王岳瓊 白建秀

（1 北京中學(xué) 北京 100028 2 北京朝陽(yáng)區(qū)教育研究中心 北京 100124）

問(wèn)題解決是以問(wèn)題引導(dǎo)的方式，促進(jìn)學(xué)習(xí)者的思維發(fā)展的教學(xué)模式[1]?；诮鉀Q真實(shí)問(wèn)題的教學(xué)，在解決問(wèn)題過(guò)程中獲取知識(shí)，形成概念，有利于培養(yǎng)學(xué)生的問(wèn)題意識(shí)，提高學(xué)生解決問(wèn)題的能力。在“蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用”一節(jié)的教學(xué)中，設(shè)計(jì)利用纖維素酶改造的過(guò)程設(shè)置真實(shí)問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生在解決問(wèn)題中提升科學(xué)素養(yǎng)。

1 教學(xué)內(nèi)容分析與設(shè)計(jì)思路

蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的工程技術(shù)。這部分內(nèi)容既聯(lián)系學(xué)生前期所學(xué)的蛋白質(zhì)與基因之間的關(guān)系，又涉及具體的分子、細(xì)胞水平的操作技術(shù)。學(xué)習(xí)本部分內(nèi)容有利于學(xué)生將前、后所學(xué)知識(shí)聯(lián)系成體系，理解科技與現(xiàn)實(shí)生活的緊密聯(lián)系。

在真實(shí)的科研問(wèn)題情境中，學(xué)生在學(xué)習(xí)中不斷地經(jīng)歷提出問(wèn)題、解決問(wèn)題、出現(xiàn)新問(wèn)題、再解決問(wèn)題的過(guò)程，有利于其習(xí)得新的生物學(xué)知識(shí)，養(yǎng)成科學(xué)思維習(xí)慣。

本設(shè)計(jì)以生產(chǎn)中纖維素酶改造遇到的真實(shí)問(wèn)題為例，引導(dǎo)學(xué)生利用所學(xué)知識(shí)解決問(wèn)題，同時(shí)形成蛋白質(zhì)工程的概念，并體會(huì)科技水平的進(jìn)步對(duì)現(xiàn)實(shí)生活的影響。在學(xué)習(xí)纖維素酶改造的過(guò)程中，形成“蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸”這一概念。

2 教學(xué)目標(biāo)

1）用結(jié)構(gòu)與功能觀和信息觀，概述利用基因工程原理設(shè)計(jì)和改造蛋白質(zhì)獲得性狀和功能更符合人類需求的基本思路或流程。

2）在給定情境或解決問(wèn)題的過(guò)程中，能基于事實(shí)和證據(jù)運(yùn)用歸納與概括、批判性思維等方法，比較基因工程與蛋白質(zhì)工程的區(qū)別與聯(lián)系。

3）針對(duì)人類生產(chǎn)、生活的某一需求，嘗試提出初步的工程學(xué)構(gòu)想，并進(jìn)行簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)。

4）認(rèn)同蛋白質(zhì)工程是一項(xiàng)難度很大的工程，目前已展示出誘人的前景并將給人類帶來(lái)更多的福祉；運(yùn)用蛋白質(zhì)工程原理對(duì)原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行基因改造、生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，參與科學(xué)問(wèn)題的討論。

3 教學(xué)過(guò)程

3.1 創(chuàng)設(shè)情境，引入新課 纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖有機(jī)物。利用廉價(jià)的纖維素材料生產(chǎn)生物基產(chǎn)品和生物能源，可緩解世界范圍內(nèi)日益突出的糧食和能源短缺問(wèn)題，對(duì)人類的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2]。學(xué)生已知構(gòu)成纖維素的單體是葡萄糖。教師介紹葡萄糖構(gòu)成纖維素的方式——纖維素中的葡萄糖之間通過(guò)β-1，4 糖苷鍵連接，以及纖維素在生產(chǎn)、生活中的應(yīng)用。纖維素酶可分解纖維素。Zhang 等[2]總結(jié)了纖維素酶的作用機(jī)理（圖1）。

