高林歌，邵冰豪，朱星浩，陳 博，郭鈺君，黃艷群，陳 文

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 飼料營(yíng)養(yǎng)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

本試驗(yàn)擬通過(guò)研究外源胰島素和限飼處理對(duì)PPP1R3C的表達(dá)效應(yīng)，揭示雞PPP1R3C的表達(dá)調(diào)控特性和潛在功能。蛋白磷酸酶1(PP1)全酶是由催化亞基(PP1c)和調(diào)節(jié)亞基組成，其活性主要靠調(diào)節(jié)亞基的磷酸化和變構(gòu)調(diào)控來(lái)控制[1]。胰島素的一個(gè)基礎(chǔ)作用是通過(guò)促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入肌肉和脂肪組織合成糖原，并抑制肝糖原的輸出來(lái)降低血糖濃度[2]。肌肉和肝中糖原的含量受兩種關(guān)鍵的酶調(diào)控，即糖原磷酸化酶(GP)和糖原合成酶(GS)[3]。GS和GP的活性受磷酸化和去磷酸化的調(diào)控，GS受蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3(GSK3)的磷酸化抑制，通過(guò)糖原合成酶磷酸酶(GSP)去磷酸化激活，而GP可被磷酸化激酶激活，并被蛋白磷酸酶1的去磷酸化而抑制[4]。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，共有7個(gè)調(diào)節(jié)亞基被推斷為人類糖原靶向亞基，而這7個(gè) 編碼調(diào)節(jié)亞基的基因分別被稱為PPP1R3A～PPP1R3G[5]。它們都包含有PP1c調(diào)節(jié)基序[6]、糖原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7-8]。PP1對(duì)糖原代謝酶具有調(diào)節(jié)作用，因此在糖代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。

PPP1R3C是蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C，在人體內(nèi)又被稱為PPP1R5或PTG，主要在骨骼肌和肝中高度表達(dá)[9-10]。目前，PPP1R3C的研究主要集中于哺乳動(dòng)物的糖原代謝酶活性調(diào)節(jié)以及糖原的合成[11-12]。Zhai等[13]通過(guò)敲除小鼠PPP1R3C基因發(fā)現(xiàn)，小鼠胰島素敏感性顯著增強(qiáng)且能量消耗增加。另有研究表明，敲除小鼠原代肝細(xì)胞中的PPP1R3C降低了肝糖生成，與正常小鼠相比PPP1R3C在肥胖小鼠體內(nèi)表達(dá)量升高[14]。PPP1R3C也是一種新型的低氧誘導(dǎo)因子的靶基因，Mohindra等[15]發(fā)現(xiàn)，在短期缺氧條件下PPP1R3C在印度鯰魚的胰島素敏感組織(肌肉和肝)中表達(dá)量顯著增加。另外，PPP1R3C也與一些疾病的發(fā)生相關(guān)，Chown等[16]敲除PPP1R3C降低了大鼠骨骼肌葡聚糖的積累，減少了成年大鼠葡聚糖體病的發(fā)生；Dang等[17]發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯能抑制大鼠PPP1R3C的表達(dá)，從而減輕非酒精性脂肪肝病。PPP1R3C在雞上鮮有研究報(bào)道，Ji等[18]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C是背部和腿部皮膚的一個(gè)差異表達(dá)基因，Tian等[19]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C是鉻中毒引起雞肝代謝異常的一個(gè)差異表達(dá)基因。

目前，關(guān)于PPP1R3C在家禽方面尚未有系統(tǒng)的研究。本試驗(yàn)分析了雞PPP1R3C在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，及外源胰島素和能量限飼對(duì)雞PPP1R3C的表達(dá)效應(yīng)。掌握雞PPP1R3C的時(shí)空表達(dá)特性，揭示外源胰島素和能量限飼對(duì)雞PPP1R3C表達(dá)的影響，相關(guān)研究將為深入揭示雞PPP1R3C基因生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

