史敏　丁欣強　郭曉波　陳煒熒　張明雨

[摘要]目的：探討燒傷后皮膚成纖維細胞中miR-506-3p表達與Beclin-1的靶向關系及增殖調控作用，為燒傷后瘢痕的治療提供新靶點。方法：采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測燒傷組織和熱損傷皮膚成纖維細胞中miR-506-3p水平;Targetscan在線預測，雙熒光素酶驗證miR-506-3p與Beclin-1靶向關系;qRT-PCR和Western blot檢測miR-506-3p模擬物或抑制劑轉染對Beclin-1表達的影響;qRT-PCR檢測熱刺激后miR-506-3p模擬物（10nM或30nM）轉染成纖維細胞miR-506-3p的表達并采用CCK-8檢測轉染細胞增殖效率。結果：與正常組織相比，燒傷組織和熱損傷成纖維細胞中miR-506-3p的表達下調;miR-506-3p和Beclin-1存在靶向調控作用關系，并且miR-506-3p可負調控Beclin-1表達;miR-506-3p模擬物轉染以劑量依賴的方式抑制了熱刺激的真皮成纖維細胞中的細胞增殖。結論：miR-506-3p通過靶向抑制Beclin-1表達來調節(jié)燒傷后皮膚成纖維細胞的自噬和增殖，有可能成為燒傷愈合后瘢痕治療的潛在靶標。

[關鍵詞]miR-506-3p;Beclin-1;成纖維細胞;自噬;增殖;燒傷

[中圖分類號]R644? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）08-0095-04

miR-506-3p Targets Beclin-1 to Regulate Autophagy and Proliferation of Post-burn Skin Fibroblasts

SHI Min1，DING Xin-qiang2，GUO Xiao-bo3，CHEN Wei-ying1，ZHANG Ming-yu1

（1.Medical School of Xian Peihua University，Xian 710125，Shaanxi，China;2.Department of Dermatological，Xi'an Children's Hospital，Xian 710003，Shaanxi，China;3.Clinical Laboratory， Xi'an Central Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To explore the targeting relationship between the expression of miR-506-3p and Beclin-1 in heat-damaged skin fibroblasts and its proliferation regulation effect on Beclin-1， in order to provide a new target for the treatment of post-burn scars. Methods? We used qRT-PCR to detect miR-506-3p of post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts， used Targetscan online prediction and dual luciferase to verify the targeting relationship between miR-506-3p and Beclin-1. We used qRT-PCR and Western blot to detect the effect of miR-506-3p mimic or inhibitor transfection on Beclin-1 expression. The expression of miR-506-3p in fibroblasts transfected with miR-506-3p mimic （10nM or 30nM） after thermal stimulation was detected by qRT-PCR and the proliferation efficiency of transfected cells was detected by CCK-8. Results? Compared with normal tissues， the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and heat-damaged fibroblasts is down-regulated. There is a targeted regulation relationship between miR-506-3p and Beclin-1， and miR-506-3p can negatively regulate the expression of Beclin-1， and miR-506-3p mimic transfection inhibits cell proliferation in heat-stimulated dermal fibroblasts in a dose-dependent manner. Conclusion? MiR-506-3p regulates the autophagy and proliferation of post-burn skin fibroblasts by targeting the expression of Beclin-1， and may be a potential target? on scar for post-burn healing.

Key words： miR-506-3p; Beclin-1; fibroblasts; autophagy; proliferation; burn

燒傷皮膚愈合后轉化為纖維瘢痕組織，主要特征為成纖維細胞過度增殖及細胞外基質聚集[1]。瘢痕的形成嚴重影響患者身心健康，因而研究瘢痕發(fā)生機制中的基因治療靶點具有重要意義。大量文獻表明，自噬可降解異常細胞蛋白聚集體和受損細胞器的分解代謝途徑，在生物體穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用[2]。自噬水平異?？蓪е露喾N疾病發(fā)生，Beclin-1是至關重要的促自噬蛋白，然而很多因素可影響B(tài)eclin-1表達，其中就包括微小RNA（miRNA），如Chen等發(fā)現miR-30a通過靶向Beclin-1來調節(jié)癌細胞的自噬[3]，miR-30a通過下調Beclin-1表達來降低肝星形細胞的自噬活性[4]。本課題組前期研究也證實，熱損傷成纖維細胞具有miR-506-3p表達下調和自噬水平上調（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5表達顯著上調，而p62表達下調）特征。然而，就miR-506-3p與Beclin-1是否在成纖維細胞中存在靶向關系目前尚無報道。因此，本研究旨在探討皮膚成纖維細胞中miR-506-3p和Beclin-1的作用關系，以期為燒傷后瘢痕的治療提供新靶點。

