賀 健，邢小勇，武小椿，溫峰琴，張陽陽，張生英，劉 佳，包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

林麝(Moschusberezovskii)又名香獐，其雄麝香腺囊分泌的麝香是中醫(yī)藥的名貴藥材，亦是一種高級(jí)香料，具有極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于過度獵捕和棲息地的破壞，野生林麝種群數(shù)量急劇減少，因而我國將其列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，《國際瀕危動(dòng)植物貿(mào)易公約》(CITES)亦將其列為極危級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1-2]。為有效保護(hù)林麝資源，我國從1958年即開始林麝的人工馴養(yǎng)，但隨著生活方式的改變和飼養(yǎng)種群的擴(kuò)大，麝群中傳染性疾病亦頻繁發(fā)生，給林麝馴養(yǎng)業(yè)造成了重大損失，也嚴(yán)重制約了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。因此，開展林麝傳染性疾病相關(guān)的研究，將為我國林麝馴養(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展提供有效保障。

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱銅綠假單胞菌，是自然界中廣泛存在的一種條件致病菌[5]。當(dāng)人或動(dòng)物機(jī)體免疫力下降或傷口暴露時(shí)，該菌極易感染并導(dǎo)致相應(yīng)的疾病[6-10]。2019年7月，甘肅省天水市某林麝養(yǎng)殖場出現(xiàn)疫情，數(shù)頭林麝突發(fā)死亡。剖檢病死林麝可見肝、肺等臟器腫大、出血，其中肺出血尤為嚴(yán)重，且有大小不等、散在分布的化膿灶。本課題組采集病死林麝肺組織，從中分離到1株綠膿桿菌，并在分離菌株致病性和藥物敏感性分析的基礎(chǔ)上，完成了分離菌全基因組測(cè)序、序列的組裝與注釋及毒力基因toxA和exoT的遺傳進(jìn)化分析，為林麝綠膿桿菌感染相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)，也為綠膿桿菌致病機(jī)制和耐藥機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為采自甘肅省天水市某林麝養(yǎng)殖場病死林麝的肺組織。

1.2 主要試劑

5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌全基因組提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T載體、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司；DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，5周齡，雌雄各20只，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 細(xì)菌的分離及鏡檢

無菌取相應(yīng)組織病料劃線接種于5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑選可疑菌落涂片染色鏡檢，并轉(zhuǎn)接種于肉湯培養(yǎng)基中增殖。

1.5 生化試驗(yàn)

應(yīng)用生化微量反應(yīng)管進(jìn)行分離菌的葡萄糖、麥芽糖等糖發(fā)酵試驗(yàn)，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)，VP試驗(yàn)，MR試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，H2S試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)，即將分離菌株分別接種于上述生化微量反應(yīng)管中，置37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，參照產(chǎn)品說明書判定結(jié)果。

1.6 16S rRNA序列測(cè)定及分析

以提取的分離菌株全基因組為模板，應(yīng)用16S rRNA基因通用引物對(duì)(16S-F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3′)，利用PCR擴(kuò)增分離菌株16S rRNA基因。PCR程序：98 ℃ 預(yù)變性5 min；98 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆送北京擎科生物有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果登陸NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離菌劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)期，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將36只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組雌雄各3只，第1組小鼠腹腔的細(xì)菌接種量為2.64×108CFU、第2組小鼠接種量為2.64×107CFU、第3組小鼠接種量為2.64×106CFU、第4組小鼠接種量為2.64×105CFU、第5組小鼠接種量為2.64×104CFU，對(duì)照組每只小鼠則分別腹腔注射0.2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。每天觀察小鼠健康狀況，并記錄小鼠發(fā)病情況及死亡數(shù)量，連續(xù)7 d，用改良Karber法計(jì)算分離菌的半數(shù)致死量(LD50)。同時(shí)，無菌剖檢死亡小鼠并分離鑒定病原菌。

1.8 藥敏試驗(yàn)

參照葛愛民等[11]所述方法，將分離菌純培養(yǎng)物涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基，5 min后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后測(cè)量各藥敏片的抑菌圈直徑并判定結(jié)果。

