李 甜，楊 洋，謝黎卿，王遠(yuǎn)蘭，李 攀，彭遠(yuǎn)義，李能章

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 重慶市牧草與食草動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

牛溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)和牛多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)均為巴氏桿菌科成員，分屬曼氏桿菌屬(Mannheimia)和巴氏桿菌屬，二者均可作為牛上呼吸道共棲菌，在應(yīng)激狀態(tài)下(斷奶、長(zhǎng)途運(yùn)輸、惡劣天氣等)引起牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)[1]。近年來(lái)，我國(guó)肉牛規(guī)?；B(yǎng)殖逐年增多，肉牛養(yǎng)殖由低效益的分散飼養(yǎng)到高效益的集中規(guī)模化飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變，從分散到集中的過(guò)程中，肉牛的頻繁調(diào)運(yùn)、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的缺乏及飼養(yǎng)環(huán)境變化等因素導(dǎo)致BRDC發(fā)生率劇增[2]，其中最為主要的細(xì)菌性病原包括溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌[3-4]，牛溶血性曼氏桿菌和牛A型多殺性巴氏桿菌也被認(rèn)為是導(dǎo)致牛嚴(yán)重性或致死性支氣管肺炎最常見(jiàn)和重要的致病病原[5]。

目前針對(duì)牛溶血性曼氏桿菌和牛A型多殺性巴氏桿菌的疫苗均為國(guó)外產(chǎn)品，臨床應(yīng)用后其免疫保護(hù)效果也并不理想[5]。國(guó)內(nèi)缺乏針對(duì)二者的商品化疫苗，對(duì)其疫苗的研究也稍顯薄弱，牛多殺性巴氏桿菌僅有莢膜B型滅活疫苗，但其對(duì)莢膜A型多殺性巴氏桿菌無(wú)交叉保護(hù)性[6]。本研究通過(guò)比較牛溶血性曼氏桿菌滅活苗、牛溶血性曼氏桿菌-牛多殺性巴氏桿菌二聯(lián)滅活苗、牛多殺性巴氏桿菌滅活苗免疫保護(hù)效果差異，為牛溶血性曼氏桿菌和牛多殺性巴氏桿菌的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

6～8周齡雌性昆明小鼠(18～22 g)購(gòu)自恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。牛溶血性曼氏桿菌(Mh422株，血清型為A6)及牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ2株)均由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并暫存；馬丁肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；15 A VG礦物油乳化劑為重慶澳龍生物制品有限公司贈(zèng)送；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)顯色液購(gòu)自Beyotime公司。

1.2 感染模型的建立

實(shí)驗(yàn)室前期研究已建立了PmCQ2株小鼠感染模型[7]。針對(duì)Mh422株，挑取2～3個(gè)單菌落接種5 mL馬丁肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h，平板計(jì)數(shù)，取2.0×106、2.0×107和2.0×108CFU腹腔感染雌性昆明小鼠(6～8周齡，18～22 g)，每組10只，隨時(shí)觀察，小鼠瀕死前實(shí)施安樂(lè)死，記錄死亡數(shù)，同時(shí)剖檢觀察病理變化，采集肺組織做病理切片，對(duì)照為生理鹽水處理組。

