張志東, Eoin Ryan, 李彥敏*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.Pirbright研究所, Pirbright GU24 0 NF)

口蹄疫病毒(FMDV)屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，主要感染牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物。在成年動(dòng)物中，F(xiàn)MDV感染上皮組織[1-2]，引起口腔、蹄部和乳房上皮發(fā)生水皰性疹，而在胎兒和幼畜中，F(xiàn)MDV還可感染心肌和骨骼肌等非上皮組織[3-6]，引起心肌炎進(jìn)而導(dǎo)致幼畜死亡[7-8]。目前對(duì)FMDV隨著易感動(dòng)物的發(fā)育而改變組織嗜性的分子機(jī)制仍不清楚。整聯(lián)蛋白(integrin)是一類(lèi)由α和β亞基以共價(jià)結(jié)合而形成的膜蛋白家族, 在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的24種整聯(lián)蛋白中，F(xiàn)MDV野毒株可利用其中的αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8等4種整聯(lián)蛋白作為受體侵入細(xì)胞[9-14]。利用共聚焦顯微鏡和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)對(duì)牛組織αvβ6的表達(dá)分布與感染位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，在牛舌、蹄叉間等上皮組織FMDV僅在αvβ6陽(yáng)性的上皮細(xì)胞中復(fù)制，引起水皰性病變，表明整聯(lián)蛋白在病毒感染的組織嗜性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。研究易感動(dòng)物不同發(fā)育階段中整聯(lián)蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8的細(xì)胞組織表達(dá)變化，將有助于了解FMDV隨著易感動(dòng)物的發(fā)育而改變組織嗜性變化的分子機(jī)制。目前，對(duì)FMDV受體整聯(lián)蛋白在易感動(dòng)物不同發(fā)育階段中的組織表達(dá)變化還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究利用RT-qPCR技術(shù)，對(duì)45、75和110 d綿羊胎兒、新生羔羊和成年母綿羊組織中整聯(lián)蛋白亞單位αv、β3、β6和β8 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，首次獲得相關(guān)整聯(lián)蛋白mRNA在綿羊不同發(fā)育階段組織中分布的定量數(shù)據(jù)，探討了相關(guān)整聯(lián)蛋白在綿羊胎兒、新生羔羊和成年綿羊組織中的變化與FMD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組織樣品：心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、軟腭和扁桃體等樣品來(lái)自課題組之前已報(bào)道的綿羊試驗(yàn)[2-4],其中包括新生羔羊8只和妊娠綿羊24只(妊娠45 d母羊6只，胎兒11個(gè); 妊娠75 d母羊12只，胎兒20個(gè)和妊娠110 d母羊6只，胎兒7個(gè))，通過(guò)蹄冠皮內(nèi)接種途徑感染懷孕母羊和新生羔羊，每只動(dòng)物接種0.5 mL的FMDV O UKG 34/2001 病毒培養(yǎng)液(105.9TCID50·只-1)。分別在感染后第0、2、4、7、17、18天，各宰殺2只動(dòng)物，采集以下組織樣品：蹄冠、頸淋巴結(jié)、腸、心、腎、肝、肺、下頜淋巴結(jié)、骨骼肌、皮膚、脾、舌上皮、軟腭和扁桃體等組織樣品。采集的組織樣品置于RNAlater(英國(guó)Ambion)，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?duì)所采集的組織樣品，經(jīng)FMDV Real-time RT-PCR方法檢測(cè)[16]，分為FMDV RNA陽(yáng)性樣品(感染樣品組)和FMDV RNA陰性樣品(非感染樣品組)。在FMDV感染綿羊的組織樣品中，110 d的胎兒組織樣品均為FMDV RNA陰性，而FMDV感染的45和75 d的胎兒和新生羔羊的心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、軟腭、扁桃體中的FMDV RNA含量最高。而感染母羊的軟腭、扁桃體、蹄冠中的病毒RNA含量最高。相關(guān)詳細(xì)的綿羊試驗(yàn)和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)Ryan等的報(bào)道[3-5]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Real-time RT-PCR方法 按Ryan等[3]報(bào)道的方法提取組織RNA。綿羊整聯(lián)蛋白亞單位αv、β3、β6和β8以及3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的探針和引物由 Pirbright 研究所 King 博士提供，其引物是針對(duì)豬、牛和羊αv、β3、β6和β8整聯(lián)蛋白亞單位的保守區(qū)域并跨越預(yù)測(cè)的內(nèi)含子/外顯子連接而設(shè)計(jì)的[17]。在定量檢測(cè)時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)RNA曲線量化每個(gè)整聯(lián)蛋白mRNA拷貝數(shù)[17]。通過(guò)用含有豬整聯(lián)蛋白cDNA克隆片段的質(zhì)粒為模板(pGEM-T Easy，Promega，UK)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(Megascript，英國(guó)Ambion)獲得相應(yīng)整聯(lián)蛋白R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品，并用分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000，NanoDrop Technologies，UK)定量[17]。按Quan 等[16]建立的FMDV Real-time RT-PCR方法檢測(cè)組織中的病毒RNA載量。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 為了確定在分析綿羊不同發(fā)育階段組織中整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，是否能將感染組織樣品組的數(shù)據(jù)包含在未感染組織樣品組的數(shù)據(jù)中，進(jìn)行方差分析(ANOVA)以評(píng)估每個(gè)發(fā)育階段中感染狀態(tài)與組織整合素之間相關(guān)作用的顯著性。ANOVA檢驗(yàn)的無(wú)效假設(shè)是感染狀態(tài)和每個(gè)組織整合素亞單位mRNA水平之間的關(guān)系沒(méi)有差異，方差分析中不包括零值，而且將整合素mRNA水平以GAPDHmRNA的表達(dá)為對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析是在雷丁大學(xué)統(tǒng)計(jì)服務(wù)中心幫助下使用Mintab版本14(Minitab Ltd，英國(guó))進(jìn)行。P<0.05表明感染樣品組和未感染樣品組的P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果FMDV RNA陽(yáng)性樣品(感染樣品組)和FMDV RNA陰性樣品(非感染樣品組)之間未觀察到顯著差異，則將兩組數(shù)據(jù)一起納入定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 FMDV感染不會(huì)導(dǎo)致組織中整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)

