謝 寧，張凱藝，阮進(jìn)學(xué)，2，陶 聰，吳添文，王彥芳，楊述林*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

骨骼肌作為胰島素調(diào)節(jié)外周組織葡萄糖攝取的主要部位，其胰島素抵抗是糖尿病發(fā)生的重要原因之一[1]。骨骼肌作為動(dòng)物機(jī)體能量消耗的主要組織，也是機(jī)體調(diào)節(jié)能量代謝的樞紐，可以根據(jù)不同的能量需求，快速在糖酵解、氧化磷酸化或脂肪酸氧化等能量產(chǎn)生方式間切換，以滿足不同能量需求的周轉(zhuǎn)[2-4]。與之相適應(yīng)的是肌纖維異質(zhì)性，保證了骨骼肌的這種代謝靈活性，例如，有氧運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌的能量需求，促使肌纖維表型從快肌纖維向慢肌纖維轉(zhuǎn)化，以此滿足機(jī)體的能量需求[5]。骨骼肌還提供了通過增加運(yùn)動(dòng)量和以不依賴胰島素的方式攝取葡萄糖，恢復(fù)體內(nèi)代謝平衡，為治愈2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)提供新的方法與思路[6]。提示，肌肉的適應(yīng)性變化可能對(duì)疾病治療產(chǎn)生有益影響。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glut4)是骨骼肌和脂肪組織特異性表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在胰島素調(diào)控下快速響應(yīng)機(jī)體的血糖變化，對(duì)維持體內(nèi)血糖穩(wěn)定具有重要作用。Glut4由slc2a4基因編碼，是MFS(major facilitator superfamily)超家族成員之一，具有MFS共有的12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。Glut4還具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其N端包含的苯丙氨酸殘基和C端包含的雙亮氨酸序列是參與胰島素應(yīng)答和膜轉(zhuǎn)位的重要結(jié)構(gòu)[7]，同時(shí)也是唯一響應(yīng)胰島素信號(hào)，從囊泡結(jié)構(gòu)中重新分布到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷是構(gòu)成胰島素抵抗的基礎(chǔ)?；贕lut4是實(shí)現(xiàn)組織攝取葡萄糖的最后一步，以及它對(duì)胰島素的響應(yīng)，因此被認(rèn)為是糖尿病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。大量關(guān)于天然物質(zhì)對(duì)降糖的研究都是基于改善Glut4的功能，例如花青素就是通過顯著改善了Glut4的表達(dá)，增加了Glut4的移位和葡萄糖的攝取從而用于血糖的維持[9]。針對(duì)Glut4在糖脂代謝及肌纖維重塑方面的作用已開展大量研究工作，例如，通過構(gòu)建脂肪與肌肉Glut4敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟葡萄糖攝取和脂肪合成均增加了，并且使得肌肉優(yōu)先利用脂質(zhì)供能來(lái)適應(yīng)代謝的變化[10]。肌肉過表達(dá)Glut4的小鼠糖酵解增強(qiáng)，脂肪酸氧化減弱，在腓腸肌中IIb型肌纖維的比例與野生鼠相比減少28%，IIa型纖維比例增加11%[11]。基于以上對(duì)Glut4的研究發(fā)現(xiàn)，Glut4對(duì)糖尿病的治療至關(guān)重要，然而Glut4敲除后造成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體缺失，不能進(jìn)一步研究胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下Glut4膜轉(zhuǎn)位調(diào)控機(jī)制及治療靶點(diǎn)篩選。

基于Glut4與家族成員在葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)的高度同源性，以及通過Glut1逐點(diǎn)突變確定Gln161在葡萄糖結(jié)合中的關(guān)鍵作用[12-13]，本研究對(duì)Glut4的177位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得單個(gè)氨基酸突變的小鼠。通過研究Glut4突變對(duì)肌肉糖脂代謝及肌纖維重塑的影響，為2型糖尿病的治療及家畜生產(chǎn)提供模型及參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在Ensemble網(wǎng)站上查找基因編號(hào)為ENSMUSG00000018566的slc2a4基因序列，利用CRISPR/Cas9在其第五外顯子上將距5′-UTR 2 110位 的堿基A突變?yōu)門，質(zhì)粒載體委托協(xié)和醫(yī)院構(gòu)建。健康22周齡C57BL/6 J小鼠分為野生型(Glut4+/+)和Glut4基因純合突變鼠(Glut4m/m)。小鼠飼養(yǎng)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 試劑與儀器

