陳 云，王 凱，周樂樂，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，張守全*

(1.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，韶關(guān) 512005；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

在養(yǎng)豬業(yè)中，種公豬精液質(zhì)量是衡量其繁殖性能的重要指標之一[1]，氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)是體外引起公豬精液質(zhì)量下降的主要原因，精子在成熟階段以及保存過程中極易受到活性氧(reactive oxygen species, ROS)攻擊[2-3]，導(dǎo)致精子脂質(zhì)過氧化和正常生理被損害，引起精子的OS。目前，通過向精液稀釋液中添加外源性抗氧化劑改善解凍后精子的抗氧化防御系統(tǒng)，清除部分自由基和ROS[4]，從而保護精子免受氧化損傷[5]。谷胱甘肽過氧化物酶家族在氧化應(yīng)激中起著保護作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GPx6蛋白在公豬的附睪和精清高表達，其附著在精子頭部，通過影響抗氧化途徑的組成部分，阻止精子過早獲能[6]，但機制仍然不明確。GPx6最先在人嗅覺系統(tǒng)的上皮細胞[7]和胚胎組織被分離出來[8]，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，組成GPx6催化位點硒代半胱氨酸V的mRNA在睪丸中表達，在妊娠早期母豬血液中也能檢測到GPx6的表達[9]，它的生物學(xué)功能仍然不確定。目前，種公豬繁殖力衰退和氧化應(yīng)激是引起公豬精液質(zhì)量下降的主要原因，精液蛋白與公豬精子功能相關(guān)，對于精液蛋白GPx6在種豬繁育方面的研究還處于初級階段，相關(guān)報道寥寥無幾。本研究以大白豬公豬和母豬為研究對象，通過蛋白免疫印跡和免疫組化方法檢測大白豬生殖組織中GPx6蛋白的表達水平，對其在附睪細胞中進行定位；通過ELISA方法檢測精液中GPx6的表達量，統(tǒng)計公豬的繁殖性能指標，分析GPx6的表達量與繁殖性能的相關(guān)性；為深入挖掘GPx6蛋白與公豬受精能力的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)，為精液稀釋液的添加劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 大白公豬和種豬精液來自廣東某種豬場；生殖組織(睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、前列腺、尿道球腺、精囊腺、卵巢和輸卵管)來自15月齡大白公豬和大白母豬(各3頭)，屠宰程序參照中華人民共和國國家標準(GB 50317—2000)。

1.1.2 試驗動物 試驗于廣東某種豬場進行，按照公豬配種胎次≥20胎、3次配種公豬為同一頭的標準，選取20頭大白公豬為研究對象，統(tǒng)計相對應(yīng)的1 279頭 母豬生產(chǎn)數(shù)據(jù)(2014年5月—2017年12月)。采集公豬精液，每份精液樣品做3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

1.2 主要試劑及材料

PBS購自Thermo公司；丙酮、福爾馬林、多聚甲醛和蘇木素購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；正常兔血清和羊血清購自鼎國公司；Lysis buffer和BCA蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物有限公司；GPx6 ELISA檢測試劑盒購自TSZ公司；蛋白免疫印跡檢測中用到的試劑均購自廣州佳研生物科技有限公司；GPx6兔多克隆抗體購自Cloud-Clone公司，GAPDH鼠單克隆抗兔購自Sigma公司，HRP 標記羊抗鼠IgG抗體和HRP 標記羊抗IgG抗體購自Earthox公司。

高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；酶標儀購自Thermo公司；超微量分光光度計購自Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司；洗板機購自南昌普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；電泳儀購自Bio-Rad公司；實驗室專用超純水機購自四川沃特爾水處理有限公司；切片機購自徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白免疫印跡檢測 取10～20 mg組織加500 μL裂解液，勻漿研磨處理，使用Lysis buffer提取組織蛋白，根據(jù)BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書檢測總蛋白含量。蛋白樣品變性，在12% SDS-PAGE凝膠上上樣20 μg·孔-1，80 V電泳3 h；將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，90 V轉(zhuǎn)膜1 h，脫脂奶粉室溫封閉1 h，GPx6一抗(1∶1 000稀釋)孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜2次，TBS洗膜1次；二抗(1∶3 000稀釋)孵育，37 ℃孵育2 h，洗膜同上；ECL超敏發(fā)光液顯色，曝光顯影。以內(nèi)參GAPDH進行目的蛋白表達量校正。

1.3.2 免疫組化檢測 獲得新鮮的組織樣本，立即固定在10%的福爾馬林中，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度為4 μm。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復(fù)。3%兔血清封閉(TBS溶液稀釋)，室溫孵育30 min。PBS沖洗3次。添加兔源GPx6一抗(1∶500稀釋)，陰性對照為兔血清，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，加HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，終止。蘇木精復(fù)染，酒精脫水，樹膠封片，熒光顯微鏡檢查玻片，圖像采集分析，陽性細胞(GPx6蛋白表達的細胞)的著色為棕褐色，沒有表達的均為紫藍色，即細胞核的顏色。