試驗(yàn)一：取相同批次的肉雞種蛋，于孵化箱37 ℃孵化，在孵化期間于14和19胚齡各挑選10只取胸肌等組織樣。待孵化后在相同條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，分別飼喂至7和21日齡，各取10只雌性肉雞胸肌組織樣，于液氮速凍后-80 ℃保存。

試驗(yàn)二：采用相同批次的雄性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)。參考本實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)分組[20]，隨機(jī)取40只體重相近的24日齡的雞分為兩組(每組20只)，試驗(yàn)開始前兩組均禁食12 h。試驗(yàn)組腹腔注射0.05 mL·kg-1的胰島素處理，記為INS組；對(duì)照組腹腔注射同劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)處理，記為PBS組。試驗(yàn)期間所有雞只均保持自由飲水，試驗(yàn)所用胰島素用PBS進(jìn)行稀釋(胰島素∶PBS=1∶9)，所用胰島素為諾和銳短效胰島素(胰島素規(guī)格3 mL=300 IU)。禁食后在胰島素和PBS注射之前(0 min)屠宰5只，在胰島素和PBS注射后15、120和240 min各屠宰5只，采取胸肌、肝和腹脂等組織迅速置于液氮中速凍后-80 ℃ 保存。并以0 min組織樣為基礎(chǔ)狀態(tài)，檢測(cè)PPP1R3C在不同組織中的表達(dá)情況。

試驗(yàn)三：相同批次的雌性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)、自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，飼養(yǎng)至18日齡時(shí)隨機(jī)挑取40只體重相近的雞分為對(duì)照組和能量限飼組。對(duì)照組自由采食常規(guī)日糧，能量限飼組則實(shí)施30%的能量限制(在對(duì)照組平均日采食量的80%基礎(chǔ)上飼喂低能日糧)的處理，日糧配方參考本實(shí)驗(yàn)室前期研究的能量限飼配方[21]。試驗(yàn)進(jìn)行至48天時(shí)，每組各屠宰10只雞，并采集胸肌和肝等組織置于液氮中速凍后-80 ℃保存。

試驗(yàn)四：取相同批次的雌性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)、自由采食、飲水，飼料標(biāo)準(zhǔn)參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，飼喂至7日齡時(shí)隨機(jī)挑選30只體重相近的雞分為3組(對(duì)照組、能量限飼組和蛋白限飼組)。對(duì)照組自由采食常規(guī)日糧；能量限飼組自由采食能量限制飼糧(實(shí)行15%的能量限制)；蛋白限飼組自由采食蛋白限制飼糧(實(shí)行15%的蛋白限制)，能量限制飼糧和蛋白限制飼糧的其他營(yíng)養(yǎng)水平與常規(guī)日糧均一致，飼糧配方參照本實(shí)驗(yàn)室前期的限制配方[22]。試驗(yàn)進(jìn)行至21日齡時(shí)，每組各屠宰10只雞，并取胸肌等組織樣于液氮中速凍后-80 ℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PPP1R3C基因序列(登錄號(hào)：XM_423102.5)，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，通過(guò)生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。本試驗(yàn)所用的PPP1R3C及β-actin(登錄號(hào)：NM_205518.1)基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物信息

1.3 RNA提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取肉雞各組織RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，利用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度以及OD260 nm/OD280 nm。所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒為HiScript Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme，南京)。反轉(zhuǎn)錄體系包括兩步：1)去除基因組DNA：Total RNA 1 μg、5×gDNA wiper Mix 2 μL，用ddH2O補(bǔ)充至10 μL; 反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min。2)合成cDNA：第一步的混合液10 μL、10×RT Mix 2 μL、HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL、Oligo(dT)20VN 1 μL、Random hexamers 1 μL、ddH2O 4 μL;反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，cDNA于-20 ℃保存。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPP1R3C的相對(duì)表達(dá)量。所用qRT-PCR試劑盒為ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)，qPCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，加ddH2O補(bǔ)充至20 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)體系均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。所有qRT-PCR結(jié)果均采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[23]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)利用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。除同一時(shí)間點(diǎn)胰島素和PBS間的顯著性采用t檢驗(yàn)外，其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan’s多重比較。以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結(jié) 果