KAPA Express Extract DNA Extraction Kit(羅氏)；胰島素試劑盒(Mercodia)；瘦素試劑盒、脂聯(lián)素試劑盒(R&D)；20%葡萄糖溶液(北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)；精蛋白生物合成人胰島素注射液(SIGMA)；RTIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；Invitrogen PowerUpTMSYBR?Green Master Mix熒光定量試劑盒(北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)；組織蛋白提取試劑(賽默飛世爾科技)；電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PVDF膜(北京博通興業(yè)生物科技有限公司)；AMPK-ɑ抗體、兔抗Thr172磷酸化AMPKα 抗體(CST)；Glut4 抗體(Abcam)。

血糖儀及血糖試紙(強(qiáng)生)；普通PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽(Bio-Rad)；Nano100微量分光光度計(jì)(奧盛)；熒光定量PCR儀(ABI)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；組織勻漿儀(Bertin technologies)；制冰機(jī)(SANYO)。

1.3 方法

1.3.1 鼠基因型的鑒定 取小鼠尾尖2 mm3的組織塊，使用KAPA Express試劑盒快速抽提小鼠DNA：EP管中加入10×KAPA Quick Extract Buffer 5 μL、ddH2O 44 μL、KAPA Quick Extract Enzyme 1 μL，共50 μL。PCR儀設(shè)置程序：75 ℃ 15 min，95 ℃5 min，12 ℃ 30 s。從獲取的DNA上清中取2.5 μL，加入2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物(上游引物: 5′-TTGGACGGTTCCTCATTGGC-3′,下游引物: 5′-GCTCTTCCTTCCAGCCCAAAT-3′)各1 μL，ddH2O 5.5 μL。設(shè)置程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，72 ℃ 10 min，34個(gè)循環(huán)。將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序。

1.3.2 血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 小鼠摘眼球法采血，處死小鼠，血樣3 000 r·min-1離心10 min，取上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作檢測(cè)胰島素、脂聯(lián)素、瘦素水平，使用日本奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化儀檢測(cè)甘油三酯的含量。

1.3.3 糖耐量與胰島素耐量水平檢測(cè) 配置20%的葡萄糖溶液，小鼠空腹禁食16 h，每只小鼠腹腔注射0.01 mL·g-1的葡萄糖，使用血糖儀分別在15、30、60、90、120、150 min檢測(cè)血糖并記錄。使用GraphPad Prism 8.0計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUC)，AUC值越大，代表小鼠降血糖的能力越差，糖耐量水平越差。

配置0.1 U·mL-1胰島素溶液，小鼠空腹禁食4 h，每只小鼠腹腔注射0.1 U·mL-1的胰島素溶液，在15、30、45、60、90 min測(cè)定每只小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值，同上述步驟計(jì)算AUC。

1.3.4 熒光定量PCR檢測(cè) 使用Trizol傳統(tǒng)方法提取RNA，即TRIzol破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞，氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA，75%酒精分離提純獲得總RNA。Nana100測(cè)定RNA濃度后，使用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。借助SYBRTMSelect Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系為SYBR染料10 μL, 上、下游引物(表1)各1 μL, ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s, 60 ℃ 34 s, 共40個(gè)循環(huán)，最后得到擴(kuò)增曲線，用內(nèi)參18S校正后，計(jì)算基因的表達(dá)量。

表1 熒光定量引物序列

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 取100 mg腓腸肌組織，加入400 μL含有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的裂解液，勻漿機(jī)破碎組織，冰上孵育30 min后離心4 ℃ 12 000 r·min-1，30 min吸取上清獲得蛋白。蛋白變性后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟得到蛋白成像圖。使用ImageJ 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行平行試驗(yàn)檢測(cè)，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，血清學(xué)檢測(cè)、基因的表達(dá)與蛋白檢測(cè)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析顯著性，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 8.0繪圖，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 Glut4突變鼠的制備與陽(yáng)性鑒定