圖1 纖維素酶的作用機(jī)理[2]

分析圖1 可知，纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶在發(fā)揮催化功能時(shí)，切斷纖維素的β-1，4 糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖、纖維糊精等產(chǎn)物。之后，β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖。

教師介紹上述內(nèi)容，為學(xué)生后續(xù)學(xué)習(xí)纖維素酶的改造作鋪墊。

3.2 發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，探明究竟 教師指出，實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在催化纖維素分解的過(guò)程中，酶的活性會(huì)下降。提問(wèn)：引起酶活性下降的原因是什么？

學(xué)生的討論主要集中在以下3 個(gè)方面。1）可能是纖維素混有的雜質(zhì)抑制了酶的活性。2）可能是酶與纖維素反應(yīng)過(guò)程中沒有充分混合均勻，導(dǎo)致糖的產(chǎn)量隨時(shí)間推移而下降，而被誤認(rèn)為是酶活性下降。3）可能是產(chǎn)物抑制了酶的活性。

教師講解：通過(guò)研究人員的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物纖維二糖會(huì)抑制葡聚糖酶的催化活性，從而限制從生物體中提取纖維素酶直接用于生產(chǎn)。提問(wèn)：如何找出纖維二糖抑制酶活性的原因？

學(xué)生討論：因?yàn)槊傅慕Y(jié)構(gòu)決定其功能，所以，可能是纖維二糖與酶的相互作用改變了酶的結(jié)構(gòu)，從而降低了酶的活性?？赏ㄟ^(guò)研究纖維素酶的結(jié)構(gòu)，探索纖維二糖和纖維素酶之間的相互作用。

教師介紹：外切葡聚糖酶是蛋白質(zhì)，是由氨基酸脫水縮合形成的肽鏈構(gòu)成的，肽鏈盤曲、折疊，形成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。圖2 是外切葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖，外切葡聚糖酶分為催化區(qū)域、纖維素結(jié)合區(qū)域及二者的連接區(qū)。

圖2 外切葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)[2]

外切葡聚糖酶在發(fā)揮作用時(shí)，利用纖維素結(jié)合區(qū)域與纖維素的多糖鏈結(jié)合。然后，催化區(qū)域切斷纖維素的β-1，4 糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖、纖維糊精等產(chǎn)物。如圖3 所示，水解出的纖維二糖會(huì)與酶催化區(qū)域的第248 位的精氨酸和第385 位酪氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生相互作用，形成封閉結(jié)構(gòu)，阻礙了纖維二糖的釋放，繼而抑制酶的催化活性，從而出現(xiàn)產(chǎn)物抑制酶活性的現(xiàn)象。

圖3 外切葡聚糖酶的催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)[3]

3.3 尋找出路，實(shí)驗(yàn)求證 教師提問(wèn)：如何解除纖維素降解產(chǎn)物纖維二糖對(duì)外切葡聚糖酶活性的抑制？

學(xué)生討論并提出解決思路：及時(shí)清除反應(yīng)的產(chǎn)物纖維二糖；或通過(guò)直接改變酶的某些基團(tuán)，或改造相應(yīng)基因等方法，調(diào)整酶與產(chǎn)物的相互作用。結(jié)合學(xué)生的討論，教師提問(wèn)：蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成的，如何改變蛋白質(zhì)中的氨基酸？如何確定針對(duì)纖維素酶基因序列中哪幾個(gè)堿基進(jìn)行操作？