2.1 雞PPP1R3C基因組織表達(dá)分析

利用采集的試驗(yàn)二肉雞基礎(chǔ)狀態(tài)(胰島素和PBS注射之前，0 min)組織樣品，首先利用表1中的引物信息，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)雞PPP1R3C在各個(gè)組織中的表達(dá)量(圖1A)，RT-PCR結(jié)果顯示，PPP1R3C在心、胸肌和腿肌中高表達(dá)，在脾、肌胃和腺胃等組織表達(dá)較低。然后利用qRT-PCR定量檢測(cè)PPP1R3C在AA肉雞不同組織中mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(圖1B)，研究發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C在胸肌中的表達(dá)量最高，而在脾組織中最低。胸肌中PPP1R3C mRNA水平顯著高于心肌和腿肌等其余8個(gè)組織(P<0.05)，PPP1R3C在心肌中的表達(dá)量顯著高于肝、脾、肺、肌胃、腺胃和腹脂(P<0.05)。而PPP1R3C在其他組織的表達(dá)量沒有顯著差異(P>0.05)。

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PPP1R3C組織表達(dá)譜；B.qRT-PCR檢測(cè)PPP1R3C 組織表達(dá)譜。β-actin為內(nèi)參基因。不同字母表示P<0.05；相同字母表示P>0.05。Marker.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.2 PPP1R3C在雞不同發(fā)育時(shí)期胸肌中的表達(dá)

采用試驗(yàn)一中采集的組織樣品檢測(cè)雞不同發(fā)育時(shí)期胸肌中PPP1R3C的表達(dá)量(圖2)。結(jié)果表明，PPP1R3C表達(dá)量呈現(xiàn)了明顯隨雞的發(fā)育而升高的趨勢(shì)。在胚胎發(fā)育早期(14胚齡)表達(dá)比較低，隨后各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)PPP1R3C的表達(dá)水平均極顯著高于前一個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)。

**.P<0.01

2.3 外源胰島素對(duì)雞PPP1R3C表達(dá)的影響

利用試驗(yàn)二中采集到的樣品檢測(cè)了胰島素注射0(胰島素和PBS注射之前)、15、120和240 min后胸肌、肝、脂肪組織中的PPP1R3C mRNA表達(dá)量(以PBS為對(duì)照，圖3)。在胸肌組織中(圖3A)，胰島素注射顯著降低了PPP1R3C在胸肌組織的表達(dá)水平，在胰島素注射后120 min時(shí)PPP1R3C mRNA的表達(dá)水平顯著低于0 min和15 min。PBS注射后PPP1R3C表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)間沒有發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。在注射后120 min和240 min時(shí)，INS組與PBS組相比PPP1R3C表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，而在注射后15 min時(shí)INS組與PBS組的差異沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

在肝組織中(圖3B)，胰島素注射顯著降低了PPP1R3C在肝組織的mRNA表達(dá)水平，胰島素注射后15 min時(shí)PPP1R3C表達(dá)量顯著低于0 min(P<0.05)，而15、120、240 min間PPP1R3C mRNA水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。PBS注射后PPP1R3C的表達(dá)呈現(xiàn)波浪式的波動(dòng)，但總體處于動(dòng)態(tài)平衡。與PBS組相比，在胰島素注射后120 min時(shí)PPP1R3C表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，胰島素注射后15和240 min時(shí)與PBS組的差異沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

