劉 飛 張立濤 申 彤 張家豪 劉祎良 徐國豪 徐 娜

（濟寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院 山東日照 276826）

實驗教學(xué)是植物生理學(xué)教學(xué)工作中必不可少的一部分。將實驗與教學(xué)有機結(jié)合，有助于學(xué)生充分理解理論知識，提高學(xué)習(xí)效率，積極運用基礎(chǔ)知識，達(dá)到學(xué)以致用的教學(xué)效果[1-2]。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，用于科研工作的儀器也日益先進(jìn)且自動化，將學(xué)科和科技前沿引入到實驗教學(xué)中，可提高學(xué)生把握科技脈絡(luò)的能力，不斷創(chuàng)新，與時俱進(jìn)[3]。

氮素是生命體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等多種有機體的重要組成成分，參與生命體內(nèi)物質(zhì)與能量的代謝過程，被譽為“生命的元素”[4]。氮素是植物體生長發(fā)育所必須的大量元素，植物缺氮會造成植株矮小，葉片發(fā)黃，最終會影響作物的產(chǎn)量[5]。

土壤中存在NO3-、NO2-、NH4+、含氮有機物等多種形式的氮素，而多數(shù)陸生植物，例如，小麥、玉米等都是以吸收NO3-作為主要的氮源，因此，植物吸收利用NO3-的能力對植物的生長發(fā)育具有重要的作用[6]。植物體內(nèi)NO3-的積累量（NO3-含量）是衡量植物對NO3-吸收利用能力的一個關(guān)鍵的指標(biāo)，因此，需要一種快速有效地測定植物體內(nèi)NO3-含量的方法。目前，植物體內(nèi)NO3-含量的測定方法主要有2 種，分別為水楊酸濃硫酸比色法[7]和硫酸肼還原并流動分析儀法。為比較2 種NO3-含量測定方法的優(yōu)、缺點，筆者以10 mmol/L NO3-處理不同時間的擬南芥幼苗為樣品，采用2 種方法對樣品內(nèi)的NO3-含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)流動分析儀法具有省時、省力、安全系數(shù)高、測定樣品量大、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好、易于操作等優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料準(zhǔn)備 將野生型擬南芥在琥珀酸銨培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長7 d，用10 mmol/L KNO3分別處理0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h，每個處理設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，取全苗作為實驗樣品，共15個樣品。

1.2 NO3-提取 取所需測定的擬南芥全苗材料（約20 株，不超過0.1 g）于1.5 mL 離心管中，稱重，液氮冷凍研磨，加入1 mL ddH2O，100℃煮沸30 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液作為所需測定的樣品。

1.3 實驗方法

1.3.1 水楊酸-濃硫酸比色法 2017年Zhao 和Wang[7]發(fā)表的文章中詳細(xì)介紹了硝態(tài)氮含量測定方法。該方法以氮濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出回歸方程為C（μg/mL）=140.86×OD410-1.1831。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程計算出NO3--N 濃度，再用以下公式計算樣品中的NO3--N 含量。NO3--N 含量=C*V/W，式中：C 為回歸方程計算的NO3--N 濃度，V 為提取樣品液總量，W 為樣品鮮重。

1.3.2 硫酸肼還原并流動分析儀法

1）配制溶液。KNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.1%硫酸銅儲備液、1%硫酸鋅儲備液。

顯色劑：稱取2 g 磺胺溶于120 mL ddH2O 中，加入0.1 g NEDD（N-甲萘基鹽酸二氨基乙烯）混合均勻，然后加入20 mL 磷酸，定容至200 mL，儲存于棕色瓶中。

氫氧化鈉溶液：稱取10 g 氫氧化鈉溶于600 mL ddH2O 中，小心地加入3 mL 磷酸并混合均勻，定容至1 L 并加入1.36 mL 22%的Brij-35 溶液。

硫酸肼溶液：稱取0.4 g 硫酸聯(lián)胺溶于120 mL ddH2O 中，加入2 mL 硫酸銅儲備液和2 mL 硫酸鋅儲備液，定容至200 mL。

2）流動分析儀檢測樣品NO3-含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品準(zhǔn)備。分別吸取4 mL KNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液至樣品管中，用于使用流動分析儀（AA3）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定準(zhǔn)備。吸取0.8 mL 樣品液至樣品管中，然后加入3.2 mL ddH2O，混勻。

