孫 康，劉繪匯，范慧玉，劉 婷，鄭 琛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

在以往畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中，抗生素對(duì)防治細(xì)菌性疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長等方面起到了重要的作用。但抗生素的濫用也產(chǎn)生了消極影響，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)藥物殘留，并且對(duì)致病細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成畜牧養(yǎng)殖中疫病防控危機(jī)。此外，還增加了消費(fèi)者對(duì)食品安全的顧慮。因此，尋找抗生素替代品是目前急需解決的重要問題。目前，有關(guān)微生物制劑的研究較為熱門，適量的飼喂微生物制劑不僅能夠調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物胃腸道微生物結(jié)構(gòu)，還能促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育。

枯草芽孢桿菌是一種消化道中暫住且穩(wěn)定性很高的益生菌，對(duì)動(dòng)物無致病性，能形成耐酸、耐熱和耐寒的孢子[1]?？莶菅挎邨U菌具有提高動(dòng)物生長性能和改善肉品質(zhì)的作用[2],肉品質(zhì)主要取決于肌內(nèi)脂肪酸的組成和比例[3-6]。枯草芽孢桿菌還具有抑制腸道有害細(xì)菌,調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡的作用[7]，通過調(diào)節(jié)胃腸道菌群而起到降低動(dòng)物腹瀉的作用。此外，枯草芽孢桿菌還有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，枯草芽孢桿菌能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),促進(jìn)機(jī)體免疫器官的發(fā)育[7]。但目前有關(guān)枯草芽孢桿菌對(duì)羔羊生長發(fā)育、腹瀉率、組織器官指數(shù)及肌肉脂肪酸影響的研究較少。

因此，本試驗(yàn)通過在代乳粉中添加枯草芽孢桿菌，研究其對(duì)7～28日齡湖羊羔羊生長性能、腹瀉率、組織器官及肌肉脂肪酸的影響，旨在為枯草芽孢桿菌在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物

采用對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇體況發(fā)育良好的7日齡湖羊公羔(雙羔)30只。將所選的羔羊按同質(zhì)性原則隨機(jī)分為2個(gè)處理組，且保證組間初生重接近，每組15只，每只為1個(gè)重復(fù)。對(duì)照組羔羊飼喂基礎(chǔ)代乳粉(由北京精準(zhǔn)動(dòng)物營養(yǎng)研究中心提供)，代乳粉主要營養(yǎng)成分值見表1，試驗(yàn)組羔羊飼喂添加含0.2%枯草芽孢桿菌(GutCare?，贏創(chuàng)德固賽(中國)投資有限公司，有效活菌含量≥2.0×1010CFU·g-1)的代乳粉。試驗(yàn)期共21 d，待羔羊飼養(yǎng)至28日齡時(shí)，每組隨機(jī)挑選8只羔羊進(jìn)行屠宰。

表1 羔羊代乳粉主要營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

羔羊出生后，先跟母羊吃足3 d初乳，第4天將母羊與羔羊隔離，羔羊單籠飼養(yǎng)。4～6日齡對(duì)羔羊用奶瓶進(jìn)行訓(xùn)飼，訓(xùn)飼使用代乳粉，按代乳粉與溫水1∶5的比例進(jìn)行沖制。待羔羊7日齡時(shí)，早晨空腹稱重，并將全同胞的2只公羔隨機(jī)分入2個(gè)處理組，每組15只，且保證7日齡的羔羊體重組間無顯著差異(對(duì)照組為(4.09±0.66)kg；枯草芽孢桿菌組為(3.82±0.59)kg)。從8日齡開始，對(duì)照組和枯草芽孢桿菌組羔羊按照體重的2%飼喂代乳粉，每日按6:00、12:00、18:00和24:00四個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)期間羔羊自由飲水。試驗(yàn)于2018年8月至9月在甘肅省民勤縣德福農(nóng)業(yè)科技有限公司進(jìn)行。

1.3 生長性能測(cè)定

在羔羊7、14、21和28日齡早晨空腹測(cè)體重，并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算不同階段的平均日增重(average daily gain, ADG)：平均日增重(g·d-1)=(末重-始重)/測(cè)定天數(shù)。

1.4 腹瀉率測(cè)定

在每天飼喂羔羊的同時(shí)仔細(xì)觀察羔羊腹瀉情況，每天觀察3次, 若有2次出現(xiàn)腹瀉(羔羊排出的糞便呈稀軟或水樣狀時(shí), 或尾部被糞便污染時(shí))，則認(rèn)為此羔羊在當(dāng)天腹瀉。