為降低小鼠骨骼肌和脂肪組織葡萄糖攝取能力，針對(duì)受胰島素調(diào)控的Glut4葡萄糖結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。已有報(bào)道表明，將Glut4第177位谷氨酰胺(Q)為突變?yōu)橘嚢彼?L)，Glut4的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降至原來(lái)的5%～10%[14]。根據(jù)slc2a4的基因序列，在第五外顯子上設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9的靶向gRNA，切割后經(jīng)靶向序列修復(fù)將導(dǎo)致Glut4第177位Q→L的單氨基酸突變(圖1A)。將gRNA與Cas9蛋白構(gòu)建載體，顯微注射到小鼠受精卵，制備Glut4Q177L單氨基酸突變的小鼠。以包含突變位點(diǎn)片段兩側(cè)的序列為參考設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定陽(yáng)性個(gè)體，圖1B顯示，靶點(diǎn)處單峰A為野生型，單峰T為Glut4突變純合子。

A.slc2a4基因結(jié)構(gòu)圖；B.測(cè)序峰圖，上方為野生型小鼠序列，下方為Glut4純合突變小鼠序列

2.2 Glut4突變鼠表型評(píng)價(jià)

2.2.1 體重與組織稱重 為評(píng)價(jià)Glut4突變限制脂肪和骨骼肌葡萄糖攝取能力后機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育能力，對(duì)22周齡兩組小鼠的體重及皮下脂肪、褐色脂肪、附睪脂肪、胰腺、肝臟、腎臟、腸系膜脂肪、心臟、心周脂、腎周脂以及右后側(cè)肢分別進(jìn)行稱重。結(jié)果顯示，突變小鼠體重((23.37±0.75)g)極顯著低于野生型小鼠((28.47±0.31)g)(P<0.01,圖2A)，其中皮下脂肪、附睪脂及腸系膜脂重量相對(duì)于體重的比例顯著改變，分別從野生型1.91%、2.18%和0.97%下降到1.37%、1.20%和0.46%(P<0.05,圖2B)。除此之外，突變鼠的心臟、肝臟有代償增大的趨勢(shì)，同時(shí)，腿部肌肉占體重比例有增加趨勢(shì)，但是在22周齡未達(dá)到顯著水平。突變鼠內(nèi)臟脂肪與皮下脂肪的減少表明Glut4基因突變可能改變了脂質(zhì)的分布與利用。

*.P<0.05；**.P<0.01,下同

2.2.2 突變鼠糖耐量受損 為評(píng)價(jià)Glut4突變對(duì)全身葡萄糖攝取能力的影響，對(duì)22周齡小鼠的糖耐量與胰島素耐量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。糖耐量結(jié)果顯示，野生型小鼠在注射葡萄糖15 min后血糖達(dá)到最高值隨后下降，而突變鼠在30 min達(dá)到最高，血糖下降的延遲說(shuō)明突變鼠胰島素對(duì)糖的響應(yīng)能力減弱(圖3A)，進(jìn)一步分析葡萄糖曲線下面積顯示，突變鼠的曲線下面積極顯著大于對(duì)照(P<0.01，圖3B)。同時(shí)，胰島素耐量結(jié)果顯示，突變鼠注射胰島素后血糖下降緩慢，且曲線下面積極顯著大于對(duì)照組(P<0.01，圖3C，D)。以上結(jié)果說(shuō)明，Glut4基因突變后延緩了血糖的處理速度，血糖下降困難，造成突變鼠的糖代謝紊亂。

圖3 糖耐量與胰島素耐量血糖值與曲線下面積

2.2.3 血清學(xué)指標(biāo) 動(dòng)物個(gè)體糖代謝與脂代謝密切相關(guān)，組織間通過分泌激素或細(xì)胞因子進(jìn)行相互調(diào)控，為此，本研究測(cè)定了兩組鼠血清學(xué)甘油三酯、胰島素、脂聯(lián)素和瘦素等的變化情況。突變鼠血清中甘油三酯的含量((0.77±0.11)mmol·L-1)顯著低于對(duì)照組((1.20±0.21)mmol·L-1)(P<0.05，圖4A)，提示突變鼠可能對(duì)外周脂質(zhì)的利用增加，而血清中的胰島素、脂聯(lián)素和瘦素組間差異不顯著(圖4B～D)。

圖4 Glut4突變后小鼠血清指標(biāo)的變化

2.3 Glut4突變鼠的其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)

為了解Glut4突變對(duì)機(jī)體攝取葡萄糖的影響，對(duì)腓腸肌中多個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，Glut4的表達(dá)量最高，其次是Glut12。Glut4基因突變后，Glut4、Glut1和Glut12表達(dá)量出現(xiàn)顯著升高(P<0.05，圖5)，說(shuō)明在糖攝取不足時(shí)機(jī)體會(huì)增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，代償葡萄糖的攝取，以此維持葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。