由于組織樣品采自FMDV感染試驗(yàn)使用的綿羊[2-4]，首先分析FMDV感染是否會(huì)影響每個(gè)發(fā)育階段αv、β3、β6和β8轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為此，根據(jù)RT-PCR分析結(jié)果[3-5]，將樣品分成FMDV RNA陽(yáng)性樣品(感染樣品組)和FMDV RNA陰性樣品(非感染樣品組)兩組。在45 d胎兒的被檢組織中FMDV RNA陽(yáng)性樣品71份和FMDV RNA陰性樣品21份，在75 d胎兒的被檢組織中FMDV RNA陽(yáng)性樣品98份和FMDV RNA陰性樣品140份；在羔羊的被檢組織中FMDV RNA陽(yáng)性樣品112份和FMDV RNA陰性樣品28份；在成年母羊的被檢組織中FMDV RNA陽(yáng)性樣品30份和FMDV RNA陰性樣品10份[3-5]。110 d的胎兒組織樣品均為FMDV RNA陰性。利用Real-time RT-PCR方法分別對(duì)感染樣品組和非感染樣品組中αv、β3、β6和β8轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。在大多數(shù)情況下，感染樣品組(FMDV RNA陽(yáng)性樣品)中的整合素水平略低。對(duì)感染和非感染樣品組之間的αv、β3、β6和β8 mRNA表達(dá)水平進(jìn)而對(duì)感染和非感染樣品組之間的αv、β3、β6和β8 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，在感染樣品組和非感染樣品組之間，45 d胎兒αv、β3、β6和β8的P值分別為0.794、0.697、0.395、0.302；75 d胎兒的分別為0.994、0.367、0.011、0.942；羔羊的分別為0.971、0.912、0.126、0.985；母羊的分別為0.491、0.100、0.089、0.791。結(jié)果表明，在每個(gè)發(fā)育階段的感染和非感染樣品組之間αv、β3、β6和β8的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，除了75 d的感染和非感染樣品組的胎兒之間的β6 mRNA表達(dá)差異明顯(P<0.05)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白亞單位mRNA表達(dá)水平與感染時(shí)間之間無(wú)相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明FMDV感染不會(huì)導(dǎo)致胎兒、新生羔羊和母羊中αv、β3、β6和β8的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。因此，在分析綿羊不同發(fā)育階段組織中整聯(lián)蛋白水平時(shí)，除了75 d胎兒的感染樣品組 β6 mRNA數(shù)據(jù)不用外，在計(jì)算和比較各發(fā)育階段組織中βv、β3、β6和β8平均值時(shí)，不再對(duì)感染樣品組和非感染樣品組進(jìn)行單獨(dú)分析。