1? 材料和方法

1.1 組織樣本與細胞培養(yǎng)：2018年4月-2019年5月從西安市兒童醫(yī)院皮膚科收集Ⅱ度或Ⅲ度燒傷患者在燒傷后24h內的樣本30份，將收集的燒傷皮膚組織和鄰近正常對照皮膚組織置于液氮中，并在-80℃儲存行進一步實驗。取材前獲得患者本人或家屬簽署的知情同意書，所有實驗操作均獲得醫(yī)院倫理委員會同意?；颊咴谛g前1年內未接受任何治療，無腫瘤病史。

人皮膚成纖維細胞系HSAS4和人胚腎293T（HEK 293T）細胞由空軍軍醫(yī)大學提供。所有細胞在37℃ 5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，DMEM含100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的抗生素混合物，并含10%胎牛血清。建立細胞熱損傷模型，將HSAS4細胞培養(yǎng)物放入熱水器槽中，在52℃下孵育30s（模擬燒傷狀態(tài)），然后在正常條件下孵育。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染：miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應的陰性對照（NC模擬物和NC抑制劑）購自RiboBio。基因過表達載體（Ad-Beclin-1）和對照載體購自GenScript Biotech公司。真皮siRNA成纖維細胞以104個細胞/孔的密度接種到六孔板中，然后用于細胞轉染。根據說明書，采用Lipofectamine 2000質?；蚬押塑账崴矔r轉染細胞。

1.2.2 RNA提取和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析：依Trizol試劑指導提取皮膚成纖維細胞和皮膚組織總RNA;采用PrimeScript RT試劑盒和Mir-XTM miRNA試劑盒（塔卡拉，中國大連）分別將mRNA和miRNA均反轉錄為cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒和SYBR PrimeScript? miRNA RT-PCT試劑盒（購自美國加利福尼亞州福斯特城）通過7900HT實時PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems Inc.，美國加利福尼亞州福斯特城）測量mRNA和miRNA的表達水平。基因特異性引物：miR-506-3p正向5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′，反向5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′;Beclin-1正向：5'-CCATGCAGGTGAGCT TCGT-3'，反向：5'-GAATCTGCGAGAGACACCATC-3';U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';β肌動蛋白正向：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。β肌動蛋白和U6分別用作mRNA和miRNA檢測的內源參照。實驗操作至少獨立重復三遍，使用相對定量2-ΔΔCT方法分析數據。

1.2.3 細胞增殖檢測：采用細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測轉染48h后的細胞增殖效率，然后用微孔板在0h、24h和72h讀取細胞增殖效率。首先，將轉染的細胞以1.0×105個細胞/孔的密度接種在六孔板中，然后將8μl CCK-8和100μl無FBS的培養(yǎng)基添加到每個孔中，暗箱孵育2h。最后，在每個指示時間點通過測量450nm處的吸光度來檢測細胞增殖。所有實驗至少重復三遍。

1.2.4 熒光素酶報告基因檢測：Beclin-1和miR-506-3p序列從美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）中檢索。在線數據庫TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）用于預測miR-506-3p和Beclin-1 3'-UTR之間的結合位點。將Beclin-1 mRNA的野生型或突變型3'-UTR克隆到pmirGLO熒光素酶報告質粒（Promega，Madison，WI，USA）中。將HEK-293T細胞接種在24孔板中，并用熒光素酶報告基因轉染。48h后，根據制造商的說明書，使用Dual-Luciferase Reporter基因分析系統(tǒng)（Promega Corporation，E1910）檢測熒光素酶活性。所有實驗至少進行三次。

1.2.5 蛋白質印跡分析：利用RIPA裂解緩沖液從燒傷的皮膚組織、正常組織和轉染的HSAS4細胞中獲得總蛋白裂解物，以10 000×g離心10min。然后，使用BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白質濃度，通過SDS-PAGE分離每種樣品中25μg蛋白質，并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，將膜分別與第一抗體在4℃下孵育過夜，將β肌動蛋白設置為內源性對照。然后，將膜與第二抗體IgG在室溫下再溫育2h。最后，將蛋白質印跡可視化并用ECL-Plus Western Blot檢測系統(tǒng)進行分析。所有實驗至少重復三遍。

1.3 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 22.0版軟件進行數據分析。每次檢測至少從三次實驗中獲得，并表示為均值±標準差。使用t檢驗對配對數據進行比較，并使用單向方差分析（ANOVA）進行兩組以上的組間比較，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 燒傷組織和熱損傷成纖維細胞中miR-506-3p的表達：采用qRT-PCR檢測30例患者燒傷組織及其毗鄰正常組織中的miR-506-3p表達水平。與正常組織相比，燒傷組織中miR-506-3p的表達下調（見圖1A）。同時，經52℃熱處理后皮膚成纖維細胞的miR-506-3p表達低于未行熱處理的對照組，且在48h時下調最明顯（見圖1B）。