1.3 滅活疫苗制備

取Mh422株與PmCQ2株種子液，按1%分別接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，對(duì)培養(yǎng)后的Mh422株與PmCQ2株菌液，分別進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)后濃縮(即離心菌液后用原菌液1/4體積的培養(yǎng)上清懸浮菌體)，濃縮后分別加入終濃度為0.15%的甲醛溶液，37 ℃靜置滅活24 h，之后將兩種菌的處理液各取100 μL涂布于馬丁固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。滅活檢驗(yàn)合格后，將菌液和PBS分別與礦物油佐劑按4∶1的比例混合均勻，分別制成滅活疫苗和PBS乳化劑，使Mh422株和PmCQ2株終濃度均為1×1010CFU·mL-1。用PBS乳化劑稀釋Mh422滅活苗和PmCQ2滅活苗，稀釋后的兩個(gè)濃度梯度分別均為2.5×109CFU·mL-1(Mh-1或Pm-1)和5.0×109CFU·mL-1(Mh-2或Pm-2)；并將1×1010CFU·mL-1的Mh422株和PmCQ2株單價(jià)滅活苗按不同體積比混合制備成二聯(lián)疫苗，使 Mh422株與PmCQ2株的濃度比例分別為1∶1、2∶1、3∶1，對(duì)應(yīng)Mh422株與PmCQ2株的終濃度分別為5.0×109CFU·mL-1∶5.0×109CFU·mL-1(Mh-Pm-1)、6.6×109CFU·mL-1∶3.3×109CFU·mL-1(Mh-Pm-2)和7.5×109CFU·mL-1∶2.5×109CFU·mL-1(Mh-Pm-3)[8-9]。每種疫苗各取100 μL涂布于馬丁固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疫苗免疫保護(hù)測(cè)定分組設(shè)計(jì)

取6～8周齡雌性昆明小鼠，隨機(jī)分為14組，每組10只。按照表1進(jìn)行免疫及攻毒分組，其中，A組(Mh-1、Mh-2-1和Mh-2-2)免疫M(jìn)h疫苗，Mh-1組和Mh-2-1組攻毒Mh422，Mh-2-2組攻毒PmCQ2；B組(Pm-1、Pm-2-1和Pm-2-2)免疫Pm疫苗，Pm-1組和Pm-2-1組攻毒PmCQ2，Pm-2-2組攻毒Mh422；AB組(AB-1組：Mh-Pm-1、Mh-Pm-2和Mh-Pm-3；AB-2組：Mh-Pm-1、Mh-Pm-2和Mh-Pm-3)免疫M(jìn)h-Pm二聯(lián)苗，AB-1組攻毒Mh422、AB-2組攻毒PmCQ2；C組為對(duì)照組，免疫PBS乳化劑，control-1組攻毒Mh422，control-2組攻毒PmCQ2。小鼠進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射疫苗，共免疫三次，首免后第7、17天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。所有小鼠初次免疫均為0.2 mL，二免和三免的劑量減半。一免后連續(xù)觀察小鼠7 d，記錄小鼠的精神狀況及免疫部位的腫脹變化，3免后第7天尾靜脈采集血液分離血清檢測(cè)抗體水平，記錄對(duì)應(yīng)到每只小鼠。

1.5 抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定

參照“1.4”小鼠免疫分組，共設(shè)定7個(gè)疫苗免疫組(Mh-1、Mh-2、Pm-1、Pm-2、Mh-Pm-1、Mh-Pm-2、Mh-Pm-3)及1個(gè)PBS乳化劑免疫對(duì)照組和1個(gè)未免疫的空白對(duì)照組，每組5只小鼠，免疫劑量及方式參照表1，初次免疫第7天開(kāi)始尾靜脈采血，分離血清，其后每間隔5 d采集分離血清，監(jiān)測(cè)到第87天，ELISA 方法檢測(cè)各自特異性抗體水平，分析其抗體消長(zhǎng)情況。

表1 小鼠免疫分組及攻毒設(shè)計(jì)

1.6 ELISA

參照“1.3”培養(yǎng)Mh422株和PmCQ2株，收集菌體，以超聲破碎制備其全菌蛋白作為包被抗原，檢測(cè)各自滅活疫苗免疫產(chǎn)生的特異性抗體水平，Mh-Pm二聯(lián)疫苗免疫的小鼠分別檢測(cè)Mh和Pm所產(chǎn)生的抗體水平。各組均以小鼠血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗。具體步驟：1)包被，每孔加入1 μg 菌體蛋白，4 ℃包被過(guò)夜，用PBST(含0.05% Tween20的PBS液)反復(fù)洗滌3次，每次5 min；2)封 閉，每孔加入200 μL 5%的脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；3)一抗孵育，第一孔加入2 μL血清和198 μL PBST，第2～12孔每孔加入100 μL PBST，其后2倍比稀釋(1∶100～1∶204 800)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；4)二抗孵育，每孔加入100 μL PBST按1∶10 000稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；(5)顯色，每孔加入100 μL TMB，37 ℃避光孵育10 min；(6)終止，每孔加入100 μL 1 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)；(7)讀數(shù)，酶標(biāo)儀測(cè)OD450 nm處吸光值；(8)比較相應(yīng)的樣本血清(S)與陰性血清(N)的OD450 nm值的比值(S/N 值)，以S/N 值 ≥ 2.1 判定為陽(yáng)性值，S/N≥2.1的血清稀釋最高倍數(shù)為樣本血清的抗體效價(jià)。