表1 感染樣品組與非感染樣品組整聯(lián)蛋白亞單位mRNA平均水平

2.2 綿羊不同發(fā)育階段組織中整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄水平

以前的研究表明 FMDV感染的45和75 d的胎兒和新生羔羊的心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、軟腭、扁桃體中的FMDV RNA含量最高，而感染母羊的軟腭、扁桃體、蹄冠中的病毒RNA含量最高，是FMDV主要的感染組織位點(diǎn)[3-5]。因此，本研究集中分析心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、軟腭、扁桃體組織在不同發(fā)育階段中的整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄水平。如圖1和表2所示，在被檢組織中整聯(lián)蛋白水平隨發(fā)育階段變化而不同，αv mRNA在45 d胎兒心肌組織、75 d胎兒、110 d胎兒以及羔羊的蹄冠上皮組織和成年母羊扁桃體組織中的表達(dá)水平最高；β3 mRNA在45 d胎兒心肌組織、75 d胎兒骨骼肌組織、110 d胎兒舌上皮組織、羔羊和成年母羊扁桃體組織中的表達(dá)水平最高；β6 mRNA在45 d胎兒軟腭組織、75 d扁桃體組織、110 d胎兒舌上皮組織、羔羊和成年母羊軟腭組織的表達(dá)水平最高；β8 mRNA在45 d胎兒心肌組織、75 d蹄冠上皮組織、110 d胎兒舌上皮組織、羔羊扁桃體組織和成年母羊蹄冠上皮組織的表達(dá)水平最高。

表2 綿羊胎兒、新生羔羊和成年母羊組織中整聯(lián)蛋白亞單位mRNA平均水平范圍

整聯(lián)蛋白亞單位mRNA水平以每毫克組織中的mRNA拷貝數(shù)計(jì)(取常用對(duì)數(shù))

