劉 宇，鄔建飛，李 恒，荊 天，盧建遠，字向東

(西南民族大學 動物科學國家民委重點實驗室，成都 610041)

Clark等[1]1994年從小鼠MA-10間質瘤細胞中首次發(fā)現(xiàn)類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)，并成功地完成了其純化、前體cDNA的克隆和測序，證明了StAR蛋白對類固醇生物合成有重要調控作用。StAR存在于線粒體中，促進膽固醇由線粒體外膜向內膜轉運，膽固醇的這種轉運是類固醇合成的限速步驟，膽固醇進入內膜后再被CYP11A1基因編碼的細胞色素 P450 支鏈裂解酶(P450 scc)催化生成孕烯醇酮[2]。孕烯醇酮作為類固醇激素的合成前體，其離開線粒體后，在不同組織中經(jīng)過一系列的變化能夠合成孕酮、睪酮、雌激素、醛固酮等類固醇激素。StAR基因在腎上腺皮質、睪丸間質細胞、卵巢顆粒細胞和膜細胞以及胎盤合體滋養(yǎng)細胞均有表達[3]。StAR基因的突變會導致先天性類脂腎上腺增生，患者腎上腺增大，大量的膽固醇無法轉化為孕烯醇酮[4-5]。StAR蛋白的表達水平強烈影響睪丸間質細胞的睪酮生成，而且隨著間質細胞老化，StAR蛋白的表達也會減少，衰老間質細胞線粒體內膜的膽固醇供應隨之減少[6-7]。卵巢合成的類固醇激素是維持雌性第二性特征和生殖能力所必需的，有研究發(fā)現(xiàn)，StAR基因敲除小鼠的卵巢在出生時沒有受到影響，但隨著小鼠進入青春期，卵巢中的脂質繼續(xù)積累，導致雌激素水平低，出現(xiàn)乳房發(fā)育不良和陰道出血等癥狀[8]。StAR基因在腔前卵泡數(shù)多的胎牛卵巢中的表達量要顯著高于腔前卵泡數(shù)少的卵巢[9]，黔北麻羊卵巢中StAR基因在高繁殖力組的表達量顯著高于低繁殖力組[10]，并且StAR基因在不同繁殖力品種的山羊卵巢中表達差異極顯著[11]。目前，在豬[12]、牛[13]、斑馬魚[14]、綿羊[15]和禽[16]等動物上的研究證明，StAR基因可能與性腺的發(fā)育和繁殖性狀密切相關。

牦牛(Bosgrunniens)主要生活在海拔2 500～5 500 m的青藏高原，能適應高原的極端惡劣氣候條件，是青藏高原不可替代的主導畜種[17]。但是，與黃牛相比，牦牛繁殖性能低，屬于季節(jié)性發(fā)情動物，主要集中在每年的6～10月發(fā)情，黃牛則是四季發(fā)情動物，其繁殖力遠遠高于牦牛[18]。StAR基因可能與動物繁殖力密切相關，但目前未見牦牛StAR基因研究的報道。因此，本試驗擬通過克隆牦牛StAR基因并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR技術對StAR基因在不同組織、不同生長階段和不同發(fā)情周期的卵巢、顆粒細胞中的表達特性進行研究，為進一步研究StAR基因在牦牛繁殖中的調控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

本次試驗的樣品均采自四川省成都市青白江唐家寺屠宰場，牦牛是來自于阿壩州牧區(qū)的麥洼牦牛。電擊放血屠宰后，立即采樣。樣品包括：1)5頭5～6歲 健康母牦牛心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管組織；2)牦牛胎牛、1歲齡左右和2歲齡左右黃體期卵巢各3頭；3)5～6歲卵泡期和黃體期牦牛的卵巢各3頭；4)3頭5～6歲黃體期黃牛的卵巢；5)牦 牛顆粒細胞為本實驗室前期凍存的細胞。使用滅菌后的剪刀采集組織，并用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，迅速放入液氮罐中，帶回實驗室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol Reagent和瓊脂糖購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、2×Taq PCR Master mix和PowerUpTMSYBRTMGreen均購自Thermo Scientific公司；DNA Marker DL2000購自GenStAR公司；E.coliDH5α感受態(tài)細胞和膠回收試劑盒購自成都擎科梓熙生物技術有限公司；克隆載體pMD19-T和氨芐青霉素購自寶生生物工程(大連)有限公司。