1.7 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

分別將PmCQ2株和Mh422株液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS稀釋計(jì)數(shù)后，按照PmCQ2株2.0×104CFU(腹腔攻毒途徑，LD50≈1 CFU)，Mh422株2.0×108CFU(腹腔攻毒途徑，LD50≈1.0×108CFU)的攻毒劑量，于三免后第20天，腹腔攻毒(參照表1)。攻毒后每天觀察2次，記錄小鼠臨床癥狀，瀕臨死亡前尾靜脈采血分離血清，其后實(shí)施安樂(lè)死，記錄小鼠死亡數(shù)量，連續(xù)記錄1周。疫苗保護(hù)率按以下公式計(jì)算：保護(hù)率=(對(duì)照組發(fā)病/死亡率-免疫組發(fā)病/死亡率)/對(duì)照組發(fā)病/死亡率×100%。應(yīng)用于臨床的疫苗其免疫保護(hù)率不得低于50%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 6進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理，t檢驗(yàn)分析，P>0.05為無(wú)顯著差異(ns)；P<0.05(*)為顯著差異；P<0.01(**)為顯著極差異。

2 結(jié) 果

2.1 感染模型建立

實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建PmCQ2株小鼠感染模型[7]，PmCQ2感染初期，小鼠精神萎靡，被毛凌亂，感染后期，其食欲廢絕，體重顯著下降，行動(dòng)遲緩，雙眼緊閉，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，最終死亡。感染后期剖檢發(fā)現(xiàn)肺病變明顯，心、肝、肺、脾中存在大量的菌體，肺組織病理特征[7]：支氣管、肺泡和血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，支氣管出現(xiàn)退行性變化和壞死；毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、出血；感染小鼠肺泡破裂、溶解，支氣管和肺泡上皮細(xì)胞壞死、脫落。

Mh422株以不同劑量腹腔感染昆明小鼠，僅2.0×108CFU感染劑量組快速死亡，2.0×107CFU感染組僅死亡1只(圖1A)，小鼠多數(shù)在感染第2～3天死亡，初期無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，后期精神萎靡，被毛凌亂，體重有輕微下降，死前剖檢發(fā)現(xiàn)，肺病變不明顯，但心、肝、脾、肺有大量的菌體(圖1B)。肺組織病理觀察，2.0×108CFU感染組與對(duì)照組相比，肺泡上皮細(xì)胞不同程度脫落，肺間質(zhì)內(nèi)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為核分葉狀的中性粒細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞，少量蛋白樣物質(zhì)滲出；血管顯著擴(kuò)張，見(jiàn)動(dòng)脈和靜脈血管管腔明顯增寬，動(dòng)脈血管壁變薄(圖1C、1D)。

A.Mh422感染小鼠生存曲線；B.Mh422感染小鼠肺組織觸片瑞特氏染色；C.Mh422感染小鼠肺組織HE染色；D.對(duì)照組

2.2 滅活疫苗安全性檢驗(yàn)

對(duì)Mh422株和PmCQ2株菌體甲醛滅活后和乳化后均進(jìn)行了無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，100 μL 處理菌液樣本涂布馬丁固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，無(wú)菌生長(zhǎng)，表明疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

小鼠一免后進(jìn)行安全檢驗(yàn)，連續(xù)觀察7 d，免疫小鼠精神狀況及食欲均正常，觸摸皮下注射部位，基本無(wú)腫塊、硬塊產(chǎn)生，個(gè)別產(chǎn)生腫塊的小鼠在免疫3 d后均消退。表明疫苗安全性良好。