研究人員利用PCR 等技術(shù)手段，對(duì)纖維素酶催化區(qū)域的編碼基因進(jìn)行改造。例如，通過(guò)查閱密碼子表，知道UAC 是酪氨酸對(duì)應(yīng)的一種密碼子，結(jié)合中心法則的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，可推測(cè)出相應(yīng)的基因中對(duì)應(yīng)堿基排序?yàn)锳TG/TAC?？蓪NA 上的堿基由ATG/TAC 變?yōu)镃GG/GCC，改變了基因序列中的2 個(gè)堿基對(duì)，從而可將第385 位的酪氨酸變?yōu)楸彼?。將改造成功的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，可生產(chǎn)出改造后的蛋白質(zhì)。新合成的纖維素酶與纖維二糖不再形成上述封閉結(jié)構(gòu)，使得纖維二糖可順利地從酶的催化結(jié)構(gòu)區(qū)域釋放，解除了產(chǎn)物的抑制作用，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)再次檢測(cè)改造后的效果（圖4，Y385A 為改造后的突變體）。

圖4 纖維二糖對(duì)酶的抑制作用比較[3]

上述解決纖維二糖的產(chǎn)物抑制問(wèn)題時(shí)采用的方法，稱為理性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方案（圖5）。這一方案是根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)功能的預(yù)期，結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，再通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，改造相應(yīng)基因，并將基因?qū)氲轿⑸锛?xì)胞中表達(dá)出新的蛋白質(zhì)。多次重復(fù)上述過(guò)程，最終可獲得期待的蛋白質(zhì)。

圖5 理性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方案[2]

利用此法是否可完美地改造蛋白質(zhì)？教師提供另一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖6）。

可用總糖釋放量衡量酶的活性。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)緩解了纖維二糖對(duì)酶的抑制作用，但因?yàn)槊附Y(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致改造后酶的活性與野生型相比有一定程度的降低。雖然此法沒有顯著提高酶的活性，但卻使學(xué)生對(duì)纖維素酶催化區(qū)域內(nèi)部氨基酸之間的相互作用關(guān)系及其與酶功能的關(guān)系有了進(jìn)一步的了解，可在這一研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)酶進(jìn)行改造。

通過(guò)改造纖維素酶的實(shí)例，學(xué)生體會(huì)到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，理解科學(xué)研究是在不斷地提出問(wèn)題、解決問(wèn)題、再提出問(wèn)題過(guò)程中進(jìn)步的。

結(jié)合這一實(shí)例，師生總結(jié)理性設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)改造方案的優(yōu)、缺點(diǎn)。理性設(shè)計(jì)改造蛋白質(zhì)，基于可從結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功能這一科學(xué)知識(shí)。利用此法可通過(guò)改造基因，精確地改造蛋白質(zhì)。但自然界中不同種類纖維素酶的編碼基因差異較大，而相應(yīng)的酶功能卻差別不大。此外，目前的研究顯示，蛋白質(zhì)不但在數(shù)量上遠(yuǎn)超基因，而且蛋白質(zhì)的可變性和多樣性，導(dǎo)致對(duì)蛋白質(zhì)的研究較核酸更復(fù)雜和困難。對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)還有很多知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)需要積累。目前，未精確了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，即進(jìn)行定點(diǎn)突變的方案設(shè)計(jì)，難度較大，成功率不高。然而，有時(shí)定點(diǎn)突變雖不能得到預(yù)期的蛋白質(zhì)，但定點(diǎn)突變后獲得蛋白質(zhì)功能或結(jié)構(gòu)的改變，有利于進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的氨基酸排序與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系、空間結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能的關(guān)系。這一技術(shù)可不斷加深對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的理解。

根據(jù)酶在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用遇到的問(wèn)題，師生共同總結(jié)解決方案的思路（圖7）。

通過(guò)教師的提問(wèn)，引導(dǎo)學(xué)生將已學(xué)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、基因與蛋白質(zhì)的關(guān)系等基本生物學(xué)理論知識(shí)應(yīng)用于實(shí)踐。

3.4 又生疑惑，繼續(xù)探求 提問(wèn)：理性設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的技術(shù)成功率不高，怎樣解決這一問(wèn)題？學(xué)生思考后，教師提供科研實(shí)例。