1.3.3 精液蛋白提取 取2 mL精液，4 ℃，2 000 r·min-1離心15 min分離精子和精清，取上清液，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清按體積比1∶2加入預(yù)冷丙酮，-20 ℃放置4 h。取2 mL 析出液，12 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，得到精清蛋白。精液離心后的沉淀即為精子沉淀，用PBS清洗3次，每次2 000 r·min-1，4 ℃離心10 min。加入0.5 mL的Lysis buffer溶液，提取精子蛋白，冰上操作。最后，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測總蛋白含量，根據(jù)GPx6 ELISA試劑盒檢測GPx6蛋白含量，GPx6蛋白相對含量= GPx6 ELISA含量/總蛋白含量。

1.3.4 測定指標及統(tǒng)計方法 根據(jù)評定大白公豬受精能力的數(shù)學(xué)模型對大白公豬進行高低繁殖力分組[10]，通過篩選和統(tǒng)計，選取20頭公豬配種的合格母豬1 279頭，統(tǒng)計和計算生產(chǎn)數(shù)據(jù)，進而得到繁殖性能數(shù)據(jù)；母豬生產(chǎn)指標包括總仔數(shù)、活仔數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊數(shù)和畸形數(shù)，公豬繁殖性能指標包括窩產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)、窩產(chǎn)總仔數(shù)(TNB)、配種母豬數(shù)、分娩母豬數(shù)、分娩率(FR)和繁殖力。其中，F(xiàn)R=分娩母豬數(shù)/配種母豬數(shù)×100%，繁殖力=FR×NBA。統(tǒng)計種公豬的繁殖指標數(shù)據(jù)和GPx6蛋白的相對含量數(shù)據(jù)，進行顯著相關(guān)性檢驗；將GPx6蛋白相對含量按從高到低排序，選取排名前30%為高含量組，后30%的為低含量組，檢測不同的繁殖指標與精子和精清中GPx6蛋白含量的關(guān)系。精子中GPx6蛋白按含量分組后，高含量組5頭公豬對應(yīng)的配種母豬頭數(shù)為401頭，低含量組5頭公豬對應(yīng)的配種母豬頭數(shù)為237頭；精清中GPx6蛋白按含量分組后，高含量組5頭公豬對應(yīng)的配種母豬頭數(shù)為452頭，低含量組5頭公豬對應(yīng)的配種母豬頭數(shù)為343頭。

1.4 統(tǒng)計與分析

篩選并采集20頭大白種公豬精液，統(tǒng)計分析公豬繁殖性能指標(窩產(chǎn)總仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、分娩率和繁殖力)。使用IBM SPSS Statistics 21軟件的獨立樣本t檢驗及單因素方差分析(one way ANOVA)，進行差異顯著性分析；用雙變量Pearson相關(guān)分析，P<0.05 表示差異或相關(guān)顯著，結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 GPx6在大白豬生殖組織中的表達

通過蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測GPx6蛋白在大白豬生殖組織中的表達，結(jié)果顯示，GPx6在附睪頭、附睪體和附睪尾中高表達(圖1)。

1.睪丸；2～4.附睪頭、附睪體、附睪尾；5.尿道球腺；6.前列腺；7.精囊腺；8.卵巢；9.輸卵管

2.2 GPx6蛋白在大白公豬附睪組織中的定位

運用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)方法檢測GPx6在大白公豬附睪細胞中表達。公豬附睪組織IHC結(jié)果顯示，相對于陰性對照(圖2A、C)，GPx6在附睪組織的頂細胞、基底細胞、暈細胞、主細胞和精子中表達，在肌樣細胞中不表達(圖2)。

A、C.陰性對照；B、D.GPx6組.a.頂細胞；b.基底細胞；h.暈細胞；m.肌樣細胞；p.主細胞；s.精子

2.3 GPx6蛋白與公豬繁殖性能的相關(guān)性分析

2.3.1 大白公豬精子和精清中GPx6含量的檢測 采集20頭大白種公豬精液，提取精子蛋白和精清蛋白，通過BCA方法檢測總蛋白含量，通過GPx6 ELISA試劑盒檢測精子和精清中GPx6蛋白的含量，計算出GPx6相對含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子和精清中均含有GPx6蛋白，精清中GPx6蛋白含量是精子中的7倍，差異顯著(P<0.05，表1)。

表1 精子和精清中GPx6蛋白的含量比較

2.3.2 精液中GPx6蛋白含量與繁殖性能的相關(guān)性 統(tǒng)計母豬的生產(chǎn)成績，計算分析公豬的繁殖性能，使用SPSS軟件分析GPx6蛋白含量和繁殖性能的關(guān)系。結(jié)果表明，大白公豬精子的GPx6蛋白含量與所有繁殖參數(shù)呈負相關(guān)，精清中的GPx6蛋白含量與窩產(chǎn)總仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)和繁殖力呈負相關(guān)，與分娩率無顯著相關(guān)(表2)。