2.3 疫苗免疫抗體水平檢測(cè)

三免后第7天采集血清，分別以Mh422株和PmCQ2株菌體蛋白為包被抗原，ELISA方法檢測(cè)未免疫小鼠和各自滅活疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的特異性抗體水平。未免疫空白小鼠均無(wú)抗-Pm和抗-Mh特異性抗體產(chǎn)生(圖2A～D)。Mh單菌苗和二聯(lián)疫苗均產(chǎn)生較高水平的抗-Mh抗體(圖2A、C)；Pm單菌苗和二聯(lián)疫苗也能產(chǎn)生較高水平的抗-Pm抗體，二聯(lián)疫苗中隨著Pm含量降低，其抗-Pm的抗體水平呈下降趨勢(shì)(圖2B、D)。比較Mh和Pm，不管單苗還是二聯(lián)疫苗，在免疫劑量相同的情況下，其產(chǎn)生的抗體量相當(dāng)，表明在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體方面，Mh和Pm無(wú)相互抑制作用，這為Mh-Pm疫苗研制提供了基礎(chǔ)。

A.Mh單菌苗免疫抗體效價(jià)；B.Pm單菌苗免疫抗體效價(jià)；C.Mh-Pm疫苗免疫抗-Mh抗體效價(jià)；D.Mh-Pm疫苗免疫抗-Pm抗體效價(jià)

2.4 疫苗免疫抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定

疫苗免疫后測(cè)定其不同時(shí)間抗體產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是Mh或Pm單菌苗，還是Mh-Pm二聯(lián)疫苗免疫，其各自抗體產(chǎn)生上升的趨勢(shì)基本相同，同一時(shí)間段其抗體水平相當(dāng)(圖3A、B)，初免后第17天(二免后第10天)，抗體產(chǎn)生達(dá)到較高水平，其后再次加強(qiáng)免疫，抗體水平整體繼續(xù)上升，在第32天達(dá)到最高值，相對(duì)穩(wěn)定維持到第57天，其后抗體水平開(kāi)始緩慢下降。

A.抗-Pm抗體效價(jià)；B.抗-Mh抗體效價(jià)

2.5 免疫保護(hù)性試驗(yàn)

對(duì)各免疫組小鼠攻毒，觀察臨床癥狀，計(jì)算攻毒保護(hù)率。結(jié)果顯示，無(wú)論用Pm單苗還是Mh-Pm二聯(lián)苗免疫的小鼠，用PmCQ2株攻毒后其保護(hù)率均能達(dá)到100%；Mh單苗對(duì)Mh422株無(wú)免疫保護(hù)作用，Mh-Pm二聯(lián)苗對(duì)Mh422株有較高的保護(hù)率，3組不同濃度配比的Mh-Pm二聯(lián)苗對(duì)Mh422株的保護(hù)率分別為57%、53%和71%；Mh與Pm間無(wú)交叉保護(hù)作用(表2)。結(jié)合其抗體水平分析(圖2)，Pm不管是單菌苗還是二聯(lián)苗免疫，即便對(duì)產(chǎn)生較低抗體量的個(gè)體攻毒PmCQ2株也具有保護(hù)作用，而在Mh單菌苗免疫中，則相反，即便產(chǎn)生的抗體量也很高，但對(duì)Mh422株的攻毒卻沒(méi)有相應(yīng)保護(hù)作用，表明Mh菌苗免疫的總抗體水平與其保護(hù)性間無(wú)相關(guān)性。以上結(jié)果表明，PmCQ2具有促進(jìn)Mh422滅活苗對(duì)Mh422株的免疫保護(hù)作用。