2.3 FMDV在綿羊不同發(fā)育階段組織中的嗜性變化與組織中整聯(lián)蛋白亞單位mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性

目前認(rèn)為在 FMDV上皮組織嗜性中發(fā)揮重要作用的整聯(lián)蛋白是αvβ6。比較分析發(fā)現(xiàn)，成年母羊、羔羊和胎兒的蹄冠和舌上皮組織中都有較高β6 mRNA水平表達(dá)，每毫克蹄冠上皮和舌上皮組織的β6 mRNA分別在102.1～104.5拷貝和102.7～105.0拷貝之間，其間差異不顯著(圖1)；與其對(duì)應(yīng)的成年母羊、羔羊和胎兒上皮組織之間的平均最高FMDV RNA載量無(wú)顯著差異，每毫克蹄冠和舌上皮組織中病毒RNA含量分別在109.9～106.6拷貝和108.8～105.2拷貝之間。有關(guān)病毒載量檢測(cè)見(jiàn)前期發(fā)表的論文[3-5]。β6 mRNA在綿羊各發(fā)育階段的上皮組織中均有較高水平表達(dá)，與FMDV可感染綿羊不同發(fā)育階段上皮組織的特性相符合，進(jìn)一步表明，上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的αvβ6在FMDV侵染上皮組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在胎兒和新生羔羊中FMDV還能感染心、骨骼肌組織。對(duì)心組織中β6 mRNA水平的比較分析發(fā)現(xiàn)，45和75 d胎兒中幾乎檢測(cè)不到的β6 mRNA表達(dá)(分別為100.3和100.2拷貝·mg-1)(圖1)，表明FMDV感染胎兒心組織可能不是由αvβ6介導(dǎo)的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，45、75 d胎兒和羔羊心組織中的β3 mRNA較高(分別為104.7、104.6和103.5拷貝·mg-1)，而成年母羊心組織中的含量最低(為102.8拷貝·mg-1)(圖1)；與其對(duì)應(yīng)的45、75 d胎兒、羔羊和成年母羊組織中的平均最高FMDV RNA載量變化基本一致(分別為105.9、107.4、105.75和102.8拷貝·mg-1)，同時(shí)，不同發(fā)育階段心組織都有較高β8 mRNA水平表達(dá)，其間差異不顯著，表明αvβ3可能在 FMDV心肌組織嗜性中發(fā)揮作用。在肌肉組織中，75 d胎兒和羔羊的β3和β8 mRNA較高(β3 mRNA分別為104.7和103.3拷貝·mg-1; β8 mRNA分別為103.9和103.5拷貝·mg-1)，而成年母羊中的含量最低(β3 mRNA為102.6拷貝·mg-1; β8 mRNA為101.5拷貝·mg-1)，與其對(duì)應(yīng)的75 d胎兒、羔羊和成年母羊組織中的最高FMDV RNA平均載量變化基本一致(分別為108.6、105.6和104.8拷貝·mg-1)，表明αvβ3或αvβ8可能在 FMDV心肌組織嗜性中發(fā)揮作用。