在腹脂組織中(圖3C)，胰島素注射后PPP1R3C mRNA水平呈現(xiàn)了完全不同于胸肌和肝臟組織的表達(dá)變化趨勢(shì)。胰島素注射后PPP1R3C mRNA表達(dá)水平迅速上調(diào)后又逐漸回落到0 min水平，胰島素注射后15 min與0 min相比PPP1R3C表達(dá)量大約升高了2倍(P<0.05)，而120和240 min時(shí)與0 min相比PPP1R3C表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。PBS注射后PPP1R3C表達(dá)水平明顯降低，15、120和240 min時(shí)PPP1R3C表達(dá)量均明顯低于0 min，而PBS注射后15、120和240 min沒有顯著差異(P>0.05)。在注射后15 min時(shí)，INS組與PBS組相比PPP1R3C的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，在注射后120和240 min時(shí)，INS組與PBS組相比PPP1R3C mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

A.胰島素/PBS注射后胸肌中PPP1R3C的表達(dá)；B.胰島素/PBS注射后肝中PPP1R3C的表達(dá)；C.胰島素/PBS注射后腹脂中PPP1R3C的表達(dá)。INS組不同時(shí)間點(diǎn)間，不同字母表示P<0.05，相同字母表示P>0.05。同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間，*表示P<0.05，**表示P<0.01。INS.胰島素處理組；PBS.對(duì)照組

2.4 30%能量限飼對(duì)PPP1R3C表達(dá)量的影響

由于能量限飼可能導(dǎo)致體內(nèi)胰島素分泌水平的改變，本研究進(jìn)一步開展了能量限飼對(duì)PPP1R3C在胸肌和肝表達(dá)效應(yīng)的研究。結(jié)果表明，30%的能量限制極顯著降低了PPP1R3C在肉雞胸肌和肝中的表達(dá)量(P<0.05)。在胸肌組織中限飼組PPP1R3C的表達(dá)量大約降低了73%(圖4A)，在肝組織中限飼組PPP1R3C表達(dá)量大約降低了94%(圖4B)。

A.30%能量限飼后胸肌中PPP1R3C的表達(dá)；B.30%能量限飼后肝臟中PPP1R3C的表達(dá)。**.P<0.01

2.5 15%能量限飼和15%蛋白限飼對(duì)胸肌中PPP1R3C表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證能量限飼對(duì)PPP1R3C表達(dá)的影響是否具有普遍性，利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的群體分析了15%的能量限飼和15%蛋白限飼對(duì)PPP1R3C表達(dá)的效應(yīng)(圖5)。結(jié)果表明，對(duì)照組與15%能量限飼組相比，胸肌中PPP1R3C表達(dá)沒有顯著差異(圖5A)，蛋白限飼與對(duì)照組相比，胸肌中PPP1R3C的表達(dá)沒有顯著性變化(圖5B)。

A.15%能量限飼后胸肌中PPP1R3C的表達(dá)；B.15%蛋白限飼后胸肌中PPP1R3C的表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，雞PPP1R3C具有和哺乳動(dòng)物[24]相似的組織表達(dá)特性，也在骨骼肌中表達(dá)較高；時(shí)空表達(dá)結(jié)果顯示，隨著雞體的發(fā)育胸肌中PPP1R3C的表達(dá)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，顯示了雞PPP1R3C在肌肉發(fā)育中的潛在重要功能。另外，本研究表明，雞PPP1R3C是胰島素敏感基因，外源胰島素顯著改變了肉雞胸肌、肝和腹脂組織中PPP1R3C mRNA水平，且PPP1R3C對(duì)外源胰島素的響應(yīng)呈現(xiàn)了明顯的組織特異性。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，0.05 mL·kg-1的胰島素劑量在雞中是耐受的，胰島素注射能顯著降低肉雞的血糖水平，在胰島素注射后120 min內(nèi)肉雞血糖濃度幾乎呈線性下降，并在120 min時(shí)降至最低點(diǎn)[25]，直到240 min時(shí)仍然保持在低水平[26]。本研究中，胰島素注射后胸肌和肝組織中PPP1R3C表達(dá)呈現(xiàn)了和血糖相似的變化規(guī)律，顯示了雞胸肌和肝組織PPP1R3C對(duì)禁食血糖濃度的潛在正向調(diào)控作用。在哺乳動(dòng)物中的研究也表明，PPP1R3C是胰島素敏感基因，在胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的過(guò)程中起著重要的作用。肝過(guò)表達(dá)PPP1R3C顯著降低了小鼠自由采食狀態(tài)下血漿胰島素水平，并提升了禁食狀態(tài)下的血糖水平[27]。