研究人員選用枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因，利用PCR 等方法，獲得突變基因，將獲得的突變基因轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞中，進(jìn)而構(gòu)建突變體文庫(kù)，合成改造后的蛋白質(zhì)，再應(yīng)用剛果紅染色法進(jìn)行篩選。圖8 展示利用剛果紅染色法比較9 個(gè)突變體的纖維素酶降解活力。

圖8 纖維素酶改造的定向進(jìn)化方案[4]

科研人員具體的做法是，第1 輪得到天然的內(nèi)切葡聚糖酶基因后，對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行操作，使之發(fā)生隨機(jī)突變，從3 萬(wàn)多個(gè)克隆的文庫(kù)中篩選出14 個(gè)比親本透明圈更大的突變體；第2 輪，在第1 輪篩選的基礎(chǔ)上，繼續(xù)使用易錯(cuò)PCR 的方法，從隨機(jī)突變體庫(kù)約3 萬(wàn)個(gè)克隆中選出11 個(gè)透明圈較大的突變體；第3 輪，利用前2 輪隨機(jī)突變篩選得到的25 個(gè)改良基因，進(jìn)行基因重組篩選出約1.2 萬(wàn)個(gè)克隆，從中獲得12 個(gè)水解活性比親本提高的重組子。

引導(dǎo)學(xué)生分析這種方法的基本思路。此方案是模擬自然進(jìn)化過(guò)程?，F(xiàn)代生物進(jìn)化理論的基本內(nèi)容是：自然界中生物會(huì)產(chǎn)生變異，變異方式包括突變和基因重組。通過(guò)不定向的變異，產(chǎn)生了多種不同類型的生物。在自然選擇的作用下，具有有利變異的個(gè)體有更多的機(jī)會(huì)遺傳這些變異，而具有不利變異的個(gè)體則容易被淘汰。此機(jī)制使生物朝著一定的方向不斷進(jìn)化。

模擬自然進(jìn)化過(guò)程展開的蛋白質(zhì)改造的方法，稱為蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方案[2]（圖9）。此法是在對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制了解不確切的條件下，預(yù)期蛋白質(zhì)的功能，在體內(nèi)或體外對(duì)原有蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變或體外基因重組，構(gòu)建突變基因庫(kù)。之后，將改變后的基因轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞，在微生物細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。多次重復(fù)上述過(guò)程，逐漸篩選、得到符合預(yù)期功能的蛋白質(zhì)。上述實(shí)例，科研工作者利用蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方案，最終獲得的纖維素酶水解纖維素的活性較最初的親本提高了2.68 倍。

圖9 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方案[2]

教師引導(dǎo)學(xué)生評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方案。在對(duì)要改造的蛋白分子結(jié)構(gòu)信息并不清楚的條件下，定向進(jìn)化技術(shù)在對(duì)纖維素酶進(jìn)行改造時(shí)可能會(huì)得到意想不到的“有益收獲”，但操作具有明顯的“盲目性”。假設(shè)1 個(gè)纖維素酶分子由300 個(gè)氨基酸組成，其可能的序列數(shù)目將達(dá)20300，而其中有益的突變或組合突變會(huì)非常少，這使得篩選有效突變體的工作強(qiáng)度非常大，同時(shí)極大降低了其改造的有效性。

讓學(xué)生深入探討如何克服上述缺點(diǎn)？例如，可構(gòu)建有效的突變體文庫(kù)，建立合理篩選突變體及正確評(píng)價(jià)各突變體性能的方法等。

教師介紹基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的纖維素酶結(jié)構(gòu)理性設(shè)計(jì)。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，糖苷水解酶數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的纖維素酶基因序列數(shù)目呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的快速增長(zhǎng)推動(dòng)了后基因組時(shí)代基于蛋白質(zhì)家族或基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的理性設(shè)計(jì)新策略的形成。其特點(diǎn)是結(jié)合了理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)一定的計(jì)算模擬與預(yù)測(cè)指導(dǎo)纖維素酶的改造。當(dāng)然，大量信息的共享和計(jì)算、模擬、預(yù)測(cè)方法預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)后，仍然要利用基因工程技術(shù)獲得改造后的基因與蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)指導(dǎo)的纖維素酶結(jié)構(gòu)理性設(shè)計(jì)必將成為后期分子改造的主流方向，也將會(huì)為進(jìn)一步滿足生物能源快速發(fā)展的需求提供一定的可能。