表2 疫苗保護(hù)率測(cè)定

3 討 論

牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)是肉牛生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的疾病，據(jù)報(bào)道每頭牛因BRDC造成的損失約為13美元，對(duì)世界肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。近年來(lái)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)肉牛疫病中BRDC占比可達(dá)65%，分離的主要細(xì)菌性病原溶血性曼氏桿菌占46.3%、睡眠嗜組織菌占5.6%，多殺性巴氏桿菌占6.5%[12]。目前，國(guó)內(nèi)預(yù)防牛多殺性巴氏桿菌病主要是B型多殺性巴氏桿菌疫苗，但對(duì)國(guó)內(nèi)主要流行型A型多殺性巴氏桿菌缺乏交叉免疫保護(hù)；而溶血性曼氏桿菌疫苗主要研究熱點(diǎn)集中在LKT疫苗，但是國(guó)內(nèi)仍缺乏商品化疫苗防控此類疾病[13]，并且針對(duì)牛呼吸道疾病的多價(jià)苗欠缺[14]。因此，研制溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌疫苗對(duì)降低BRDC的發(fā)生率尤為重要。

本研究選擇了BRDC中分離率較高的溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌，制備了單價(jià)苗和二聯(lián)疫苗，并利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的小鼠感染模型初步測(cè)試其免疫保護(hù)效果。前期發(fā)現(xiàn)，溶血性曼氏桿菌單菌苗首免后第14天加強(qiáng)免疫1次，第21天斷尾采血分離血清，第28天同型攻毒測(cè)定，無(wú)保護(hù)作用，ELISA結(jié)果表明抗體水平整體不高，分析可能與抗體水平有關(guān)。而針對(duì)A型多殺性巴氏桿菌菌苗，前期發(fā)現(xiàn)僅1次加強(qiáng)免疫，即便其抗體水平不高的個(gè)體，都能抵抗Pm的感染，同型保護(hù)率達(dá)100%。結(jié)合溶血性曼氏桿菌的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果與一般蛋白的多克隆抗體制備免疫程序及有關(guān)報(bào)道[15]，因此，本研究中兩種菌苗均選擇了2次加強(qiáng)免疫。三免后7 d對(duì)免疫小鼠尾靜脈采血分離血清，通過(guò)ELISA進(jìn)行抗體效價(jià)的測(cè)定，結(jié)果顯示，各疫苗組的免疫小鼠均能產(chǎn)生較高水平抗體。試驗(yàn)中，Mh-Pm-2組有1只小鼠在尾靜脈采血后第5天死亡，考慮到采血應(yīng)激及傷口感染等因素帶來(lái)的試驗(yàn)差異，并未采血后立即進(jìn)行攻毒測(cè)試。應(yīng)該注意的是在疫苗效價(jià)評(píng)估中，血清中高水平的IgG抗體并不意味著能夠清除或抵抗致病菌感染[16]，因此基于IgG水平升高的疫苗研究?jī)H供參考，更應(yīng)該注重免疫保護(hù)狀況、臨床癥狀和病理?yè)p傷情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)牛多殺性巴氏桿菌，即便采用2×104LD50攻毒測(cè)試，PmCQ2株制備的單價(jià)苗和二聯(lián)疫苗對(duì)PmCQ2株的免疫保護(hù)率均為完全保護(hù)(100%)，這表明可能低免疫劑量的PmCQ2都可能具有很好的免疫保護(hù)效果。測(cè)試PmCQ2單價(jià)苗對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的其他牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌的免疫保護(hù)作用，其保護(hù)率也均大于85%，這與其他牛多殺性巴氏桿菌滅活疫苗研究結(jié)果一致[17]。而本研究中選用的牛溶血性曼氏桿菌Mh422株所制備的油佐劑單價(jià)苗卻對(duì)Mh422株本身攻毒都無(wú)任何免疫保護(hù)作用，這與周金玲[18]采用不同佐劑制備的牛溶血性曼氏桿菌疫苗研究結(jié)果差異較大。