圖5 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)

2.4 Glut4突變鼠骨骼肌脂質(zhì)分解與利用相關(guān)基因的表達(dá)

為了解Glut4突變骨骼肌糖攝取降低后，骨骼肌是如何滿足機(jī)體能量供應(yīng)的，進(jìn)一步對(duì)能量需求調(diào)控通路及脂代謝過程進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，調(diào)控能量代謝的5′-腺苷一磷酸激活蛋白激酶(AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1(PGC-1α)，胰島素信號(hào)通路中的胰島素受體底物(IRS)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)，脂代謝相關(guān)基因的脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂肪酶(HSL)、二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)、白細(xì)胞分化抗原36(CD36)、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(hFABP4)和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)基因，及肌肉細(xì)胞因子鳶尾素(Irisin)和白介素6(IL-6)等基因均顯著上調(diào)表達(dá)(圖6A)。上述結(jié)果表明，突變鼠在葡萄糖攝取不足的情況下會(huì)增強(qiáng)脂質(zhì)動(dòng)員相關(guān)基因的表達(dá)，且Glut4突變后機(jī)體利用能量的底物發(fā)生改變，促使脂肪酸的消耗與利用增強(qiáng)。為進(jìn)一步確定AMPK的激活程度，通過蛋白免疫印跡方法檢測(cè)顯示，突變鼠的AMPK與pAMPK表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖6B)，因此，Glut4基因突變后可以通過激活A(yù)MPK來(lái)加強(qiáng)對(duì)能量物質(zhì)的動(dòng)員。

圖6 脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)(A)與AMPK蛋白及磷酸化水平(B)

其次，為了解Glut4突變是否對(duì)其上游胰島素通路有影響，對(duì)胰島素信號(hào)通路的兩個(gè)關(guān)鍵基因IRS和PI3K進(jìn)行檢測(cè)，二者的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明Glut4突變后使得小鼠的胰島素敏感性增強(qiáng)。

此外，為了明確Glut4突變是否會(huì)對(duì)肌細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，本研究還檢測(cè)了肌細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)Irisin和IL-6的水平極顯著升高(P<0.01)。Irisin最早在骨骼肌中被發(fā)現(xiàn)，具有脂肪細(xì)胞棕化的作用；IL-6是重要的炎性因子，同時(shí)也是最早被鑒定的肌細(xì)胞因子，運(yùn)動(dòng)后的骨骼肌分泌IL-6，通過血液循環(huán)調(diào)控脂肪組織分解供應(yīng)能量。二者表達(dá)的增加提示突變鼠可能處于能量消耗增加狀態(tài)。

2.5 Glut4突變鼠慢肌纖維相關(guān)基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步確定突變鼠機(jī)體能量底物發(fā)生變化對(duì)肌肉的影響，本研究檢測(cè)了22周齡小鼠腓腸肌的肌纖維類型相關(guān)基因的表達(dá)情況。如圖7所示，突變鼠I型肌纖維MyHCI和快IIa型肌纖維MyHCIIa表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而IIb型肌纖維MyHCIIb的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，并且參與調(diào)控肌肉發(fā)育的肌細(xì)胞增強(qiáng)子因子2C(MEF2C)水平顯著升高(P<0.05)。

圖7 肌纖維類型相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

3 討 論

3.1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的代償表達(dá)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中輔助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要介質(zhì)。其中，Glut1具有與基礎(chǔ)血糖相近的Km值，維持全身各組織在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的功能。Glut2對(duì)葡萄糖具有低親和力和高轉(zhuǎn)運(yùn)率，對(duì)高糖環(huán)境敏感，有助于肝臟高效發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)功能。Glut3的底物親和力最高，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)先利用葡萄糖。Glut4是I組唯一胰島素敏感的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[15]。研究報(bào)道顯示，肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白總共有7個(gè)：Glut4、Glut5、Glut12、Glut8、Glut11、Glut3和Glut1，且在慢肌中Glut4、Glut5和Glut12的豐度最高[16]。與這一研究相似的是本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腓腸肌中Glut4、Glut12和Glut1的豐度遠(yuǎn)高于其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