3.5 構(gòu)建概念，總結(jié)提升 引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)改造纖維素酶采用的3 種方法技術(shù)流程。這3 種方案，均首先預(yù)期了蛋白質(zhì)的功能，之后，根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)功能的預(yù)期，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)蛋白質(zhì)的氨基酸與基因中堿基的對(duì)應(yīng)關(guān)系，改造蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的基因；獲得改造的基因后將基因?qū)氲郊?xì)胞中，得到符合預(yù)期的蛋白質(zhì)。此過(guò)程稱為蛋白質(zhì)工程（圖10）。

圖10 蛋白質(zhì)工程的技術(shù)流程

引導(dǎo)學(xué)生從蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)、實(shí)現(xiàn)途徑及目的3 個(gè)方面嘗試為蛋白質(zhì)工程下定義。

蛋白質(zhì)工程的定義：蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活需求。

師生共同總結(jié)蛋白質(zhì)工程和基因工程的區(qū)別和聯(lián)系（表1）。

表1 基因工程與蛋白質(zhì)工程的區(qū)別和聯(lián)系

3.6 展望 通過(guò)蛋白質(zhì)工程，在生產(chǎn)中改善纖維素酶的性能，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，對(duì)于降低生物煉制的加工成本都是至關(guān)重要的?？萍嫉倪M(jìn)步可將設(shè)想逐步變?yōu)榭蓪?shí)施的現(xiàn)實(shí)，為生活提供更大的便利。蛋白質(zhì)工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、藥物研發(fā)領(lǐng)域也取得了很多有價(jià)值的研究成果：例如，干擾素體外保存很困難，利用蛋白質(zhì)工程改造干擾素，如果將其分子上的一個(gè)半胱氨酸變成絲氨酸，改造后的干擾素在-70℃條件下可保存半年之久。還可設(shè)計(jì)自然界中沒有的、全新的蛋白質(zhì)——這些需要依靠創(chuàng)造力和想象力。

4 反思

本教學(xué)設(shè)計(jì)通過(guò)問(wèn)題引領(lǐng)學(xué)生思考纖維素酶的改造方法，形成“蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸”這一概念。在思考纖維素酶的改造方法、解決實(shí)際問(wèn)題過(guò)程中，學(xué)生體會(huì)科學(xué)研究是在提出問(wèn)題、解決問(wèn)題、再提出問(wèn)題、解決問(wèn)題過(guò)程中不斷進(jìn)步的。在分析改造纖維素酶遇到問(wèn)題的過(guò)程中，讓學(xué)生體會(huì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能觀、認(rèn)識(shí)到知識(shí)的積累、數(shù)據(jù)的共享在解決實(shí)際問(wèn)題中的重要性，體會(huì)科學(xué)與技術(shù)的關(guān)系，同時(shí)認(rèn)識(shí)到科技的進(jìn)步不是一蹴而就的，需要多代人的共同努力。最后列舉實(shí)例，使學(xué)生體會(huì)到科技進(jìn)步對(duì)生活的影響。

在學(xué)習(xí)本部分內(nèi)容時(shí)，學(xué)生經(jīng)?；煜鞍踪|(zhì)工程和基因工程，認(rèn)為蛋白質(zhì)工程就是基因工程。本節(jié)教學(xué)中，通過(guò)分析纖維素酶的改造，學(xué)生結(jié)合自己所學(xué)的蛋白質(zhì)和基因之間的關(guān)系、進(jìn)化等知識(shí)解決問(wèn)題，并在運(yùn)用這些知識(shí)解決問(wèn)題過(guò)程中，意識(shí)到蛋白質(zhì)工程與基因工程的內(nèi)在聯(lián)系和區(qū)別。