周金玲等[18]以牛溶血性曼氏桿菌同一菌株分別制備了鋁佐劑、油佐劑和蜂膠佐劑滅活疫苗，測(cè)試發(fā)現(xiàn)其同型保護(hù)率分別為70%、75%和75%[18]。為進(jìn)一步探討Mh422單苗無(wú)同型保護(hù)作用的原因，考慮通常情況下，活疫苗比滅活疫苗的免疫保護(hù)效果好，在本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的試驗(yàn)中，作者分別采用4.0×107CFU和3.0×108CFU Mh422肌內(nèi)注射途徑感染小鼠，感染后24 h，小鼠有輕微癥狀，第3天后恢復(fù)，21 d后，腹腔攻毒 Mh422(2 LD50)，結(jié)果顯示也無(wú)保護(hù)性(數(shù)據(jù)未顯示)，測(cè)試的另外一株溶血性曼氏桿菌Mh1443，制備的疫苗同樣對(duì)同型無(wú)相應(yīng)保護(hù)作用。由此推測(cè)，溶血性曼氏桿菌的同型保護(hù)作用可能與菌株本身免疫保護(hù)性抗原表達(dá)量及其表面暴露情況、疫苗佐劑及制備滅活疫苗的條件等有關(guān)。有趣的是，本研究制備的Mh-Pm二聯(lián)疫苗卻對(duì)Mh422株免疫保護(hù)率達(dá)到53%～71%，測(cè)定二聯(lián)苗抗Mh422的血清抗體水平與其單價(jià)疫苗無(wú)顯著差異，那么，是否是多殺性巴氏桿菌PmCQ2對(duì)溶血性曼氏桿菌Mh422具有交叉保護(hù)作用呢？結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PmCQ2與Mh422間無(wú)交叉保護(hù)作用，由此推測(cè)Mh-Pm二聯(lián)疫苗對(duì)Mh422株的保護(hù)作用是因?yàn)镻mCQ2的促進(jìn)作用。這種細(xì)菌促進(jìn)其他疫苗免疫作用在其他的研究中也有發(fā)現(xiàn)，如口蹄疫滅活苗配合枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)對(duì)牛進(jìn)行鼻腔免疫，能增強(qiáng)牛呼吸道黏膜對(duì)口蹄疫病毒的免疫應(yīng)答[19]。將滅活的腦膜炎球菌(Neisseriameninyitidis)或百日咳菌(Bordetellapertussis)加入流感病毒(influenza virus)滅活疫苗中，滴鼻免疫小鼠，通過(guò)誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答，能顯著提高血清中的抗流感病毒的IgG和IgA水平[20]，推測(cè)PmCQ2在本試驗(yàn)中可能也發(fā)揮了類似的作用。相反的是，有研究表明溶血性巴氏桿菌疫苗(PhV)與改良皰疹病毒、副流感病毒活疫苗聯(lián)合接種顯著降低了PhV在預(yù)防BRD發(fā)病、BRD死亡率和纖維性肺炎死亡率方面的效力，也降低了對(duì)溶血性巴氏桿菌白細(xì)胞毒素的抗體反應(yīng)[21]。另有研究表明接種含有傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBRV)和I型、II型牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的多價(jià)、改良型病毒活疫苗，以及溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌類毒素與接種含有IBRV、I型BVDV、牛呼吸道合胞體病毒、3型副流感病毒和Mh類毒素相比，前者免疫配伍方式顯著降低BRD發(fā)生率和病死率，日增重顯著[22]。因此，研究多價(jià)苗時(shí)，合理的接種程序以及疫苗配伍也應(yīng)在考慮范圍之內(nèi)。鑒于溶血性曼氏桿菌的特殊性，其疫苗研究，需選用多個(gè)菌株，以不同制備方法、免疫方式及途徑進(jìn)行測(cè)試，篩出疫苗株及其最佳的制備及免疫程序。

4 結(jié) 論

無(wú)論是牛多殺性巴氏桿菌PmCQ2單苗還是Mh422-PmCQ2二聯(lián)苗對(duì)PmCQ2攻毒保護(hù)率均為100%，并且Mh422-PmCQ2二聯(lián)苗對(duì)Mh422也有較高的保護(hù)率。本研究為牛溶血性曼氏桿菌和牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌細(xì)菌疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。