趙 樂，張曉桐，劉利軍，謝水琪，靳奇文，孟祥晨*

（東北農業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為具有重要經(jīng)濟價值的乳酸菌被廣泛應用于食品發(fā)酵與保鮮防腐領域，由于其代謝過程中會產(chǎn)生具有廣譜抑菌特性、對熱穩(wěn)定且易被蛋白酶水解的細菌素，因而有作為天然食品生物防腐劑的巨大應用潛力[1]。有研究發(fā)現(xiàn)前體物質或代謝中間產(chǎn)物往往具有誘導目標產(chǎn)物合成的作用，又因為細菌素是蛋白質或多肽類物質，因此氨基酸可以作為合成細菌素的外源誘導物[2]。本課題組系統(tǒng)研究了L.plantarumKLDS1.0391產(chǎn)細菌素的特點[3]，其所產(chǎn)細菌素N末端的氨基酸組成為纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸，但還不清楚該菌細菌素合成是否受上述氨基酸調節(jié)。有研究稱，氨基酸不僅是細菌素的合成底物，還可能發(fā)揮著其他一些功能，如對細菌素合成、釋放及調控過程中相關酶的誘導[4]。Vazquez等[5]在研究多種氨基酸及其組合方式對Nisin合成的影響時發(fā)現(xiàn)，生物質能的產(chǎn)生依賴于多種相互作用，而細菌素的產(chǎn)生僅受半胱氨酸和色氨酸的刺激，其中脯氨酸抑制Nisin的合成。易華西[6]在研究氨基酸種類及外源添加物對細菌素合成量的影響時，發(fā)現(xiàn)只有半胱氨酸和甘氨酸可顯著誘導細菌素Bac-J23的合成。目前，氨基酸在調節(jié)信號分子的產(chǎn)生及調控細菌素合成相關基因的表達等方面的報道還很有限，且氨基酸對細菌素加工和釋放過程中的轉運蛋白、信號肽及組氨酸蛋白激酶等具有誘導作用也僅處于猜測階段。因此，氨基酸對乳酸菌細菌素的調控機理還有待于進一步研究。

本研究旨在通過測定L.plantarumKLDS1.0391菌株在氨基酸脅迫下的生長及細菌素合成情況，并從基因水平上分析氨基酸對細菌素結構基因、群體感應相關基因及氨基酸代謝關鍵基因表達的影響，旨在為進一步研究氨基酸對細菌素的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

L.plantarumKLDS1.0391野生型菌株保藏于乳品科學教育部重點實驗室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC6633，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基參考文獻[7]配制；化學成分確定培養(yǎng)基（chemically defined medium，CDM）參照Vazquez等[5]的方法進行配制。

1.1.3 試劑

Primer ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、TB Green?Premix ExTaq? II實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒、DL5000/2000 DNA Marker 寶生物工程有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA polymerase天根生化科技有限公司；過氧化氫酶、乳酸（均為色譜純） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Uvmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司；光學顯微鏡 上海光學儀器一廠；GL-21M高速冷凍離心機上海市離心機械研究所；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；9700 PCR擴增儀 美國Applied Biosystem公司；Step One PlusTMreal-time PCR儀 美國Thermo Fisher公司；1000超微量分光光度計 美國Nanodrop公司；LGJ-1冷凍干燥機上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

取-80 ℃冰箱中保藏的L.plantarumKLDS1.0391接種至MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)16 h，B.subtilisATCC6633接種至LB培養(yǎng)基中于30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，活化3 代后用于實驗。

1.3.2 氨基酸缺失對L.plantarumKLDS1.0391生長及細菌素合成的影響

取10 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液，經(jīng)離心后用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3 次后重懸于該緩沖液中，再以2%接種量分別接種于MRS、CDM和20 種氨基酸分別單缺失的CDM中，37 ℃培養(yǎng)28 h，每隔2 h取樣，在波長600 nm處測定光密度值（OD600nm），同時采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)活菌數(shù)，繪制生長曲線，另取20 mL菌液用于細菌素效價測定。

1.3.3 細菌素效價的測定

菌液排除酸和過氧化氫的干擾，并經(jīng)膜過濾后凍干濃縮，以B.subtilis作為上層指示菌，利用雙層平板打孔法測量抑菌圈直徑[8]，并進行細菌素效價的換算[9]，同時記錄能觀察到明顯抑菌圈的最高稀釋倍數(shù)（D）。抑菌圈直徑與稀釋度關系見式（1）：