Glut4的含量對(duì)于血糖調(diào)控至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)，肌肉特異性Glut4缺失小鼠的肌肉葡萄糖攝取量顯著降低[17]，此外，骨骼肌或者脂肪特異性敲除Glut4均會(huì)導(dǎo)致全身胰島素抵抗[18]。Glut4的過表達(dá)通過將高水平的Glut4蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面來(lái)緩解胰島素抵抗，導(dǎo)致血糖控制的顯著改善[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Glut4的表達(dá)增加反映了其調(diào)控血糖的重要性。

胰島素抵抗被認(rèn)為是2型糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵原因，而Glut4無(wú)法響應(yīng)胰島素抵抗是這種紊亂的促成因素。報(bào)道顯示，2型糖尿病患者中Glut4在慢肌纖維的豐度與健康對(duì)照組相比降低了18%[20]；而肌肉特異性敲除Glut4的小鼠在胰島素刺激，骨骼肌的葡萄糖攝取沒有受到損害，推測(cè)可能存在其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的代償作用[21]。在本研究中，Glut4突變后Glut4、Glut1和Glut12表達(dá)顯著升高，驗(yàn)證了在糖攝取不足情況下轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的代償效應(yīng)，然而，這種代償作用不能完全替代Glut4的功能，從而表現(xiàn)出胰島素抵抗特征。報(bào)道顯示，基因編輯Glut4缺失13 bp的3T3-L1中發(fā)現(xiàn)，Glut1表達(dá)增高而葡萄糖攝入量顯著低于對(duì)照組[22]。

3.2 Glut4基因突變可改變骨骼肌能量供應(yīng)底物和促進(jìn)脂質(zhì)利用

糖耐量是評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力和對(duì)葡萄糖敏感性的指標(biāo)[23]。本研究中，Glut4基因突變導(dǎo)致糖耐量受損，表明突變鼠減少葡萄糖作為能量物質(zhì)的利用，反映出Glut4在血糖調(diào)節(jié)中具有重要作用，這一結(jié)果與T2DM患者Glut4表達(dá)降低或膜轉(zhuǎn)位障礙引起的糖耐量受損一致，表明Glut4突變可以模擬T2DM患者中Glut4功能障礙的病理機(jī)制。

葡萄糖和甘油三酯是細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)和儲(chǔ)存的主要來(lái)源。肌肉具有轉(zhuǎn)換能量底物的代謝靈活性[24]。Kotani等[10]構(gòu)建脂肪和肌肉Glut4敲除小鼠，觀察到口服脂質(zhì)灌胃后小鼠呼吸熵降低且血清脂質(zhì)清除增加，發(fā)現(xiàn)Glut4敲除后小鼠肌肉優(yōu)先利用脂質(zhì)燃料來(lái)適應(yīng)糖的供應(yīng)不足。本研究中，脂肪水解(ATGL)和脂肪酸攝取、結(jié)合(CD36、FATP、hFABP4)相關(guān)基因均表達(dá)增加，表明Glut4突變降低葡萄糖攝取后，可促使小鼠能量底物從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅?，通過增加脂肪酸的利用以滿足能量需求。AMPK作為能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)通路，可通過調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝途徑來(lái)維持能量的平衡[25]。AMPK通過磷酸化ATGL促進(jìn)脂肪的吸收和釋放，激活的AMPK還可以招募肌膜上脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36以此增加游離脂肪酸的攝取[26]，以及增加FATP4和FABP4的表達(dá)，促進(jìn)能量的生成[27]。本研究中，AMPK以及其下游ATGL、FATP4和FABP4的表達(dá)水平均顯著升高，說(shuō)明Glut4突變小鼠對(duì)脂質(zhì)的利用增加是通過激活A(yù)MPK通路完成的。

AMPK除了直接對(duì)甘油三酯進(jìn)行分解以及促進(jìn)游離脂肪酸的利用外，還能促進(jìn)Irisin的表達(dá)[28]。Irisin是2012年發(fā)現(xiàn)的肌細(xì)胞因子，前體是FNDC5蛋白，由于Irisin具有促進(jìn)白色脂肪棕色化的減肥作用而廣受關(guān)注[29]。Irisin被認(rèn)為是PGC-1α依賴性肌因子，Bostr?m等[30]觀察發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以通過促進(jìn)PGC-1α刺激Irisin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)能量的消耗。肌肉特異性AMPKα2基因敲除小鼠導(dǎo)致FNDC5 mRNA水平降低[31]。因此AMPK-PGC-1α-Irisin在調(diào)控能量方面發(fā)揮重要的作用[32]。同樣，在本研究中觀察到AMPK、PGC-1α、Irisin基因均上調(diào)表達(dá)，提示Irisin在Glut4突變鼠調(diào)節(jié)能量代謝方面也起到積極作用。