2.2 miR-506-3p與Beclin-1靶向作用關系驗證：采用在線生物信息學工具預測miR-506-3p的下游靶點，結果表明miR-506-3p可與Beclin-1 mRNA的3'-UTR結合（見圖2A）。雙重熒光素酶報告基因測定表明，用miR-506-3p模擬物轉染后，WT-Beclin-1 3'-UTR的熒光素酶活性顯著降低。而與對照組相比，熒光素酶活性在包含MUT-Beclin-1 3'-UTR的熒光素酶報告載體中無明顯變化（見圖2B）。

2.3 miR-506-3p可負調控成纖維細胞Beclin-1表達：使用qRT-PCR和Western blot分析檢測miR-506-3p模擬物或抑制劑轉染對Beclin-1表達的影響。結果顯示，在熱損傷皮膚成纖維細胞中，miR-506-3p的過表達導致Beclin-1在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低，而抑制miR-506-3p則增加了皮膚成纖維細胞Beclin-1的mRNA和蛋白表達水平（見圖3A～B）。這些數據表明，miR-506-3p可直接與Beclin-1結合并負調控Beclin-1的表達。

2.4 miR-506-3p以劑量依賴性方式抑制熱刺激下的細胞增殖：將濃度為10nM、30nM的miR-506-3p模擬物于體外轉染，檢測miR-506-3p在熱刺激下成纖維細胞中的表達。結果表明，熱刺激下調了miR-506-3p的表達，但用miR-506-3p模擬物轉染后，以劑量依賴性方式逆轉了這種作用（見圖4A）。同時，用miR-506-3p模擬物轉染也顯著降低了熱刺激成纖維細胞的生存力（見圖4B）。這些結果表明，miR-506-3p的過表達能夠抑制細胞增殖。

3? 討論

瘢痕是皮膚科和整形外科最常見的創(chuàng)傷后表現，是創(chuàng)傷后患者抱怨的一大問題，尋找瘢痕形成的機制及治療靶點是臨床治療重要方向。目前miRNA及細胞自噬在纖維化疾病研究中備受關注，但在瘢痕形成中的生物學效應尚不明確。瘢痕形成是成纖維細胞異常增殖和胞外基質蛋白過度沉積所致，成纖維細胞作為瘢痕形成的主要效應細胞，研究成纖維細胞的自噬水平對瘢痕預防及治療具有重要意義。大量文獻表明，miRNA調控成纖維細胞的增殖、分化、凋亡等生物學效應，在瘢痕形成中存在異常表達[5]。例如，miR-181a通過PHLPP調節(jié)人瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡和增殖[6]。miR-181b-5p通過調節(jié)MEK/ERK/p21路徑促進增生性瘢痕成纖維細胞的增殖并抑制其凋亡[7]。本次研究也證實，在燒傷皮膚組織和熱刺激的皮膚成纖維細胞中，miR-506-3p表達顯著下調，提示miR-506-3p與瘢痕形成具有顯著關聯，可作為瘢痕和纖維化疾病診斷及治療的潛在靶點。

自噬與纖維化疾病密切相關，自噬參與瘢痕形成中成纖維細胞增殖、異常生長調控、細胞因子的分泌及基質的合成降解等，在瘢痕發(fā)生的各階段發(fā)揮不同作用[8-9]。Beclin-1作為第一個被鑒定為哺乳動物自噬基因和酵母ATG6的直向同源物，是PI3KC3的重要成分，其參與自噬體形成，是至關重要的促自噬蛋白。有證據表明，miRNA參與了細胞自噬的調節(jié)并影響著瘢痕的形成。徐心雨發(fā)現miR-216b通過靶向調節(jié)Beclin-1表達實現由HPCT誘導的人眼Tenon囊成纖維細胞的自噬和凋亡水平[10]。Cao等[11]證明Beclin-1下調會顯著抑制成纖維細胞活性和膠原蛋白合成，從而抑制肥厚性瘢痕的形成。在本研究中，通過生物信息學預測和雙重熒光素酶報告基因分析評估，驗證了Beclin-1是miR-506-3p的直接靶標，miR-506-3p可通過靶向Beclin-1調節(jié)燒傷組織成纖維細胞的行為。在進一步的研究中證實，miR-506-3p轉錄后靶向抑制Beclin-1表達。然而，miR-506-3p模擬物轉染后，不僅顯著降低熱損傷成纖維的細胞生存力，并且以劑量依賴性方式逆轉這種作用。因此，miR-506-3p靶向Beclin-1調控燒傷后皮膚成纖維細胞的自噬和增殖，這將可能被認為是傷口愈合的新治療策略，但未來尚需進一步對miRNA和自噬進行研究以幫助人們更好地認識其抗瘢痕效應。

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[收稿日期]2021-02-07

本文引用格式：史敏，丁欣強，郭曉波，等.miR-506-3p靶向Beclin-1調控燒傷后皮膚成纖維細胞的自噬和增殖機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（8）：95-98.