1.9 病原菌全基因組測(cè)序及序列分析

提取病原菌基因組后送至西安奧納斯特生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。應(yīng)用Unicycler(0.4.8)軟件過濾測(cè)序結(jié)果并將所得reads進(jìn)行組裝、連接，進(jìn)而獲得分離菌的基因組完成圖。利用Prokka、CRISPRfinder、IslandViewer 4等軟件對(duì)組裝后的基因組進(jìn)行功能元件預(yù)測(cè)分析，并將預(yù)測(cè)的基因序列與GO、COG、KEGG、CARD、VFDB等功能數(shù)據(jù)庫通過BLAST比對(duì)，從而得到相應(yīng)基因功能的注釋。

1.10 毒力基因的遺傳進(jìn)化分析

在全基因組測(cè)序并分析的基礎(chǔ)上，將TS2019的毒力基因toxA和exoT序列分別登錄NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列比對(duì)，選取AE004091.2、LN831024.1、CP065412.1等數(shù)十株相似性高的綠膿桿菌相應(yīng)基因序列，利用DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離及鏡檢

用接種針蘸取肺組織病料，劃線接種于5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，可見表面光滑、濕潤、邊緣整齊的淡黃綠色菌落生長，且呈β溶血，并伴有特殊芳香氣味。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1增菌培養(yǎng)12 h后可見培養(yǎng)基呈均勻渾濁。菌液涂片，革蘭染色、鏡檢見單個(gè)或成對(duì)排列的革蘭陰性短桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)

利用微量生化反應(yīng)管進(jìn)行分離菌的生化試驗(yàn)。結(jié)果顯示(結(jié)果未展示，備索)：分離菌葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性，而麥芽糖和乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)及吲哚試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。試驗(yàn)結(jié)果均與綠膿桿菌一致，因此，初步判定分離菌為綠膿桿菌。

2.3 16S rRNA基因序列分析

利用16S rRNA通用引物擴(kuò)增分離菌16S rRNA基因，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物約為1 500 bp。測(cè)序結(jié)果表明，分離菌株16S rRNA基因序列與綠膿桿菌PA01(登錄號(hào)：AE004091.2)的16S rRNA基因序列相似性為99.5%，且與GenBank中其他綠膿桿菌分離株16S rRNA基因均具有極高的相似性。因此，確定該分離菌株為綠膿桿菌，并將其命名為TS2019。

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

利用小鼠進(jìn)行分離菌致病性分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，在攻毒12 h后，2.64×108CFU和2.64×107CFU接種組小鼠全部死亡，2.64×106CFU接種組的小鼠死亡1只；其余接種組小鼠均出現(xiàn)不同程度癥狀，但至7 d未見死亡；對(duì)照組小鼠無任何異常表現(xiàn)。所有死亡小鼠剖檢見肺輕微腫大并明顯出血，并從肺中檢出TS2019菌(見圖1)。根據(jù)公式LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]，計(jì)算得到TS2019對(duì)小鼠的半數(shù)致死量LD50為2.82×107CFU·mL-1。

2.5 藥敏試驗(yàn)

利用K-B法進(jìn)行分離菌的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示TS2019對(duì)環(huán)丙沙星、洛美沙星等4種藥物高度敏感，對(duì)頭孢曲松、大觀霉素等5種藥物敏感性次之，而對(duì)新霉素、強(qiáng)力霉素等7種藥物存在耐藥性(表1)。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 TS2019全基因組基本信息分析

全基因組測(cè)序獲得TS2019菌株全基因組大小為6 308 327 bp，其中G+C含量占66.51%，共編碼5 929個(gè)基因，含tRNA 73個(gè)、rRNA 12個(gè)、tmRNA 1個(gè)。全基因組中共預(yù)測(cè)到5條CRISPRs結(jié)構(gòu)，6個(gè)基因島。

2.7 TS2019基因功能分析

2.7.1 GO注釋分析 TS2019全基因組經(jīng)GO數(shù)據(jù)庫注釋分析，共有3 647個(gè)基因得到注釋，占總基因的61.5%。其中生物學(xué)過程注釋條目約占總功能注釋的33.1%，主要與代謝過程(metabotic process)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(regulation of transcription)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(transmembrane transport)等有關(guān)；細(xì)胞組分注釋條目約占總功能條目的23.2%，其中主要為細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和質(zhì)膜(plasma membrane)等；而分子功能注釋約占總注釋條目的43.7%，主要被注釋到轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)和結(jié)合(binding)單元。具體結(jié)果見圖2A(每個(gè)分類選取前20個(gè)注釋最多的條目)。