胰島素能夠刺激肌肉和肝中的糖原合成，在進(jìn)食的碳水化合物中有20%被貯存在肝，30%貯存在肌肉中[28-29]。有研究表明，人肌肉細(xì)胞過(guò)表達(dá)PPP1R3C時(shí)細(xì)胞中糖原的積累顯著增加[30]；Greenberg等[31]發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PPP1R3C顯著提高了脂肪細(xì)胞的糖原合成，當(dāng)添加胰島素后脂肪細(xì)胞中的糖原合成效率進(jìn)一步增加；Jurczak等[32]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PPP1R3C顯著增加了小鼠脂肪細(xì)胞的糖原積累；當(dāng)全身性敲減PPP1R3C時(shí)小鼠胸肌、肝和脂肪中糖原水平均下降，且小鼠胸肌、肝和脂肪中糖原合成和葡萄糖攝取減少，而附睪脂肪中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)補(bǔ)償性增加[23-24，33]。上述的研究顯示，組織PPP1R3C表達(dá)水平與糖原水平呈正相關(guān)，高水平的PPP1R3C能夠促進(jìn)細(xì)胞中糖原的合成，低表達(dá)的PPP1R3C降低了細(xì)胞中糖原的積累。本研究中，外源胰島素降低了肉雞胸肌和肝中PPP1R3C的表達(dá)，上調(diào)了脂肪組織(15 min)的mRNA水平，提示雞體在對(duì)外源胰島素刺激下，一定程度上可能通過(guò)降低胸肌和肝臟PPP1R3C水平而減少胸肌和肝組織中糖原的合成和葡萄糖的攝取，而不完全補(bǔ)償性地增加腹脂中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。

肥胖會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥，包括2型糖尿病、脂肪肝等[34-35]。長(zhǎng)期高能量的攝入會(huì)引起胰島素抵抗，而低能量飲食能夠改善機(jī)體胰島素敏感性[36-38]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，30%能量限飼顯著降低了AA肉雞的體重、腹脂重以及甘油三酯和葡萄糖水平[39]，而其血清胰島素水平?jīng)]有明顯的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，30%能量限制產(chǎn)生了類似外源胰島素的效應(yīng)，顯著降低了胸肌和肝中PPP1R3C的表達(dá)。然而15%能量限飼和15%蛋白限飼均未能顯著改變雞PPP1R3C的mRNA水平，顯示了能量限飼對(duì)雞PPP1R3C的效應(yīng)具有劑量依賴性。另有研究表明，在高脂喂食的小鼠體內(nèi)PPP1R3C的表達(dá)升高了兩倍，禁食后再喂食小鼠體內(nèi)PPP1R3C的表達(dá)也顯著增加，另外高脂飼喂顯著增加了小鼠mTORC1的活性，而敲除PPP1R3C后小鼠的胰島素敏感性增加[40]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雞PPP1R3C呈現(xiàn)了明顯的時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)特性，PPP1R3C在所檢測(cè)組織中廣泛表達(dá)，在胸肌組織中表達(dá)量最高，其在胸肌組織中的表達(dá)量隨個(gè)體發(fā)育逐漸上升。外源胰島素顯著下調(diào)了PPP1R3C在胸肌和肝的表達(dá)，而上調(diào)了PPP1R3C在脂肪組織中的早期表達(dá)。15%能量限飼和15%蛋白限飼均未能顯著影響胸肌中PPP1R3C的表達(dá)，而30%能量限飼顯著下調(diào)了胸肌和肝臟中PPP1R3C的表達(dá)，顯示了能量限飼對(duì)PPP1R3C基因表達(dá)影響的劑量依賴性。