式中：R為抑菌圈直徑/mm；d為稀釋度，即上樣量/稀釋倍數(shù)；a、b為待測系數(shù)。

抑菌圈直徑與細菌素效價的換算見式（2）：

據(jù)此獲得37 ℃條件下L.plantarumKLDS1.0391在CDM培養(yǎng)24 h的細菌素抑菌活性標準曲線：y=9.421 1x+0.693 9，其中，y代表抑菌圈直徑（mm），x代表稀釋度的對數(shù)值。

1.3.4 乳酸含量的測定

分別取在20 種氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液各1.5 mL，12 000 r/min離心15 min，將發(fā)酵上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用高效液相色譜法測定乳酸含量，以全CDM為對照。

色譜條件[10]：色譜柱：Biorad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動相：5 mmol/L硫酸溶液；檢測波長：254 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：65 ℃；進樣量：10 μL。

在上述條件下，獲得乳酸保留時間為（14.54±0.02）min，標準曲線為y=920 334x-37 495，R2=0.998 9，其中y表示乳酸液相色譜中的峰面積（mV·s），x表示乳酸的質量濃度（g/L）。

1.3.5 賴氨酸脅迫對L.plantarumKLDS1.0391生長及細菌素合成的影響

調節(jié)CDM中賴氨酸質量濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 g/L，以2%接種量接種L.plantarumKLDS1.0391，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測定細菌素效價并采用平板菌落法計數(shù)活菌數(shù)量。

1.3.6 real-time PCR測定基因相對表達量

1.3.6.1 菌體收集

將L.plantarumKLDS1.0391以2%接種量分別接種至全CDM、賴氨酸單缺失的CDM，以及賴氨酸添加量分別為0.1、1.0、2.0 g/L的CDM中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取500 μL于4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體。

1.3.6.2 RNA的提取及逆轉錄

按照天根RNA prep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒說明書提取菌體總RNA，根據(jù)所提取的RNA濃度，通過去除基因組DNA反應對即將逆轉錄的RNA含量進行歸一化。具體按Primer ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書在冰浴條件下混合體系并合成cDNA，合成后于-20 ℃保存。

1.3.6.3 real-time PCR引物設計

采用Primer 5.0軟件設計real-time PCR所用引物（表1），部分引物的設計參照文獻[11]。

表1 real-time PCR引物及條件Table 1 Real-time PCR primers and conditions

1.3.6.4 real-time PCR擴增實驗

以16S rDNA作為內參基因，反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共進行40 個循環(huán)，并記錄循環(huán)閾值（Ct值）。以2-ΔΔCt相對定量法分析不同樣品基因的表達差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 L.plantarum KLDS1.0391在MRS與CDM中的生長及抑菌活性

L.plantarumKLDS1.0391在CDM和MRS中生長的遲滯期分別為0～2 h和0～4 h，前者在10 h后進入穩(wěn)定期，后者在12 h后進入穩(wěn)定期（圖1）。菌株在MRS和CDM中培養(yǎng)24 h時OD600nm分別為1.79±0.02和1.32±0.01，抑菌圈直徑分別為（23.36±0.32）mm和（19.99±0.45）mm。雖然L.plantarumKLDS1.0391在MRS培養(yǎng)基中比CDM中生長能力更強，但CDM的組成成分明確，培養(yǎng)24 h時菌體濃度滿足后續(xù)實驗要求，所以選擇CDM作為后續(xù)氨基酸單缺失實驗的基礎培養(yǎng)基。由于抑菌活性在培養(yǎng)24 h時達到最大（圖1），因此選擇培養(yǎng)24 h取樣測定抑菌活性。

圖1 L.plantarum KLDS1.0391在MRS與CDM中的生長及抑菌活性Fig.1 Growth and antibacterial activity of L.plantarum KLDS1.0391 in MRS and CDM

2.2 氨基酸單缺失對L.plantarum KLDS1.0391生長和抑菌活性的影響

采用單個氨基酸遺漏技術探究氨基酸對L.plantarumKLDS1.0391生長的影響，結果見圖2。研究發(fā)現(xiàn)大部分情況下該菌能夠在單獨缺失一種氨基酸的培養(yǎng)基中生長良好，并于9～10 h達到對數(shù)期末期。苯丙氨酸家族氨基酸中（圖2A），除色氨酸的缺失不利于菌體生長外，其余氨基酸的缺失對菌體生長影響較?。槐峒易灏被嶂校▓D2B），纈氨酸和丙氨酸的缺失會嚴重抑制該菌生長，培養(yǎng)12 h時OD600nm分別為0.55±0.01和0.54±0.02，而亮氨酸和異亮氨酸的缺失對KLDS1.0391的生長基本沒有影響，發(fā)酵12 h時OD600nm分別為0.94±0.01和0.93±0.02，菌株基本保持了在全CDM中的生長水平；絲氨酸家族氨基酸中（圖2E），甘氨酸的缺失導致該菌生長遲緩，培養(yǎng)12 h時OD600nm僅為0.50±0.01。結果表明，當CDM中缺失丙氨酸（圖2B）、天冬氨酸（圖2C）、纈氨酸（圖2B）、甘氨酸（圖2E）或谷氨酸（圖2D）會嚴重阻礙L.plantarumKLDS1.0391的生長，培養(yǎng)14 h后OD600nm僅維持在0.50～0.65之間，推測上述5 種氨基酸為L.plantarumKLDS1.0391生長的必需氨基酸。