PCR儀(ETC811)購自蘇州東盛興業(yè)科學儀器有限公司；熒光定量PCR儀(CFX96)購自美國Bio Rad公司；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)購自Invitrogen公司。

1.3 RNA提取和cDNA合成

按RNA提取試劑盒的步驟提取RNA。使用紫外分光光度計檢測RNA的質量，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照反轉錄試劑盒說明書對RNA進行反轉錄，合成的cDNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 StAR基因引物設計合成

由于未見牦牛StAR基因序列報道，所以根據(jù)NCBI中黃牛(Bostaurus)的StAR基因序列(NM_174189.3)和GAPDH基因序列(NM_001034034.2)，使用Primer Premier 5.0軟件設計克隆引物以及內參基因GAPDH熒光定量引物；再根據(jù)克隆獲得的序列設計StAR基因的熒光定量引物(表1)。引物均由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 PCR和熒光定量PCR引物序列

1.5 牦牛StAR基因克隆與測序

采用卵巢合成的cDNA為模板進行PCR擴增，克隆StAR基因。PCR擴增體系25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共37個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照膠回收試劑盒說明書將膠回收和純化。然后將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接并在16 ℃過夜，后轉化DH5α感受態(tài)細胞，均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(AMP+)上，挑取經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h過后呈白色的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(AMP+)中搖床6 h。菌液進行PCR鑒定，將鑒定結果呈陽性的樣品菌液裝袋送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.6 StAR基因生物信息學分析

牦牛StAR基因生物學分析工具及功能參見表2。

表2 生物信息學分析工具及相關功能

1.7 牦牛StAR基因表達特性分析

根據(jù)克隆獲得的StAR基因設計的引物(表1)，使用qPCR方法檢測StAR基因在各個組織(心、肝、脾、肺、腎、卵巢、輸卵管、子宮)及顆粒細胞中的表達水平。顆粒細胞由實驗室前期冷凍保存，將其復蘇并參考洪磊等[20]的方法進行體外培養(yǎng)(invitroculture，IVC)，分別收集不同時期(0、12、24、36、48、60 h)的顆粒細胞。每個樣品重復3次，用GAPDH作為內參基因校正基因的相對表達水平。qPCR反應體系15 μL：PowerUpTMSYBRTMGreen MasterMix 7.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s，39個循環(huán)；讀取熔解曲線。

1.8 統(tǒng)計分析

本試驗用2-△△Ct法計算基因相對表達量，使用SPSS 21.0軟件的獨立樣本t檢驗和單因素方差分析法進行顯著性檢驗，當P<0.05時，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 牦牛StAR基因克隆

以卵巢cDNA為模板，PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了與預期目的產(chǎn)物大小相符的片段(圖1)，表明本試驗成功的擴增了牦牛StAR基因。測序得到StAR基因長度為1 156 bp，其中CDS長度為858 bp，共編碼285個氨基酸。序列提交至NCBI，獲得登錄號：MW495047。

M.DNA相對分子質量標準; 1～3.StAR引物PCR擴增產(chǎn)物

2.2 牦牛StAR基因生物信息學分析

2.2.1 牦牛StAR基因核苷酸序列分析 使用DNAMAN 6.0軟件將測定序列的CDS與黃牛StAR基因的CDS進行比較，發(fā)現(xiàn)了8個堿基突變，其中有3個導致了氨基酸的改變(表3)。牦牛與黃牛的StAR基因CDS同源性為99.07%。

表3 牦牛與黃牛StAR基因編碼區(qū)序列差異

2.2.2StAR基因編碼氨基酸序列同源性分析 使用DNAMAN 6.0軟件對不同物種StAR蛋白氨基酸序列進行比對，結果顯示，牦牛與黃牛(NP_776614.2)、綿羊(NP_001009243.1)、人(NP_000340.2)、豬(NP_998920.2)、原雞(NP_990017.1)、斑馬魚(NP_571738.1)的StAR氨基酸序列相似性分別為98.95%、96.84%、87.37%、90.18%、65.96%、58.54%，說明StAR基因在進化過程中有較高的保守性(圖2)。