表2 精子GPx6蛋白含量與大白公豬繁殖性能的相關(guān)性分析

2.3.3 GPx6蛋白影響公豬繁殖性能的初步驗證 使用SPSS軟件分析精子和精清中的不同GPx6蛋白含量與繁殖指標的關(guān)系。結(jié)果表明，除了精清高、低含量組的分娩率和繁殖力外，精子和精清高含量組的窩產(chǎn)活仔數(shù)和窩產(chǎn)總仔數(shù)均低于低含量組，但差異不顯著；大白公豬中精子中的GPx6蛋白含量與窩產(chǎn)總仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)和繁殖力負相關(guān)，精清中的GPx6蛋白含量與窩總產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)活仔數(shù)負相關(guān)(表3)。

表3 大白公豬精液中的不同GPx6蛋白含量與繁殖性能的相關(guān)性分析

3 討 論

GPxs作為一種有效的抗氧化保護劑，在植物中研究的比較多。據(jù)報道，它能清除磷脂氫過氧化物，并在氧化脫氫酶的消耗和脅迫信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可防止包括重金屬在內(nèi)的多種污染物產(chǎn)生過量的活性氧[11-14]，特別是銅和鉛離子[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測擬南芥中GPx6的含量可以預(yù)測酯類對植物的不良影響[17]。在動物中，由活性氧產(chǎn)引起的聽力損失，與耳蝸聽覺部分GPx6基因的表達顯著相關(guān)[18]。同時，研究表明，小鼠胚胎線粒體GPx6 mRNA的表達水平與ROS過量引起的線粒體功能障礙有關(guān)[19]?？傊?，無論在植物還是動物中，GPx6的作用與ROS息息相關(guān)。

GPx蛋白家族在進化過程中形成了兩個亞類，一類包括GPx1和GPx2，另一類包括GPx3、GPx5和GPx6，各蛋白成員均有高度保守的GPx蛋白家族基序和硒代半胱氨酸或半胱氨酸[20]。GPx6與GPx5屬于同一亞類，在對山羊各組織的GPx家族基因進行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，GPx6和GPx5在山羊的睪丸和附睪中都有表達[21]。研究進一步發(fā)現(xiàn)，GPx5在附睪中特異性表達，且與精子功能有關(guān)，是精子質(zhì)量的生物標記[22]，它可以保護細胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和DNA突變的影響[23]。GPx6與GPx5是同源蛋白，在蛋白結(jié)構(gòu)和功能上存在相似性，GPx6可能與精子質(zhì)量和氧化應(yīng)激有關(guān)。同時，GPx6蛋白在精液中的表達量與公豬繁殖性能負相關(guān)，而不能像GPx5蛋白一樣被作為抗氧化酶和精子質(zhì)量的標志物，這表明，即使是同源蛋白，功能上也存在一定的差異[24]，可能是因為GPx6是硒依賴性蛋白，而GPx5是半胱氨酸GPx蛋白，具體的原因和機制還需進一步探索。

GPx6首次在嗅覺系統(tǒng)的鮑曼氏腺中被發(fā)現(xiàn)，鮑曼氏腺是上皮細胞中的一種巨形多細胞體[7]。早期已有研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺受體GRK3/BARK2在哺乳動物的精子中被鑒定出來，可能與精子的趨化性有關(guān)[25]。在人精子細胞中對嗅覺受體OR1D2活性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其活性在可育和亞可育的雄性之間有所不同[26]。Souto等[27]在研究兩個適應(yīng)性亞熱帶氣候的牛品種精清蛋白的季節(jié)性表達時，發(fā)現(xiàn)牛精清中GPx6蛋白的豐度在夏季比冬季要高，是影響精子特異性最關(guān)鍵的蛋白之一。由此可見，精液蛋白GPx6的表達與精子的受精力必定存在關(guān)聯(lián)性。

本研究通過IHC試驗發(fā)現(xiàn)，GPx6在附睪的頂細胞、基底細胞、暈細胞、主細胞和精子中表達，由于精子需要兩周才能到達儲存精子的附睪尾[28]，推測GPx6在附睪中可能以外泌體的形式通過與精子頭部表面結(jié)合附著在精子上[29]。該假設(shè)得到以下研究的支持，即精液蛋白GPx5在附睪中的特異性表達，已證明它與可以轉(zhuǎn)移到精子頭部、覆蓋頂體的外泌體相關(guān)，防止精子過早發(fā)生頂體反應(yīng)，保護精子膜免受損傷[30]?？傊珿Px6在附睪的頂細胞、基底細胞、暈細胞、主細胞和精子中表達，影響公豬的繁殖性能相關(guān)，其作用可能與保持精子功能和精子質(zhì)量的提高有關(guān)，該研究為后期GPx6蛋白在公豬精子受精力和精液稀釋液方面的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

綜上所述，GPx6在公豬和母豬生殖組織中差異性表達，在附睪頭、附睪體和附睪尾高表達，且定位在附睪的頂細胞、基底細胞、暈細胞、主細胞和精子中；GPx6蛋白在精清中的表達是精子中的7倍，且在精液中的表達量與窩產(chǎn)活仔數(shù)和窩產(chǎn)總仔數(shù)呈負相關(guān)關(guān)系。