圖2 L.plantarum KLDS1.0391在缺失單氨基酸的CDM中的生長Fig.2 Growth of L.plantarum KLDS1.0391 in CDM medium deficient in single amino acids

圖3結果表明，天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺缺失，導致L.plantarumKLDS1.0391菌落總數(shù)和細菌素合成量均顯著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸及纈氨酸缺失僅影響菌體生長，對細菌素合成無明顯影響。經(jīng)平板菌落總數(shù)計數(shù)發(fā)現(xiàn)，與全CDM相比，當培養(yǎng)基中分別缺失賴氨酸和甲硫氨酸，活菌數(shù)分別下降了3.09%和2.28%，但兩者發(fā)酵上清液的抑菌活性則分別降低了44.21%和34.10%（圖3）。由此推測，由于賴氨酸和甲硫氨酸單缺失導致的生長稍緩慢不是該菌細菌素合成量顯著下降的主要原因。

圖3 L.plantarum KLDS1.0391在氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)量及抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium deficient in single amino acids for 24 h

2.3 氨基酸單缺失對L.plantarum KLDS1.0391培養(yǎng)上清液乳酸含量的影響

與全CDM相比，賴氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及蘇氨酸這9 種氨基酸分別單缺失后，乳酸含量升高。其中，賴氨酸及甲硫氨酸單缺失后細菌素抑菌活性下降，而乳酸含量較全CDM對照組分別提高了5.10%及4.20%。其余11 種氨基酸的單缺失均導致乳酸含量下降，其中丙氨酸單缺失后乳酸含量較對照組下降了16.16%。由此推測，氨基酸單缺失使得胞內碳源代謝重新定向，不同氨基酸的缺失導致碳源流向乳酸合成支路的流量存在較大差異。

圖4 L.plantarum KLDS1.0391在氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的乳酸含量Fig.4 Lactic acid content in the culture supernatant of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium deficient in single amino acids for 24 h

2.4 外源賴氨酸對L.plantarum KLDS1.0391生長和抑菌活性的影響

上述研究結果表明，賴氨酸顯著影響該菌株抑菌活性，因此進一步研究了外源添加不同質量濃度賴氨酸對該菌生長及抑菌活性的影響，結果表明：菌體數(shù)量隨外源賴氨酸添加量變化無顯著差異（P＞0.05）（圖5A）。在賴氨酸質量濃度達到2.0 g/L前，隨其質量濃度遞增細菌素合成量也隨之增大（圖5B）。當賴氨酸質量濃度為0.1 g/L和1.0 g/L時，細菌素抑菌活性分別為1 638.54 AU/mL和2 002.83 AU/mL。繼續(xù)增至2.0 g/L時，抑菌活性達到最大值2 260.98 AU/mL。當賴氨酸質量濃度超過2.0 g/L后，隨其質量濃度的升高抑菌活性反而下降。當其質量濃度增至5.0 g/L和10.0 g/L時，抑菌活性分別為2 232.11 AU/mL和1 993.49 AU/mL。該結果顯示，過量賴氨酸會產(chǎn)生反饋抑制效果，脅迫或抑制細菌素的合成分泌。由此表明賴氨酸對菌體生長無顯著影響，但卻與細菌素分泌表達密切關聯(lián)。

圖5 L.plantarum KLDS1.0391在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)24 h后的菌體數(shù)量（A）及抑菌活性（B）Fig.5 Growth (A) and antibacterial activity (B) of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium supplemented with Lys

2.5 賴氨酸脅迫對L.plantarum KLDS1.0391相關基因表達的影響

2.5.1 菌株在賴氨酸缺失CDM中培養(yǎng)時相關基因的表達L.plantarumKLDS1.0391在缺失賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h時，細菌素結構基因plnEF、群體感應調節(jié)基因plnD與plNC8HK的表達量均顯著下調，而編碼賴氨酸合成途徑中關鍵酶的基因dapG和yclM表達量卻顯著上調（圖6）。其中基因plnEF、plnD與plNC8HK分別下調33%、18%和23%（P＜0.01），而基因dapG和yclM分別上調至對照組的2.46 倍和1.74 倍。表明基因dapG和yclM在氨基酸合成通路中起協(xié)同作用，賴氨酸缺失后二者表達上調進而合成蛋白質以保證菌株正常生長代謝。