腹瀉率=試驗(yàn)期腹瀉羔羊數(shù)×腹瀉天數(shù)/(試驗(yàn)羔羊只數(shù)/試驗(yàn)天數(shù))×100%。

1.5 組織器官樣品測(cè)定

待羔羊飼養(yǎng)至28日齡，每組隨機(jī)挑選8只進(jìn)行屠宰，屠宰前不禁食禁水，采用頸動(dòng)脈放血方式屠宰。屠宰前記錄宰前活重，屠宰后依次測(cè)定頭重、蹄重、胴體重和內(nèi)臟各個(gè)器官重量并記錄數(shù)據(jù)，同時(shí)測(cè)量皮長、皮寬和皮面積并記錄數(shù)據(jù)。

1.6 肌肉樣品采集及脂肪酸測(cè)定

1.6.1 肌肉樣品采集 羔羊屠宰后，采集背最長肌和肱二頭肌，每只羔羊采集3份樣品，用自封袋包裝編碼標(biāo)記，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 樣品前處理 參照O’Fallon等[8]脂肪酸甲酯化的方法對(duì)肉樣進(jìn)行前處理。將冷凍的肉樣置于室溫進(jìn)行解凍，待肉樣解凍以后用剪刀將肉樣剪成1 mm的矩形肉條，再將肉條剪碎，稱取1 g置于15 mL離心管中。在離心管中加入0.7 mL 10 mol·L-1KOH和5.3 mL無水甲醇，之后將離心管置于55 ℃恒溫水浴中1.5 h，在此期間，每隔20 min振蕩離心管5 s。待水浴結(jié)束后，將離心管置于自來水冷卻至室溫。在冷卻之后的離心管中加入0.58 mL的12 mol·L-1H2SO4，將離心管顛倒混合，重復(fù)上述水浴過程，待離心管再次冷卻至室溫。在離心管中加入1 mL正己烷后充分振蕩搖勻，然后4 000 r·min-1離心5 min，用2.2 μm一次性過濾器和1 mL一次性無菌注射器，將上清液過濾到氣相小瓶，保存于-20 ℃待測(cè)。

1.6.3 氣相色譜分析 使用安捷倫6890 N氣相色譜儀，根據(jù)峰面積分析試驗(yàn)羊肌肉中脂肪酸組成及含量。氣相色譜分析條件：色譜柱為SP-2560(Sigma-Aldrich 公司)；程序升溫，初溫140 ℃，保持5 min，以2 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min，再以6 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持20 min。檢測(cè)器溫度為250 ℃，進(jìn)樣器溫度為220 ℃。色譜柱流量為1.2 mL·min-1，分流比為100∶1。載氣為高純氮。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所測(cè)數(shù)據(jù)用Excel整理，并使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，且P<0.05時(shí)表示組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊生長發(fā)育的影響

由表2可以看出，枯草芽孢桿菌顯著降低了7～14日 齡湖羊羔羊末重(P<0.05)，顯著提高了15～21和22～28日齡湖羊羔羊的平均日增重(P<0.05)，對(duì)其他生長性能指標(biāo)和腹瀉率無顯著影響(P>0.05)。從表3可以看出，枯草芽孢桿菌顯著降低了7～28日齡湖羊羔羊胰腺重量(P<0.05)，顯著增加了蹄占宰前活重比例(P<0.05)，對(duì)其他組織器官?zèng)]有顯著影響(P>0.05)。從表4可以看出，枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊皮張無顯著影響(P>0.05)。

表2 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊生長性能的影響

表3 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡羔羊組織器官發(fā)育的影響

表4 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊皮張的影響

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊肌肉脂肪酸組成的影響

2.2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊背最長肌脂肪酸的影響 從表5可以看出，枯草芽孢桿菌顯著降低湖羊羔羊背最長肌不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚烯酸、油酸含量和MUFA∶多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)(P<0.05)，顯著提高十五烷酸、肉豆蔻烯酸、神經(jīng)酸含量和飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)∶UFA(P<0.05)，對(duì)湖羊羔羊背最長肌其他脂肪酸無顯著影響(P>0.05)。

表5 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊背最長肌脂肪酸組成的影響

2.2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊肱二頭肌脂肪酸的影響 從表6可以看出，枯草芽孢桿菌顯著降低湖羊羔羊肱二頭肌UFA、SFA、MUFA、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚烯酸、油酸含量和MUFA∶PUFA(P<0.05)，顯著提高PUFA、n-6PUFA、肉豆蔻烯酸、神經(jīng)酸含量和SFA∶UFA、PUFA∶SFA(P<0.05)。對(duì)湖羊羔羊肱二頭肌其他脂肪酸無顯著影響(P>0.05)。