黑色.同源性=100%；粉色.同源性>75%；藍色.同源性>50%；白色.同源性<50%

2.2.3 牦牛StAR蛋白理化性質分析 使用ExPASy-ProtParam在線工具對牦牛的StAR蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白分子式為C1398H2283N409O407S16，分子質量為31 845.96 u；StAR蛋白的氨基酸組成中亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)所占比例較高,分別為11.9%、8.4%、8.1%；帶正電荷的(Arg+Lys)氨基酸總數(shù)為38，帶負電荷的(Asp+Glu)的氨基酸總數(shù)為32，說明牦牛StAR蛋白帶正電荷；理論等電點為9，表明StAR蛋白是堿性蛋白；在哺乳動物的紅細胞中半衰期為30 h；脂肪族系數(shù)為93.75；平均親水系數(shù)為-0.288，不穩(wěn)定系數(shù)為39.99，表明StAR蛋白屬于親水穩(wěn)定蛋白。

根據(jù)TMHMM2.0在線工具分析發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白沒有跨膜結構；使用Signal P 5.0 預測，結果表明,StAR蛋白不存在信號肽；使用PSORTII在線工具分析發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白主要存在于細胞質(47.8%)，也存在于線粒體(30.4%)、細胞核(13%)、細胞骨架(4.3%)、內質網(wǎng)(4.3%)。使用Net Phos 3.1在線工具分析，發(fā)現(xiàn)牦牛StAR蛋白有22個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點12個、蘇氨酸(Thr)磷酸化位點6個、酪氨酸(Tyr)磷酸化位點4個。

2.2.4 StAR蛋白二、三級結構預測 使用SOPMA在線工具預測StAR蛋白二級結構，結果顯示，α-螺旋占比為39.3%、延伸鏈占比為17.54%、β-轉角占比為4.21%、無規(guī)則卷曲占比為38.95%(圖3)。

h.α-螺旋；e.延伸鏈；t.β-轉角；c.無規(guī)卷曲

使用SWISS-MODEL在線工具預測StAR蛋白三級結構，預測結果與二級結構預測結果基本一致(圖4)。

圖4 牦牛StAR蛋白三級結構預測

2.2.5 蛋白相互作用分析 根據(jù)STRING11.0在線工具分析發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白可能與電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage dependent anion channel protein 1, VDAC1)、VDAC2、VDAC3、FIGLA、NR5A1、HSD17B6、POMC等蛋白有相互作用(圖5)。

圖5 StAR蛋白網(wǎng)絡互作分析圖

2.2.6 牦牛StAR基因系統(tǒng)進化樹分析 從NCBI下載黃牛(NM_174189.3)、綿羊(NM_001009243.1)、山羊(XM_013975437.2)、小鼠(NM_011485.5)、大鼠(NM_031558.3)、豬(NM_213755.2)、馬(NM_001081800.3)、狗(NM_001097542.1)、人(NM_000349.3)、斑馬魚(NM_131663.1)、原雞(NM_204686.2)和黑猩猩(XM_001170375.5)12個物種的StAR基因序列。利用Mega 6.0 構建基因進化樹，發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛首先聚為一類，其次與綿羊、山羊聚為一類，與斑馬魚親緣關系最遠，進化比較保守，且符合物種進化規(guī)律(圖6)。

圖6 StAR基因系統(tǒng)進化樹

2.3 牦牛StAR基因表達差異分析

2.3.1 牦牛StAR基因在各個組織中的表達差異分析 使用qPCR檢測StAR基因在心、肝、脾、肺、腎、卵巢、輸卵管、子宮組織中的表達水平，結果顯示，StAR基因在卵巢中高表達，極顯著高于其他組織(P<0.01)，在其他組織中表達均較低(圖7)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3.2StAR基因在卵巢的表達分析 使用qPCR檢測StAR基因在胎牛、1歲左右、2歲左右(黃體期)牦牛卵巢的表達情況，結果顯示，隨著年齡的增大，StAR基因在卵巢中的相對表達量逐漸增加，各個時期之間差異極顯著(P<0.01，圖8A)。StAR基因在黃體期卵巢的表達要極顯著高于卵泡期(P<0.01，圖8B)，在黃牛黃體期卵巢的表達要極顯著高于在牦牛黃體期卵巢的表達(P<0.01，圖8C)。

