋白標(biāo)簽（2 個(gè)）及翻譯調(diào)節(jié)器活動(dòng)（2 個(gè)）功能組涉及的Unigene較少。

經(jīng)Unigene的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫注釋分析，微小根毛霉GZFH7共有4 367 個(gè)Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中被注釋到，占總Unigene的35.46%，共涉及代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物系統(tǒng)以及細(xì)胞過程中5 個(gè)一級(jí)層級(jí)。其中被注釋最多基因個(gè)數(shù)的為遺傳信息處理過程中的翻譯（494 個(gè)），其次是環(huán)境信息處理中的信號(hào)傳導(dǎo)（469 個(gè)）、代謝過程中的碳水化合物代謝（464 個(gè)）。生物系統(tǒng)過程中被注釋最多基因個(gè)數(shù)的為內(nèi)分泌系統(tǒng)（232 個(gè)），細(xì)胞過程中被注釋最多基因個(gè)數(shù)的為運(yùn)輸和分解代謝（313 個(gè)）。這些Unigene及其注釋信息為今后對(duì)菌株GZFH7的代謝途徑及相關(guān)功能基因的更進(jìn)一步研究提供一定理論依據(jù)。

2.6.2 菌株CAZymes基因表達(dá)分析

通過對(duì)菌株GZFH7的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共獲得該菌的4.38×107條reads，數(shù)據(jù)量為6.56×109bp，GC含量為46.80%，Q20值為97.36%，Q30值為92.95%，Clean Data值為93.76%。大部分堿基序列Q值分布在33～37之間，代表堿基質(zhì)量良好，可進(jìn)行后續(xù)分析。

以魔芋膠、麩皮以及酒糟的混合物為碳源時(shí)，菌株GZFH7共有253 個(gè)CAZymes基因表達(dá)，表達(dá)結(jié)果如圖5所示，其中包括31 個(gè)CEs基因，95 個(gè)GHs基因，104 個(gè)GTs基因，1 個(gè)PLs基因，16 個(gè)AAs基因以及6 個(gè)CBMs基因，與Hüttner等[27]對(duì)R.pusillusFCH 5.7的研究結(jié)果基本一致（12 個(gè)CEs基因、81 個(gè)GHs基因、77 個(gè)GTs基因、2 個(gè)PLs基因、11 個(gè)AAs基因、1 個(gè)CBMs基因）。其中GTs基因的表達(dá)最為豐富，約占CAZymes酶類表達(dá)總數(shù)的41.1%，約占總GTs家族的27.4%（29 種），主要包括纖維素合成酶、幾丁質(zhì)合成酶、透明質(zhì)酸合成酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖合成酶、乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸合成酶等。其次為GHs基因，約占CAZymes酶類表達(dá)總數(shù)的37.5%，約占總GHs家族的22.2%（34 種），主要種類有幾丁質(zhì)酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、海藻糖酶等。因此，菌株R.pusillusGZFH7酶系較豐富，是高效產(chǎn)碳水化合物活性酶的菌株。

圖5 R.pusillus GZFH7碳水化合物活性酶基因表達(dá)分布Fig.5 Distribution of CAZymes gene expression in R.pusillus GZFH7

3 討 論

微生物來源的甘露聚糖酶因其資源豐富、成本低、易培養(yǎng)、活性高等優(yōu)勢(shì)[17,28]，是科學(xué)研究以及工業(yè)應(yīng)用的長期熱點(diǎn)。大曲所含微生物種類豐富，組成復(fù)雜，是極具利用價(jià)值的資源庫[29-30]。菌株GZFH7為大曲中分離、篩選的嗜熱真菌，通過對(duì)其菌落形態(tài)特征觀察以及ITS序列分子鑒定，判定該菌為微小根毛霉（R.pusillus），命名為R.pusillusGZFH7?，F(xiàn)階段研究的較多的是利用微小根毛霉產(chǎn)凝乳酶[31]，除凝乳酶之外，還有其他一些已產(chǎn)生并鑒定編碼的酶，如聚半乳糖醛酸酶、糖淀粉酶、植酸酶和葡聚糖酶[27]。姚燦等[32]發(fā)現(xiàn)該嗜熱真菌能產(chǎn)生淀粉酶和酸性淀粉酶，具有應(yīng)用于白酒生產(chǎn)的開發(fā)潛力。但利用微小根毛霉產(chǎn)甘露聚糖酶的研究鮮有報(bào)道。

目前，實(shí)際投入生產(chǎn)應(yīng)用的甘露聚糖酶大多為中低溫酶且熱穩(wěn)定性較差，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)過程中部分高溫環(huán)節(jié)對(duì)溫度的要求。如來源于密黏褶菌ATCC 11539的甘露聚糖酶，在50 ℃處理30 min，酶活力剩余60%[33]；來源于枯草芽孢桿菌MAFIC-S11的β-甘露聚糖酶Mann S，在60 ℃處理10 min，酶活力僅剩余10%[34]。菌株GZFH7所產(chǎn)的甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度70 ℃，為嗜熱酶，并且該酶在70 ℃處理1 h仍能維持原酶活力不變，熱穩(wěn)定性優(yōu)良。該嗜熱甘露聚糖的最適pH值為5.0，與目前已獲得的大多數(shù)真菌來源的甘露聚糖酶的最適pH值一致[35-37]，且在pH 2.0～11.0的范圍內(nèi)均表現(xiàn)較理想的pH值耐受性。該酶滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，有效解決甘露聚糖酶的生產(chǎn)應(yīng)用受限問題。魔芋膠溶液（1%）經(jīng)酶解后黏度降低51 mPa·s，且酶解產(chǎn)物的mDP為0.96，而多數(shù)β-甘露聚糖酶水解魔芋膠、角豆膠等主要產(chǎn)生聚合度為2～5的甘露寡糖和一些帶半乳糖殘基側(cè)鏈的半乳甘露寡糖[38]。此結(jié)果很可能是由于粗酶液中的甘露聚糖酶與其中的多種酶協(xié)同作用而導(dǎo)致的。

菌株GZFH7在不同單一碳源的平板上45 ℃培養(yǎng)時(shí)均能生長，其中以果膠、纖維素、木聚糖、淀粉、魔芋精粉為單一碳源的平板長勢(shì)較好，以幾丁質(zhì)、殼聚糖為單一碳源的平板，長勢(shì)較差，這可能是由于R.pusillusGZFH7中缺乏參與幾丁質(zhì)、殼聚糖降解的基因?qū)е碌?。?jīng)轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)253 個(gè)CAZymes基因表達(dá)，其中包括以纖維素合成酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖合成酶、乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶等為主的GTs，以及以幾丁質(zhì)酶、半乳糖苷酶、淀粉酶等為主的GHs。綜上所述，菌株R.pusillusGZFH7碳源譜較廣，酶系豐富，是一株高效產(chǎn)碳水化合物活性酶的菌株，具有較高的研發(fā)利用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究從大曲中分離嗜熱真菌微小根毛霉R.pusillusGZFH7，在對(duì)該菌株誘導(dǎo)的甘露聚糖酶進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)研究的同時(shí)，對(duì)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析。微小根毛霉GZFH7為嗜熱真菌，其誘導(dǎo)的嗜熱甘露聚糖酶有較好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果表明，菌株GZFH7有較好的產(chǎn)碳水化合物活性酶的能力。本研究不僅豐富嗜熱甘露聚糖酶資源，同時(shí)也為微小根毛霉GZFH7在酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。