表6 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊肱二頭肌脂肪酸組成的影響

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊生長發(fā)育的影響

枯草芽孢桿菌是一種好氧有益菌，可以通過消耗胃腸道中的氧氣，來促進(jìn)厭氧有益微生物的生長，抑制好氧有害微生物的生長[9]。枯草芽孢桿菌還可以促進(jìn)動(dòng)物胃腸道發(fā)育，分泌多種消化酶；并且在自身生長過程中，產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、促生長因子和氨基酸等，這些營養(yǎng)物質(zhì)被動(dòng)物利用，有利于動(dòng)物生長性能的提高[10]。此外，枯草芽孢桿菌還能夠抑制胃腸道病原微生物，增強(qiáng)動(dòng)物抗病能力[11-12]。

在本試驗(yàn)中，雖然代乳粉中添加枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊的平均日增重、胴體重和腹瀉率無顯著影響，但具有提高羔羊平均日增重和胴體重的趨勢(shì)。7～28日齡湖羊羔羊的平均日增重有所增加，這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌對(duì)胃腸道有害菌的抑制和對(duì)有益菌促進(jìn)的緣故，再者，枯草芽孢桿菌分泌的消化酶促進(jìn)了日糧養(yǎng)分的消化，同時(shí)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)給湖羊羔羊的生長發(fā)育提供了養(yǎng)分。程連平等[13]也得出了相似的結(jié)果，斷奶湖羊日糧中添加枯草芽孢桿菌飼喂28 d后，可顯著提高羔羊的平均日增重。張海濤等[14]在斷奶前公犢牛的奶中添加納豆枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，斷奶前犢牛的日增重比對(duì)照組提高了26.5%。馮曼等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.5%的枯草芽孢桿菌可以顯著降低生長育肥豬的料重比，能夠更有效地讓生長育肥豬增重。丁浩等[16]也得出了同樣的結(jié)果，在飼糧中添加枯草芽孢桿菌提高了保育豬的生長性能。但根據(jù)前人的研究結(jié)果可知，羔羊的平均日增重大約在200 g·d-1[17]，而在本試驗(yàn)中，羔羊的平均日增重遠(yuǎn)低于這個(gè)參考值，造成這種結(jié)果的原因可能與羔羊早期斷母乳有關(guān)，母乳中含有豐富的免疫因子，能夠?yàn)楦嵫蛱峁┟庖咂琳喜⒃鰪?qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力。羔羊過早地?cái)嗄溉椋垢嵫虿荒軘z入足量的免疫因子，從而導(dǎo)致其機(jī)體生長發(fā)育緩慢。此外，也可能與過早飼喂代乳粉有關(guān)，羔羊早期瘤胃發(fā)育和瘤胃微生物區(qū)系不健全，過早飼喂代乳粉可能會(huì)損傷羔羊胃腸道黏膜，導(dǎo)致羔羊胃腸道發(fā)育受到影響[18]，從而影響對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，造成羔羊生長發(fā)育緩慢。本試驗(yàn)中，7～28日齡湖羊羔羊的胴體重有所增加，這與孔繁云等[19]的研究結(jié)果大致相同，其研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加羅伊乳桿菌可以顯著提高小尾寒羊×湖羊F2代羔羊的胴體重。程光民等[20]也發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌可以提高杜泊綿羊的胴體重。在本試驗(yàn)中，7～28日齡湖羊羔羊的腹瀉率有所降低，這可能與枯草芽孢桿菌的作用方式和機(jī)制有關(guān)。梁晉瓊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌活菌制劑對(duì)牛羊細(xì)菌性腹瀉具有很好的預(yù)防和治療效果。盧奇成等[22]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加布拉氏酵母菌可以有效降低哺乳犢牛的腹瀉率。馮曼等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.5%的枯草芽孢桿菌可以減少腹瀉率。布登付和鄭中華[23]也發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵濕料可以有效降低肥育豬的腹瀉率。唐武等[24]研究表明，在日糧中添加益生菌可以顯著降低10～65日齡環(huán)江香豬仔豬的腹瀉率。梁淑芳等[25]也發(fā)現(xiàn)，不同微生態(tài)制劑對(duì)仔豬腹瀉具有很好的改善作用。

在本試驗(yàn)中，代乳粉中添加枯草芽孢桿菌對(duì)湖羊羔羊器官發(fā)育和皮張指標(biāo)沒有顯著影響，這可能與枯草芽孢桿菌主要作用于動(dòng)物胃腸道，改善胃腸道菌群平衡，提高動(dòng)物消化能力和提供動(dòng)物生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)等生物學(xué)功能有關(guān)，而其對(duì)于器官發(fā)育和皮張指標(biāo)的作用效果及機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡湖羊羔羊肌肉脂肪酸組成的影響