圖8 卵巢StAR基因的相對表達水平

2.3.3StAR基因在顆粒細胞中的時序表達分析 利用qPCR檢測StAR基因在體外培養(yǎng)顆粒細胞不同階段的相對表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，StAR基因的相對表達水平呈先上升后下降的趨勢，在24 h達到最高，極顯著高于其他時間段(P<0.01，圖9)。

圖9 StAR基因在顆粒細胞不同時序的相對表達水平

3 討 論

StAR是類固醇生物合成的限速步驟，StAR蛋白在腎上腺、卵巢、睪丸、胎盤、腦的類固醇生成細胞中合成，影響一系列發(fā)育和生理過程，特別是在繁殖相關性狀中具有重要的調控作用[4, 21-23]。StAR基因敲除鼠在卵巢上會出現(xiàn)脂質沉積聚集、基質細胞黃素化和卵泡的不完全成熟，最終導致卵巢早衰[8]。這些研究說明StAR基因在繁殖性狀上有重要的作用。

為了探究牦牛StAR基因與繁殖性狀的相關性及與黃牛StAR基因的差異性，本試驗克隆了牦牛StAR基因，并獲得了其完整的CDS，發(fā)現(xiàn)CDS全長858 bp，編碼285個氨基酸。本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛StAR蛋白共有22個磷酸化位點，早期的研究也表明，倉鼠StAR是一種磷酸化蛋白[24]。Artemenko等[25]還發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白存在多種形式，StAR首先被合成為一個37 ku的前體，它被蛋白激酶A磷酸化，并在線粒體內被切割成30 ku大小的蛋白，并且磷酸化后的蛋白提供了主要的膽固醇轉運機制。本研究發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白主要存在于細胞質(47.8%)和線粒體(30.4%)，這與Bose等[26]發(fā)現(xiàn)的StAR蛋白具有從線粒體外膜向內膜轉運膽固醇的功能相符合。牦牛StAR蛋白氨基酸同源性比對和基因進化樹分析結果顯示，StAR基因與黃牛、綿羊、山羊具有較高的同源性，在進化上是比較保守的。Bauer等[27]對魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物StAR的氨基酸序列進行了比較，也發(fā)現(xiàn)這種蛋白質在不同的脊椎動物群體中具有很強的保守性，與本研究結果一致。StAR基因的突變會導致類固醇缺乏癥，影響睪丸和卵巢功能[5,8,23]。本研究發(fā)現(xiàn)。牦牛StAR基因的編碼區(qū)與黃牛相比有8個堿基突變，其中有3個導致了氨基酸的改變，這種差異是否影響到牦牛StAR蛋白的功能，從而影響牦牛的繁殖性能需要進一步研究。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在三級結構當中StAR蛋白存在一個StART結構域，在本研究結果的三級結構圖中也能明顯看到了該結構域，該結構是α/β類型的，含有1個九鏈反平行的β片層和4個α-螺旋，形成的長疏水通道可以結合1個膽固醇分子[28-29]。

根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡圖顯示，StAR蛋白可能與VDAC1、VDAC2、VDAC3、FIGLA、NR5A1、HSD17B6、POMC等蛋白相互作用。VDAC是線粒體孔道蛋白，參與代謝物/離子的跨膜轉運和許多細胞過程[30]。Bose等[31]發(fā)現(xiàn)，在腎上腺細胞中磷酸化的StAR與線粒體外膜上的電壓依賴陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC1)相互作用，從而促進了37 ku磷酸化StAR到32 ku中間體的加工。生殖細胞因子(factor in the germline alpha, FIGLA)是一種在生殖細胞中特異表達的轉錄因子，可以調控卵泡發(fā)育和編碼透明帶的相關基因，F(xiàn)IGLA基因的缺失明顯阻礙了減數(shù)分裂的進展，并最終導致卵母細胞凋亡，另外干擾睪丸細胞中的FIGLA基因后，會上調StAR基因的表達[32-34]。核受體亞家族5組A成員1(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1,NR5A1)基因編碼的類固醇生成因子1(steroidogenic factor 1，SF-1)是一種轉錄激活劑，在調節(jié)正常生殖生理和內分泌功能上具有重要作用,控制腎上腺和性腺發(fā)育[35]。Sandhoff等[36]發(fā)現(xiàn)，大鼠StAR基因的啟動子區(qū)域存在一個SF-1結合位點，對StAR基因的轉錄是至關重要。17β羥基類固醇脫氫酶6型(hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 6,HSD17B6)基因編碼的蛋白質既具有氧化還原酶活性，又具有表異構酶活性，參與雄激素分解代謝，有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠間質細胞在化療藥物的作用下會促進StAR基因的轉錄，抑制HSD17B6的轉錄，并伴隨睪酮水平降低[37-38]。阿片黑素促皮質激素原(pro-opiomelanocortin,POMC)基因編碼一種前原蛋白，可以產(chǎn)生多達10種的生物活性肽，促腎上腺皮質激素(ACTH)是其中一種，有研究發(fā)現(xiàn)，ACTH可以通過cAMP/PKA途徑調控類固醇合成，促進StAR基因的表達[39]。從蛋白互作網(wǎng)絡的分析結果可以發(fā)現(xiàn)，與StAR蛋白存在相互作用的蛋白主要參與類固醇激素合成和性腺發(fā)育的調控，猜測StAR基因與繁殖相關性狀有很強的關聯(lián)性。