3 討 論

FMDV 具有較嚴(yán)格的組織嗜性，在成年動(dòng)物主要感染上皮組織[1]，但在胎兒和幼畜中還可感染心肌和骨骼肌等非上皮組織[7-8]。病毒組織嗜性與病毒受體密切相關(guān)。整聯(lián)蛋白由α和β亞基結(jié)合形成的異源二聚體, 包括由18 種不同的α亞基和8種β亞基形成的 24 種αβ復(fù)合物，已發(fā)現(xiàn)FMDV野毒株可利用αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8等4種整聯(lián)蛋白作為受體侵入細(xì)胞[18], 對(duì) FMDV 受體整聯(lián)蛋白的研究基本是在體外細(xì)胞模型上展開(kāi)的，尚不明確各種整聯(lián)蛋白受體與 FMDV 感染的組織嗜性有何相關(guān)性。αvβ6是上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的整聯(lián)蛋白，對(duì)牛舌、蹄等上皮組織αvβ6的表達(dá)分布與FMDV感染位點(diǎn)相關(guān)性的分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV感染位點(diǎn)均為αvβ6陽(yáng)性上皮細(xì)胞，證實(shí)αvβ6 在FMDV的上皮組織嗜性發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。本試驗(yàn)顯示，整聯(lián)蛋白水平隨發(fā)育階段變化而不同，在成年綿羊和羔羊的蹄冠上皮組織和舌上皮組織中，β6 mRNA水平略低于胎兒的，但仍然有較高的表達(dá)水平，而且其間差異不大。因此，在綿羊不同發(fā)育階段上皮組織中β6 mRNA均有較高水平的表達(dá)，與FMDV可感染綿羊不同發(fā)育階段上皮組織的特性相符合，在成年母羊、羔羊和胎兒的上皮組織中都有較高水平的FMDV RNA的載量[3-5]，進(jìn)一步提示，上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的αvβ6在體內(nèi)的FMDV上皮組織嗜性中發(fā)揮重要作用。在胎兒和新生羔羊中FMDV除了感染蹄冠、舌等上皮組織，還感染心、骨骼肌組織[3-6]，引起心肌炎進(jìn)而導(dǎo)致幼畜死亡，表現(xiàn)出與在成年綿羊中的不同嗜性特征。前期研究利用PCR和ISH技術(shù)，在胎兒和新生羔羊的心組織和骨骼肌細(xì)胞中檢測(cè)到高水平的FMDV RNA含量[3]，但FMDV利用哪種整聯(lián)蛋白作為受體侵入心和骨骼肌細(xì)胞仍不清楚。本試驗(yàn)顯示，45和75 d胎兒心組織中幾乎檢測(cè)不到β6 mRNA的表達(dá)，而胎兒和羔羊心臟組織中卻有較高水平β3 mRNA表達(dá)，并顯著高于成年母羊心組織中的，與其對(duì)應(yīng)的兒和羔羊組織中的FMDV RNA載量也顯著高于成年母羊的。同時(shí)，不同發(fā)育階段心組織都有較高β8 mRNA水平表達(dá)，其間差異不顯著，這些結(jié)果提示，在FMDV心組織嗜性發(fā)揮關(guān)鍵作用的整聯(lián)蛋白，可能不是上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的αvβ6，而是αvβ3決定 FMDV 對(duì)胎兒心肌的組織嗜性。骨骼肌組織中β3和β8 mRNA的表達(dá)水平，75 d胎兒和羔羊的最高，成年母羊的最低，與其對(duì)應(yīng)的胎兒、羔羊FMDV RNA平均載量明顯高于成年母羊的，兩者變化基本一致，胎兒骨骼肌細(xì)胞對(duì)FMDV非常敏感，其次是羔羊骨骼肌細(xì)胞，而成年綿羊骨骼肌細(xì)胞對(duì)FMDV不敏感。因此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的不同發(fā)育階段肌肉組織中β3或β8位mRNA的水平變化與 FMDV肌肉組織嗜性隨發(fā)育階段變化而改變相吻合[3-5]，提示αvβ3或αvβ8可能在FMDV心肌組織嗜性中發(fā)揮作用。

本研究是通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行定量測(cè)定整聯(lián)蛋白亞單位mRNA水平的，沒(méi)有分析蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。根據(jù)Brown等[19]利用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)成年綿羊組織中的αvβ6水平的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)組織中β6 mRNA的表達(dá)與αvβ6免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性染色的結(jié)果相匹配。Monaghan等[15]通過(guò)比較β3和β6 mRNA實(shí)時(shí)qRT-PCRCt值發(fā)現(xiàn)，在β6 mRNA水平高于β3 mRNA水平的組織部位，免疫熒光顯示αvβ6染色陽(yáng)性。相反，在β3和β6 mRNA水平同樣低的部位(如腹側(cè)軟腭和背側(cè)軟腭)，免疫熒光檢測(cè)到很少或沒(méi)有整聯(lián)蛋白。因此mRNA水平與蛋白質(zhì)表達(dá)是相關(guān)的。盡管有報(bào)道稱αvβ6在人體皮膚的傷口愈合和炎癥過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[20]，但本研究表明MDV感染不影響在綿羊每個(gè)發(fā)育階段組織中αv、β3、β6和β8的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Monaghan等[15]在牛蹄間皮膚口蹄疫病變邊緣也未觀察到明顯的αvβ6或αvβ3的變化。

4 結(jié) 論

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)綿羊胎兒、新生羔羊和成年綿羊組織中整聯(lián)蛋白亞單位αv、β3、β6和β8 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了定量檢測(cè)，首次獲得這些整聯(lián)蛋白mRNA在綿羊體內(nèi)分布的定量數(shù)據(jù)，將有助于更好地了解整聯(lián)蛋白在FMDV感染組織嗜性中可能起作用的相互作用機(jī)制。