圖6 L.plantarum KLDS1.0391在賴氨酸缺失CDM中培養(yǎng)24 h后相關基因的表達Fig.6 Expression of related genes in L.plantarum KLDS1.0391 cultured in Lys-deficient CDM for 24 h

2.5.2 菌株在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)時相關基因的表達菌株在賴氨酸質量濃度為0.1 g/L條件下培養(yǎng)24 h后，基因plnEF、plnD與plNC8HK分別上調至對照組的1.49、1.22 倍和1.30 倍（圖7）；當賴氨酸質量濃度增至2.0 g/L時，上述基因分別上調2.10、1.72 倍和1.81 倍（P＜0.01）。研究結果顯示，CDM中，隨賴氨酸添加量增大，細菌素合成相關基因上調水平也隨之增加。而基因dapG和yclM卻受誘導表達下調，當賴氨酸質量濃度為1.0 g/L時，二者分別下調65%和50%；當外源添加2.0 g/L賴氨酸后，二者則分別下調69%和58%。綜上，與細菌素及氨基酸合成相關的基因上下調倍數(shù)具有濃度依賴性。

圖7 L.plantarum KLDS1.0391在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)24 h后相關基因的表達Fig.7 Expression of related genes in L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium supplemented with Lys for 24 h

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumKLDS1.0391在單氨基酸缺失CDM中的生長較全CDM均有所下降，這可能是由于營養(yǎng)物質不全或氨基酸未能達到最佳比例，導致菌體代謝效率下降進而影響生長繁殖。Chopin[12]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、亮氨酸及異亮氨酸6 種氨基酸是大部分乳酸菌生長的必需氨基酸，而Amoroso等[13]研究了4 株不同酒酒球菌對氨基酸的需求，結果表明大多數(shù)乳酸菌生長所不可或缺的氨基酸分別是天冬酰胺、異亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。本實驗結果表明，丙氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸和精氨酸是L.plantarumKLDS1.0391生長的必需氨基酸，由此可以看出菌株對不同氨基酸的需求模式因種屬差異而有明顯不同。本研究中，亮氨酸和異亮氨酸的缺失幾乎不影響該菌株生長，由氨基酸代謝通路可知，異亮氨酸可經(jīng)蘇氨酸脫氨或蘇氨酸脫氨基酶催化天冬氨酸等多種途徑合成[14]，因此該菌株在外源缺失異亮氨酸時還可正常代謝。Chen He等[15]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸和賴氨酸對Streptococcus thermophilus的生長有顯著促進作用，且活菌數(shù)與氨基酸濃度呈正比關系。本實驗谷氨酸家族氨基酸中，除谷氨酸的缺失顯著影響L.plantarumKLDS1.0391的生長外，其余氨基酸的缺失對菌體生長影響不大，這與Chen He等[15]的研究結果基本一致。L.plantarumKLDS1.0391在甘氨酸缺失后菌體幾乎停止生長，穩(wěn)定期末期OD600nm僅為0.50±0.01，有研究報道甘氨酸可調控胞內多種代謝途徑，如糖異生、嘌呤合成、谷胱甘肽的合成途徑等[16]，由此推測甘氨酸缺失可間接導致胞內能源物質減少進而影響菌體生長。Stuart等[17]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠作為菌株代謝合成某些生長必需營養(yǎng)因子的前體物質，精氨酸會通過代謝產(chǎn)能（ADI途徑）進而促進菌體量增加。本研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中缺失精氨酸時，L.plantarumKLDS1.0391的生長速率減緩，再次說明精氨酸可通過ADI途徑為菌體生長提供某種重要前體物質及能量。