對多個物種的研究表明，動物StAR基因的正常表達與繁殖性能密切相關[12-16]。本試驗采用qPCR檢測StAR基因的組織表達情況，發(fā)現(xiàn)StAR基因在牦牛的卵巢中表達量最高，有研究也發(fā)現(xiàn)，StAR基因主要在雌性動物的卵巢中表達，比如豬[12]、雞[40]、斑馬魚[14]、鱸魚[41]等。這些研究結果與StAR蛋白的功能及卵巢是類固醇激素主要來源的內分泌特性相吻合。牦牛StAR基因在脾、肺、輸卵管、子宮有極其微量的表達，而在其他組織中不表達，但是劉倩等[42]在中華鱉中發(fā)現(xiàn)，StAR基因在脾臟和心臟中高表達，歐陽宏佳等[16]在水禽中檢測到StAR基因在胸肌和腿肌中表達，說明該基因的表達具有一定的種屬特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，StAR基因在2歲左右牦牛卵巢表達最高，極顯著高于胎牛和1歲左右的牦牛。歐陽宏佳等[16]發(fā)現(xiàn)，鵝睪丸中StAR基因的表達量在3歲時極顯著高于52和1日齡，并且Michalovic等[43]發(fā)現(xiàn)，奶牛卵巢顆粒細胞中StAR基因的表達量在成年時極顯著高于初情期前，說明隨著年齡的增長，性腺逐漸發(fā)育完全其功能逐漸完善，睪丸與卵巢合成與分泌類固醇激素的能力也增強。StAR基因在牦牛黃體期的表達量極顯著高于卵泡期，Jahromi等[44]在大鼠中也發(fā)現(xiàn)，StAR基因在發(fā)情間期(黃體期)的表達水平極顯著高于其他時期，說明黃體期卵巢孕酮等類固醇激素的合成分泌增加與StAR基因的高表達有關。本研究發(fā)現(xiàn)，在黃牛卵巢黃體期StAR基因的表達量極顯著高于牦牛。Prakash等[45]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情周期的8～12天(黃體期)黃牛的血漿孕酮水平顯著高于牦牛，而毛寧等[46]發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)香豬組卵巢StAR基因表達量顯著高于低產(chǎn)組，楊沛方等[10]報道，山羊在高繁殖力組卵巢中StAR基因的表達量顯著高于低繁殖力組，推測StAR基因在牦牛和黃牛卵巢表達的差異性可能是導致兩物種繁殖力差異的重要原因之一。StAR基因在牦牛顆粒細胞IVC過程中的相對表達水平呈先上升后下降的趨勢，在培養(yǎng)24 h表達量最高(圖9)，這與牦牛卵母細胞體外培養(yǎng)18～24 h時達到成熟的結果一致[47-49]，說明顆粒細胞StAR基因的表達與卵母細胞成熟有一定的相關性，對卵母細胞成熟具有重要的作用。

4 結 論

本研究克隆得到牦牛StAR基因CDS全長858 bp，編碼285個氨基酸，主要在線粒體膜上發(fā)揮作用，在進化中和物種間比較保守。牦牛StAR基因主要在卵巢中表達，而且黃體期表達高于卵泡期，并且在體外顆粒細胞培養(yǎng)至24 h表達水平最高。提示，StAR基因可能在牦牛卵巢周期中參與繁殖調控。