2.7.2 COG功能統(tǒng)計(jì)分析 通過與COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TS2019中共有2 352個(gè)基因得到功能注釋，約占總基因數(shù)的39.7%。其中預(yù)測(cè)蛋白功能注釋主要集中在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程(291個(gè)蛋白質(zhì))、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化(211個(gè)蛋白質(zhì))、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(61個(gè)蛋白質(zhì))等分類單元。具體COG功能注釋分類見圖2B。

2.7.3 KEGG功能統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，TS2019中共有2 021個(gè)基因參與相應(yīng)的代謝通路，約占總基因數(shù)的34.1%。其中參與新陳代謝途徑的蛋白質(zhì)最多，共有1 035個(gè)，約占注釋蛋白總數(shù)的51.2%。另外，有500個(gè)蛋白質(zhì)參與環(huán)境信息處理，約占注釋蛋白總數(shù)的24.7%。具體注釋分類可見圖2C。

A.GO功能分類; B.COG功能分類; C.KEGG功能分類

2.7.4 耐藥基因注釋分析 經(jīng)CARD數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)TS2019共有5 288個(gè)ORF分別為四環(huán)素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物的耐藥相關(guān)基因。其中多數(shù)耐藥相關(guān)基因?yàn)榭咕幬锏奶赜型馀疟煤涂股匕形稽c(diǎn)修飾酶或水解酶。具體結(jié)果見表2。

表2 TS2019菌株主要耐藥基因類型

2.7.5 毒力因子注釋分析 經(jīng)VFDB數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，得到TS2019全基因組中共有875個(gè)序列可編碼與TS2019致病性相關(guān)的基因。且這些基因產(chǎn)物多具有黏附、調(diào)控或鐵攝取等功能，其中部分基因產(chǎn)物存在功能交叉。根據(jù)功能不同可將毒力因子進(jìn)行分類，具體結(jié)果見表3。

表3 TS2019菌株主要毒力因子類型

2.8 toxA和exoT基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

TS2019毒力基因toxA和exoT的序列分析結(jié)果表明，toxA基因和exoT基因序列與GenBank中大多數(shù)綠膿桿菌分離株的相應(yīng)基因序列相似性均高于99%。toxA基因進(jìn)化樹表明，TS2019與綠膿桿菌NCTC10332株(登錄號(hào)：LN831024.1)位于同一分支上，其親緣關(guān)系最近(圖3A)。而exoT基因進(jìn)化樹表明，TS2019與中國杭州人源分離株P(guān)33(登錄號(hào)：CP065412.1)親緣關(guān)系較近，并與中國蘇州人源分離株SE5416(登錄號(hào)：CP046404.1)、美國人源分離株P(guān)ABL077(登錄號(hào)：MK509304.1)位于同一大分支(圖3B)。推測(cè)TS2019分離株可能來源于人，并通過人與林麝的接觸而導(dǎo)致林麝的感染。

A.toxA基因; B.exoT基因

3 討 論

麝香是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等諸多功效，藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高[12-13]。但隨著野生麝類資源的銳減，我國將所有麝屬動(dòng)物列為一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，并全面禁止野生麝類動(dòng)物獵捕和取香。因此，麝屬動(dòng)物的人工繁育及活體取香便成為獲取天然麝香的唯一途徑。林麝是我國人工馴養(yǎng)種群數(shù)量最多的麝屬動(dòng)物，但隨著生境的變化和種群密度的增加，傳染性疾病逐漸成為影響林麝種群穩(wěn)定增長的主要因素[14-15]。因此，開展林麝傳染病及其防控相關(guān)的研究，將為林麝資源的保護(hù)和合理利用提供理論支持和技術(shù)支撐。