流動分析儀上機測定。將上述樣品管置于樣品架上，將吸管插入相應(yīng)的試劑中，按照流動法分析儀的操作步驟操作，檢測樣品中NO3-的含量。

2 實驗分析與討論

2.1 實驗操作分析 實驗效率是衡量實驗方法的一個關(guān)鍵指標(biāo)，在有多種選擇的條件下，應(yīng)選擇耗時少、效率高的實驗方法。本實驗對2 種NO3-提取的方法——水楊酸濃硫酸比色法和硫酸肼還原并流動分析儀法進(jìn)行了比較。從實驗操作步驟上比較，水楊酸濃硫酸比色法需要配制試劑、測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品液與試劑反應(yīng)、比色等步驟，實驗操作繁瑣，耗時長；而硫酸肼還原并流動分析儀法只需準(zhǔn)備試劑，然后上機檢測，整個過程包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的測定均實現(xiàn)了全自動化，操作步驟簡易，極大提高了實驗效率。2.2 樣品測定量分析 樣品測定量是影響實驗效率的一個重要因素。從測定樣品的數(shù)量上比較，水楊酸濃硫酸比色法需要研究者自己操作，并且為了減小操作誤差，一般每個樣品會做3 個技術(shù)重復(fù)，這就使得該法一次能檢測的樣品數(shù)量受限，因此，該法適用于樣品量少的情況。硫酸肼還原并流動分析儀法采用機器取樣、反應(yīng)、比色自動化的檢測形式，縮短了樣品檢測的時間，并且實現(xiàn)了樣品檢測的連續(xù)性，使得該法測定樣品的數(shù)量極大增加，提高了實驗效率，因此，該法適用于大批量樣品檢測的情況。

2.3 安全性分析 實驗室安全一直是研究者關(guān)注的焦點。由于實驗需求，實驗過程中可能會使用一些有毒或強酸、強堿等危險試劑，這就要求研究者在實驗操作中做好防護(hù)，注意自身安全。此外，若實驗?zāi)康南嗤嬖诙喾N實驗方法時，在實驗結(jié)果不受影響的條件下，一般選擇安全系數(shù)高的實驗方法。由于水楊酸濃硫酸比色法需要使用大量的濃硫酸，該方法存在較大的安全隱患，在有條件的情況下，盡可能選擇硫酸肼還原并流動分析儀法。

2.4 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析

2.4.1 實驗結(jié)果 將15 個樣品磨碎、煮沸后制備NO3-提取液。然后利用水楊酸法濃硫酸比色法對樣品中的NO3-含量進(jìn)行檢測，每個樣品設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)。利用分光光度計得到每個樣品的OD410值，根據(jù)1.3.1 中的公式，可計算出每個樣品中的NO3--N濃度C（μg/mL），并得出最終的NO3--N 含量（μg/g），結(jié)果如表1 所示。

表1 水楊酸法濃硫酸比色法結(jié)果

吸取每個樣品的NO3-提取液0.8 mL 至3.2 mL ddH2O 中，將提取液稀釋5 倍，按照流動分析儀操作步驟操作，每個樣品設(shè)置重復(fù)吸取3次，即為3個技術(shù)重復(fù)。由于流動分析儀可自動獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其所輸出的結(jié)果為所測溶液的NO3--N 濃度C（μg/mL），則利用1.3.1 中的公式可計算出樣品的NO3--N 含量（μg/g），所得結(jié)果如表2 所示。

表2 硫酸肼還原并流動分析儀法結(jié)果

2.4.2 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析 計算不同方法測定的每個樣品的3 個技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（圖1、表3），結(jié)果顯示硫酸肼還原并連續(xù)流動分析儀法的標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著小于水楊酸濃硫酸比色法。流動分析儀法是系統(tǒng)自動化操作，誤差率較低，而水楊酸濃硫酸比色法需要人工操作，實驗過程中存在待測液吸取誤差、試劑吸取誤差、反應(yīng)時間控制誤差等一系列不可控的人工操作誤差，使其誤差率偏大，表明連續(xù)流動分析儀法的技術(shù)重復(fù)性好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高，保障結(jié)果更加精準(zhǔn)。

圖1 2 種NO3-測定方法的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析

表3 2 種NO3-測定方法的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析（單位：μg/g）

3 結(jié)語

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的高精尖儀器用于科研工作中，極大提高了實驗效率，降低了實驗過程中的危險性，并且能保障實驗結(jié)果的精確性和穩(wěn)定性。由上述2 種植物體內(nèi)NO3-含量測定方法的比較可知，相對于傳統(tǒng)的水楊酸濃硫酸比色法，硫酸肼還原并流動分析儀法具有省時、高效、安全性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，是目前NO3-含量檢測的理想方法。