Glut4突變鼠為了適應(yīng)葡萄糖攝取的不足，改變能量底物，進(jìn)而導(dǎo)致了脂質(zhì)的重分布。食物來(lái)源的脂肪經(jīng)消化分解后主要儲(chǔ)存在脂肪組織，而Glut4突變鼠內(nèi)臟脂肪與皮下脂肪組織重量減少，脂肪酸更多的流入肌肉組織，分解供能。因此Glut4突變影響了能量代謝與脂質(zhì)的重分布。

3.3 Glut4基因突變?cè)黾友趸吐±w維比例以適應(yīng)糖攝取不足

骨骼肌是由不同纖維類型組成的異質(zhì)組織，對(duì)全身胰島素刺激的葡萄糖代謝具有重要作用。不同類型肌纖維具有不同的葡萄糖代謝方式，I型纖維肌肉表達(dá)較高的胰島素受體和Glut4，具有更高的葡萄糖處理能力，其胰島素刺激的葡萄糖攝取量高于高度糖酵解II型纖維的肌肉，而II型纖維葡萄糖的氧化能力、Glut4的豐度以及對(duì)胰島素的響應(yīng)都弱于I型纖維[33]。通過底物感測(cè)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)和利用來(lái)有效適應(yīng)新陳代謝的能力被稱為代謝的靈活性[34]。代謝的靈活性對(duì)于能量過多或能量限制時(shí)以及在運(yùn)動(dòng)過程中能量需求變化時(shí)對(duì)維持能量穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[35]。骨骼肌具有代謝靈活性，其靈活性體現(xiàn)在當(dāng)代謝發(fā)生變化時(shí)，可以通過肌纖維的轉(zhuǎn)化來(lái)滿足能量需求的變化，因此在代謝疾病方面，肌肉的靈活性在疾病初期具有重要作用[36]。短期飼喂高脂飼料，小鼠出現(xiàn)促進(jìn)氧化性纖維表達(dá)以緩解高脂飲食帶來(lái)的能量負(fù)荷的適應(yīng)性變化[37]。糖尿病患者骨骼肌的形態(tài)與肌纖維類型會(huì)發(fā)生改變，疾病狀態(tài)下導(dǎo)致氧化磷酸化障礙和更高的快肌纖維含量[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢肌纖維表達(dá)增加，促進(jìn)脂質(zhì)的消耗，這種適應(yīng)性變化可能有利于糖尿病早期的改善[28]。

此外，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族成員MEF2C與PGC-1α在慢肌纖維的表達(dá)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[39]。PGC-1α是調(diào)控能量生成的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以與MEF2相互作用，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)跑步訓(xùn)練后的大鼠PGC-1α和MEF2的表達(dá)顯著增高并伴隨慢肌纖維的表達(dá)增加[40]。因此，Glut4基因突變后機(jī)體可能通過PGC-1α與MEF2促進(jìn)肌纖維的轉(zhuǎn)化，增加脂質(zhì)的有氧氧化過程，以此適應(yīng)葡萄糖的攝取不足。

4 結(jié) 論

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得單堿基突變的Glut4Q177L突變鼠，造成骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖攝取障礙。研究發(fā)現(xiàn)，突變鼠通過增加皮下脂肪的分解以及慢肌纖維的生成，提高脂肪酸利用和氧化效率來(lái)適應(yīng)葡萄糖供應(yīng)不足。Glut4Q177L突變鼠作為骨骼肌和脂肪組織Glut4功能障礙的胰島素抵抗模型，解析其適應(yīng)胰島素抵抗及促進(jìn)脂質(zhì)利用的潛在機(jī)制有助于為2型糖尿病的治療提供參考。同時(shí)，突變鼠的脂肪含量減少與慢肌纖維增多符合畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中降低皮下脂肪含量和改善肉質(zhì)的發(fā)展需求，因此本試驗(yàn)結(jié)果也為分子育種提供了新的思路。