張海霞，張振彪，代禾根，宋 昱，李 蕾，夏兆飛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)是一種2005年由Devriese等[1]命名的凝固酶陽性葡萄球菌，在此之前歸為中間型葡萄球菌(Staphylococcusintermedius)[2]。偽中間葡萄球菌是一種共生菌，最常定植于健康犬的肛周和鼻腔[3]；同時(shí)，也是一種致病菌，可引發(fā)膿皮病、外耳道炎、術(shù)后創(chuàng)口感染、尿路感染以及其他部位感染[4-8]。由于人與寵物之間的密切接觸，該菌也可在人體定植并引發(fā)疾病，目前已有多篇關(guān)于人感染偽中間葡萄球菌的報(bào)道[9-11]，因此偽中間葡萄球菌對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生也具有一定的威脅[12]。

隨著抗生素濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，繼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)之后，耐甲氧西林偽中間葡萄球菌(MRSP)感染已成為獸醫(yī)領(lǐng)域中嚴(yán)重威脅動(dòng)物健康的新興問題[3, 13]，且MRSP被認(rèn)為是葡萄球菌中耐藥基因的重要“儲(chǔ)存庫”。因此，調(diào)查偽中間葡萄球菌的流行特征至關(guān)重要。目前國內(nèi)獸醫(yī)臨床中關(guān)于偽中間葡萄球菌的報(bào)道較為少見，國外的相關(guān)研究主要聚焦于MRSP，因此，關(guān)于甲氧西林敏感偽中間葡萄球菌(MSSP)的研究在國內(nèi)外均少見。本研究針對(duì)國內(nèi)部分地區(qū)犬源偽中間葡萄球菌(包括MRSP和MSSP)臨床分離株的耐藥性和分子流行特征進(jìn)行調(diào)查，以了解國內(nèi)偽中間葡萄球菌的感染現(xiàn)狀，為指導(dǎo)臨床監(jiān)測(cè)和合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和細(xì)菌分離

2017年11月—2019年4月，共收集601份送檢至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院檢驗(yàn)科和第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)的犬源臨床樣本，接種于5%綿羊血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和甘露醇氯化鈉瓊脂平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，初步篩選出葡萄球菌。

1.2 細(xì)菌鑒定

使用Magen HiPure Bacterial DNA試劑盒提取制備細(xì)菌DNA模板，貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。使?6S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將所獲序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定細(xì)菌種屬(相似性>99%)。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)

依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，選用10類共14種抗生素。苯唑西林、青霉素、萬古霉素、克林霉素、阿米卡星、慶大霉素、利福平、多西環(huán)素、氯霉素和阿奇霉素購自中國食品藥品檢定研究院；氟苯尼考、恩諾沙星和環(huán)丙沙星購自北京索萊寶科技有限公司；利奈唑胺購自上海源葉生物科技有限公司。采用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI VET08和CLSI 2018 M100。對(duì)3類及3類以上藥物產(chǎn)生耐藥定義為多重耐藥(MDR)[14]。

1.4 全基因組測(cè)序

將“1.2”中提取的細(xì)菌DNA模板送至安諾優(yōu)達(dá)公司進(jìn)行文庫構(gòu)建及全基因組測(cè)序(Illumina HiSeq X Ten平臺(tái))。所獲取的全基因組序列使用Unicycler v0.3.0進(jìn)行拼接，并與偽中間葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得各菌株多位點(diǎn)序列分型(ST)，未知ST型由MLST數(shù)據(jù)庫管理者(vincent.perreten@vbi.unibe.ch)分配ST編號(hào)；與ResFinder 2.1和SCCmecFinder v.1.2(www.genomicepidemiology.org)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得各菌株耐藥基因和SCCmec分型，攜帶mecA基因的偽中間葡萄球菌即為MRSP[15]。使用Harvest軟件包中Parsnp工具對(duì)本研究中的所有MRSP和MSSP基因組進(jìn)行核心基因組進(jìn)化樹構(gòu)建，并使用iTOL(www.itol.embl.de)進(jìn)行標(biāo)記和可視化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用R 4.0.2軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 偽中間葡萄球菌分離鑒定

經(jīng)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基篩選葡萄球菌，可見平板中生長呈灰白色、表面濕潤、光滑和突起的中等圓形菌落(圖1)。使用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶為1 465 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序拼接后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與偽中間葡萄球菌的序列相似性達(dá)99%～100%。

圖1 葡萄球菌在甘露醇氯化鈉培養(yǎng)上的生長形態(tài)