脂肪酸組成是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，當(dāng)不飽和脂肪酸的含量高及PUFA∶SFA值高于0.4時(shí)，被認(rèn)為肉品質(zhì)質(zhì)量較高[26]。動(dòng)物肌內(nèi)脂肪的沉積是一個(gè)復(fù)雜的過程，受其品種、性別、年齡、日糧營養(yǎng)水平、沉積部位等眾多因素的影響[27-29]。此外，在分子水平上，肌內(nèi)脂肪沉積受脂肪細(xì)胞生長、調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因和酶表達(dá)的影響[30]。

在本試驗(yàn)中，湖羊羔羊背最長肌和肱二頭肌的肌內(nèi)脂肪都出現(xiàn)了明顯的降低。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶具有調(diào)控脂代謝的作用，活化的蛋白激酶能抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)，導(dǎo)致丙二酸單酰輔酶A含量減少，減弱了對(duì)肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)的抑制作用，促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化分解，從而使肌內(nèi)脂肪沉積減少[31]。枯草芽孢桿菌在自身生長過程中能夠產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸和維生素等，而合成的氨基酸經(jīng)過發(fā)酵過程就能產(chǎn)生蛋白激酶，最終實(shí)現(xiàn)降低肌內(nèi)脂肪沉積的作用[32]。枯草芽孢桿菌的這一作用效果與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。

在本研究中，枯草芽孢桿菌顯著降低了湖羊羔羊背最長肌UFA、MUFA、MUFA∶PUFA、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚烯酸和油酸含量，而顯著提高SFA∶UFA、十五烷酸、肉豆蔻烯酸和神經(jīng)酸含量；顯著降低湖羊羔羊肱二頭肌UFA、SFA、MUFA、MUFA∶PUFA、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚烯酸和油酸含量，而顯著提高PUFA、n-6PUFA、SFA∶UFA、PUFA∶SFA、肉豆蔻烯酸和神經(jīng)酸含量。PUFA是一類對(duì)人體有益的脂肪酸，能夠增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫能力[33]，而枯草芽孢桿菌也具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的能力[7]，因此可以推測(cè)，枯草芽孢桿菌和PUFA兩者之間有可能存在某種關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)目前尚不明確，還需今后做進(jìn)一步研究。從本研究結(jié)果來看，枯草芽孢桿菌促進(jìn)了PUFA含量的增加。劉旺景等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加復(fù)合益生菌可以顯著提高杜寒雜交肉羊背最長肌中PUFA的含量。此外，Pascual等[34]指出，PUFA對(duì)SFA和MUFA的從頭合成具有抑制作用，與劉旺景等[26]的結(jié)果相似，也與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。但馮健等[35]的研究結(jié)果與此有所不同，在延邊黃牛的日糧中添加復(fù)合益生菌對(duì)背最長肌中的SFA無明顯影響，這可能與動(dòng)物的種類及添加劑的類型有關(guān)。有報(bào)道稱，降低小尾寒羊背最長肌中SFA的含量，可以改善羊肉肉品質(zhì)[36]。在本研究中，代乳粉中加入枯草芽孢桿菌后，降低了湖羊羔羊背最長肌和肱二頭肌中的SFA含量，證明枯草芽孢桿菌可以改善7～28日齡湖羊羔羊肉品質(zhì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，湖羊羔羊肌內(nèi)脂肪的沉積受枯草芽孢桿菌的影響。湖羊羔羊肌內(nèi)脂肪沉積發(fā)生整體變化時(shí)，內(nèi)部各種脂肪酸發(fā)生不同程度的變化，并不都與整體變化保持同步性，但大部分脂肪酸的變化與整體變化一致，具體變化規(guī)律還有待今后進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

代乳粉添加枯草芽孢桿菌對(duì)7～28日齡羔羊平均日增重、腹瀉率、器官和皮張發(fā)育無顯著影響，但羔羊平均日增重和胴體重有升高趨勢(shì)。枯草芽孢桿菌顯著降低了7～28日齡湖羊羔羊背最長肌中UFA、MUFA的含量，以及MUFA∶PUFA和肱二頭肌中UFA、SFA、MUFA的含量和MUFA∶PUFA，顯著提高了湖羊羔羊背最長肌中的SFA∶UFA和肱二頭肌中PUFA、n-6PUFA的含量和SFA∶UFA、PUFA∶SFA，表明枯草芽孢桿菌可通過對(duì)肌內(nèi)脂肪酸組成比例和含量的影響來改善湖羊羔羊肉品質(zhì)。