目前，可通過篩選細菌素高產(chǎn)菌株[18]、優(yōu)化發(fā)酵條件[19]、異源表達[20]、脅迫刺激和誘導調控等技術使乳酸菌細菌素高效表達[21]，但多數(shù)研究都聚焦于遺傳學方法[22]，而通過外源物質誘導提高細菌素是基于代謝及轉錄水平的調控且不涉及安全問題，因此有必要系統(tǒng)的研究培養(yǎng)基成分對細菌素的調控。Kuipers[23]和Diep[24]等發(fā)現(xiàn)單個氨基酸可誘導細菌素或相關肽的合成，本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的賴氨酸對細菌素合成起正向調控作用。除此之外，Yi Huaxi等[2]研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和甘氨酸能提高細菌素產(chǎn)量；Devuyst[25]驗證了半胱氨酸在用量低于0.1%時對Nisin的合成起正向誘導作用；Vazquez等[5]認為僅半胱氨酸和色氨酸能夠刺激Nisin的合成，這與Devuyst[25]的結果存在差異，由此表明，誘導細菌素合成的外源氨基酸可因菌屬種類而存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸的缺失對菌體生長無顯著影響，但卻導致細菌素合成量顯著下降（P＜0.05）。Devuyst[25]與Vazquez等[5]認為氨基酸不僅作為細菌素合成的前體，還可能作為誘導劑誘導細菌素合成及分泌過程中相關酶的活性。綜上推測，賴氨酸可能作為底物直接參與L.plantarumKLDS1.0391細菌素的合成，還可能對細菌素加工釋放相關酶及蛋白具有誘導作用。

前期課題組將L.plantarumKLDS1.0391全基因組測序結果與5 種完全測序的L.plantarum（WCFS1、NC8、ZJ316、LZ206等）進行比對，發(fā)現(xiàn)其細菌素基因簇包含plnBD、plnEFI、plnGHSTUV和plnXY4 個操縱子[26]。其中，plnEF編碼細菌素結構蛋白，plNC8HK編碼組氨酸蛋白激酶，plnD編碼細胞質感應調節(jié)蛋白[11]。研究結果顯示：菌株在賴氨酸單獨缺失下培養(yǎng)24 h后，基因plnEF、plNC8HK和plnD均顯著下調（P＜0.01），而添加一定質量濃度的賴氨酸后三者顯著上調（P＜0.01），表明賴氨酸會顯著影響雙組分調控系統(tǒng)，進而控制細菌素的合成。天冬氨酸及谷氨酸代謝途徑是合成賴氨酸、甲硫氨酸以及異亮氨酸等多種分支氨基酸的有效途徑，因此研究氨基酸合成代謝途徑中的關鍵基因，可進一步深入了解氨基酸調控細菌素合成的機制。Jakobsen等[27]研究發(fā)現(xiàn)過表達編碼天冬氨酸激酶的基因dapG、lysC和yclM，野生型甲醇桿菌MGA3中賴氨酸產(chǎn)量增加。Nardal等[28]克隆并測序了甲醇桿菌天冬氨酸代謝途徑中的8 個基因以闡明它們對賴氨酸合成的調控作用，其中dapG編碼天冬氨酸激酶I蛋白，yclM編碼天冬氨酸激酶III蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，合成賴氨酸和甲硫氨酸的關鍵基因dapG和yclM在賴氨酸單獨缺失后，兩者表達均顯著上調，表明氨基酸缺失時，為保證菌體正常生長代謝，細菌需新合成蛋白質替代受損或功能失常的蛋白質進而抵御氨基酸缺失；而培養(yǎng)基中一定質量濃度的賴氨酸脅迫導致上述兩種基因表達下調，表明外源賴氨酸對二者的表達起反饋抑制作用。

目前，隨著生物信息學的快速發(fā)展，采用轉錄組、蛋白質組及代謝組等多組學技術研究乳酸菌功能性代謝產(chǎn)物的合成機理，已被廣泛應用于食品領域[29]。有報道稱，氨基酸對其他微生物的代謝產(chǎn)物具有調控作用。甲硫氨酸可誘導異青霉素N合成酶等進而刺激頭孢菌素C的合成，色氨酸既可作為麥角生物堿合成的底物，也可作為外源誘導物發(fā)揮作用[30]。本實驗發(fā)現(xiàn)，賴氨酸顯著影響L.plantarumKLDS1.0391細菌素的合成，但具體作用機制還有待利用生物信息學進一步闡明。

4 結 論

結果表明，天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺缺失后菌株的生長能力及細菌素合成量均顯著降低（P＜0.05）。賴氨酸缺失及過量對菌體生長無顯著影響，但卻顯著影響細菌素的合成。當外源賴氨酸質量濃度達到2.0 g/L前，細菌素抑菌活性隨賴氨酸添加量的增大而增大，賴氨酸可能作為細菌素合成底物正向誘導該菌細菌素合成。當賴氨酸質量濃度超過2.0 g/L后，過量賴氨酸對細菌素合成起反饋抑制作用?；騞apG和yclM在氨基酸合成通路中起協(xié)同作用，賴氨酸缺失后二者表達顯著上調進而合成蛋白質以保證菌株正常代謝。