1～7.PCR產(chǎn)物；8.陰性對(duì)照; M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.2 細(xì)菌來源和動(dòng)物特征

本研究共采集601份犬源性臨床樣本，分離鑒定獲得75株偽中間葡萄球菌，其中42株MRSP(56%，n=42)，33株MSSP(44%，n=33)。偽中間葡萄球菌的分離率為12.5%(n=75)，MRSP的分離率為7.0%(n=42)，MSSP的分離率為5.5%(n=33)。菌株來源見圖3，包括皮膚(42.67%，n=32)、耳道(10.67%，n=8)、尿液(18.67%，n=14)、骨骼(4%，n=3)、鼻腔(2.67%，n=2)、膿腫(2.67%，n=2)、咽拭子(2.67%，n=2)、創(chuàng)口(2.67%，n=2)和其他部位(4%，n=3)，7株(9.33%)來源未知。樣本來源覆蓋18個(gè)地區(qū)，包括廣東省(n=24)、遼寧省(n=9)、上海市(n=7)、天津市(n=7)、湖南省(n=5)、重慶市(n=3)、浙江省(n=3)、河南省(n=3)、江蘇省(n=3)、山東省(n=2)、四川省(n=2)、福建省(n=1)、河北省(n=1)、湖北省(n=1)、江西省(n=1)、內(nèi)蒙古自治區(qū)(n=1)、寧夏回族自治區(qū)(n=1)和安徽省(n=1)。

圖3 不同感染部位分離偽中間葡萄球菌的數(shù)量

2.3 耐藥表型

75株偽中間葡萄球菌對(duì)青霉素、阿奇霉素、克林霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐藥，耐藥率介于49.3%～89.3%；對(duì)氟苯尼考和慶大霉素較敏感；對(duì)利奈唑胺、萬古霉素、阿米卡星和利福平敏感(表1)。75株偽中間葡萄球菌的多重耐藥率高達(dá)90.7%(68/75)。MRSP針對(duì)7種抗菌藥物的耐藥率與MSSP相比差異顯著(P<0.05)(表1)。MRSP對(duì)青霉素、克林霉素和阿奇霉素的耐藥率高達(dá)100%(42/42)；對(duì)苯唑西林、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和多西環(huán)素的耐藥率均達(dá)到80%以上。42株MRSP均具有多重耐藥性，至少對(duì)5種以上受試藥物耐藥，多重耐藥率高達(dá)100%(42/42)(圖4)。33株MSSP中，2株對(duì)所有受試藥物均敏感，26株至少對(duì)3種以上受試藥物耐藥，多重耐藥率為78.8%(26/33)。MRSP與MSSP的多重耐藥率之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 偽中間葡萄球菌中多藥耐藥菌株分布

表1 75株偽中間葡萄球菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率

2.4 耐藥基因

WGS分析結(jié)果顯示，75株偽中間葡萄球菌共攜帶19種耐藥基因(表2)。其中，blaZ和aac(6′)-aph(2″)檢出率最高，均為92.0%(69/75)；其次為erm(B)、tet(M)、dfrG、aph(3′)-Ⅲ、ant(6)-Ia和mecA。ant(9)-Ia、erm(A)、fosB和lnu(G)各檢出1株，未檢出erm(C)。在42株MRSP中，blaZ和erm(B)檢出率高達(dá)100%，與耐藥表型完全相符；aac(6′)-aph(2″)的檢出率為100%，但慶大霉素耐藥率僅為7.1%。7株含有對(duì)截短側(cè)耳素類-林可胺類-鏈陽菌素A類耐藥的多藥耐藥基因lsa(E)。MRSP中8種耐藥基因的檢出率與MSSP之間存在顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 75株偽中間葡萄球菌耐藥基因檢出率

2.5 分子分型

75株偽中間葡萄球菌中，共發(fā)現(xiàn)70種ST型，54種為新ST型，無優(yōu)勢(shì)ST型。MRSP中存在38種ST型，MSSP中存在33種ST型。對(duì)75株偽中間葡萄球菌進(jìn)行SNP分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)，結(jié)果可見所有菌株彼此的親緣關(guān)系并不緊密。

圖5 76株偽中間葡萄球菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(含標(biāo)準(zhǔn)菌株ED99)

42株MRSP中，葡萄球菌染色體基因盒(SCCmec)V 型23株，占54.7%；SCCmecⅢ型2株，占4.8%；SCCmecIV型2株，占4.8%；15株未分型，占35.7%。