綠膿桿菌的致病性是由眾多胞內(nèi)及胞外毒力因子協(xié)同作用所形成，鞭毛、菌毛可通過發(fā)揮運(yùn)動(dòng)、黏附功能來參與細(xì)菌定植過程；鐵攝取系統(tǒng)可通過各種策略獲取鐵元素以滿足細(xì)菌生長需求[16]；Ⅲ型分泌系統(tǒng)可直接使效應(yīng)蛋白exoY、exoS、exoU、exoT進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而破壞宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[17]；而彈性蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同作用可使綠膿桿菌逃逸宿主的免疫識(shí)別過程[18]。本研究毒力基因注釋結(jié)果顯示，TS2019菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng)所攜帶的效應(yīng)蛋白為exoY、exoS、exoT，而 exoU缺失。其可能是因exoU基因和exoS基因在基因組中的位點(diǎn)存在一定的拮抗作用而導(dǎo)致通常只能攜帶二者之一[19]。將TS2019與20株水貂源綠膿桿菌分離株對(duì)比，發(fā)現(xiàn)所有菌株攜帶的毒力基因(如exoS、exoT、aprA、phzM、plcH等)均有一定差異[20]。由于本研究分離菌株樣本量不足，因此未能發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物源性綠膿桿菌的毒力因子攜帶類型與宿主的直接關(guān)聯(lián)性。

外毒素A為綠膿桿菌最主要的毒力因子之一，由綠膿桿菌II型分泌系統(tǒng)所分泌，可通過阻斷宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[21-22]。exoT作為一種基礎(chǔ)的T3SS效應(yīng)蛋白，幾乎在所有的綠膿桿菌臨床分離株中都表達(dá)，并作為一種通用且有效的細(xì)胞毒素可誘導(dǎo)多種形式的宿主細(xì)胞凋亡[23-24]?；诖耍狙芯繉?duì)toxA和exoT基因分別進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，toxA和exoT分別與GenBank中綠膿桿菌相應(yīng)基因序列具有高度相似性，但TS2019的exoT基因處于獨(dú)立分支，這可能與該基因堿基突變、缺失等所造成的遺傳距離變化有關(guān)。另外，發(fā)現(xiàn)TS2019的toxA基因在第426、553位氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生突變。有研究表明，外毒素A的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)改變將導(dǎo)致其毒力下降[25-26]，這與TS2019相比國內(nèi)部分綠膿桿菌分離株毒力較弱的結(jié)果相符合[7,27]。但兩者之間是否存在必然聯(lián)系，需進(jìn)一步研究。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明TS2019對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等藥物存在顯著耐藥性。而葛愛民等[11]的研究結(jié)果顯示，大多數(shù)綠膿桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素敏感。其可能是由于不同地域使用不同抗菌藥物而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥譜產(chǎn)生了變化。耐藥基因注釋結(jié)果顯示，TS2019可編碼氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物的耐藥基因，但試驗(yàn)結(jié)果顯示分離菌對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星等藥物敏感。此類差異可能與細(xì)菌生物被膜的生理異質(zhì)性有關(guān)，即氧氣和各種營養(yǎng)物質(zhì)濃度發(fā)生變化使生物被膜內(nèi)不同區(qū)域菌細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝活性出現(xiàn)差異，最終導(dǎo)致基因型和表型之間出現(xiàn)不一致[28]。

本研究中，預(yù)測(cè)基因的COG功能注釋結(jié)果表明，TS2019中有大量基因的編碼產(chǎn)物可參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，這將提供充足的能源物質(zhì)來保證細(xì)菌的增殖、生長。另外，KEGG功能注釋結(jié)果顯示，TS2019中有超過50%的預(yù)測(cè)蛋白參與新陳代謝途徑。這將極有助于細(xì)菌建立強(qiáng)大的代謝調(diào)控系統(tǒng)來適應(yīng)不同的生存環(huán)境，以便在感染過程中形成絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[29]。

4 結(jié) 論

從病死林麝肺組織中分離到1株綠膿桿菌TS2019，該菌有較強(qiáng)的致病性，且對(duì)多種抗生素耐藥；全基因組序列顯示TS2019攜帶耐藥相關(guān)基因5 288個(gè)、毒力基因875個(gè)，其中毒力基因toxA、exoT與GenBank中所有綠膿桿菌toxA、exoT基因序列具有高度相似性。本研究結(jié)果為林麝綠膿桿菌感染相關(guān)疾病的防治提供了理論支持，也為綠膿桿菌致病機(jī)制和耐藥機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。