3 討 論

本研究中，偽中間葡萄球菌和MRSP的分離率分別為12.5%和7.0%，均低于國內(nèi)相關(guān)的報(bào)道[6, 16]。2007年，Sasaki等[17]報(bào)道日本犬MRSP的分離率為29.8%。2020年，韓國和德國報(bào)道偽中間葡萄球菌的分離率分別為68%[18]和39.6%[19]。本研究中，56%偽中間葡萄球菌為MRSP，高于Feng等(42.7%)[16]和Wang等(44.0%)[6]之前的報(bào)道，但低于日本的相關(guān)報(bào)道(66.5%)[20]。在美國和歐洲，MRSP在偽中間葡萄球菌中的占比相對(duì)較低，介于2.5%～33.0%[21-24]。本研究顯示偽中間葡萄球菌分離株主要來源于皮膚、尿液和耳道，與國外的研究具有一致性[21-22]。因采樣部位、物種、試驗(yàn)設(shè)計(jì)、地域分布和動(dòng)物健康狀態(tài)的影響，不同研究之間的結(jié)果會(huì)有所不同，但是國內(nèi)MRSP的高流行率必須予以重視。

Lee和Yang[18]報(bào)道MRSP的多重耐藥率是MSSP的2倍～3倍，而在本研究中MRSP的多重耐藥率是100%，MSSP的多重耐藥率是78.8%，這表明MSSP中存在的多重耐藥現(xiàn)象，這一結(jié)果與關(guān)珊[25]關(guān)于北京地區(qū)寵物犬外傷感染中分離到的偽中間葡萄球菌的耐藥性一致，提示臨床獸醫(yī)在使用抗生素之前應(yīng)盡量先采樣進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)，以更為合理地使用抗生素。所有菌株均對(duì)青霉素呈現(xiàn)高度耐藥，因此不建議將青霉素作為偽中間葡萄球菌感染的常規(guī)用藥。2020年，Haenni等[26]關(guān)于歐洲MSSP的研究發(fā)現(xiàn)，MSSP通常對(duì)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類耐藥，這與本研究結(jié)果一致。值得注意的是，Wang等[6]的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)所有MRSP均對(duì)氟苯尼考敏感，周傳鐸等[27]的研究也與該研究結(jié)果一致，但本研究中發(fā)現(xiàn)MRSP和MSSP中均存在氟苯尼考耐藥現(xiàn)象。

本研究中，42株偽中間葡萄球菌攜帶mecA，同時(shí)所有MRSP均攜帶耐藥基因blaZ、aac(6′)-aph(2″)和erm(B)。耐藥基因blaZ和erm(B)的檢出率高于國內(nèi)相關(guān)研究[6, 16]。42株MRSP中，5株未表現(xiàn)出苯唑西林耐藥，耐藥表型和耐藥基因不一致的情況還需要進(jìn)一步研究[28]。在7種耐藥基因[ant(6)-Ia、aph(3′)-Ⅲ、lnu(B)、tet(K)、lsa(E)、cat(pC221)和fexA]的檢出率方面，MRSP和MSSP之間未存在顯著差異，提示MSSP中也存在嚴(yán)重的基因轉(zhuǎn)移。

國外的一項(xiàng)回顧性綜述中[29]指出，MRSP的優(yōu)勢(shì)ST型是ST71，隨后依次是ST45、ST258、ST261、ST112、ST265、ST68、ST169和ST181。2012年，Wang等[6]報(bào)道ST71是中國北部地區(qū)的優(yōu)勢(shì)ST型；Feng等[16]報(bào)道ST4、ST5和ST95是華南地區(qū)的優(yōu)勢(shì)ST型。在本研究中，MRSP和MSSP中均未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)ST型，說明國內(nèi)部分地區(qū)犬源偽中間葡萄球菌具有較大的遺傳多樣性和個(gè)體差異性。國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道顯示在我國華南地區(qū)[16]、韓國[18]和美國[30]，MRSP主要為SCCmecV型，與本研究的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

從國內(nèi)18個(gè)地區(qū)分離到的75株犬源偽中間葡萄球菌中存在嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象，尤其是MSSP的耐藥現(xiàn)狀不容忽視；耐藥基因分布廣泛，且檢出率高；ST型復(fù)雜多樣，發(fā)現(xiàn)大量的新ST型，且無優(yōu)勢(shì)ST型，提示MRSP和MSSP中均存在較大的遺傳多樣性。因此，加強(qiáng)寵物臨床細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，規(guī)范診療程序，推動(dòng)抗生素的合理使用至關(guān)重要。