李 雄，田念念，宋林錦，陳 晨，許厚強(qiáng)*

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

表觀遺傳調(diào)控多發(fā)生在相互作用水平上，在該水平上的研究可深入了解表觀遺傳學(xué)對生物學(xué)過程的促進(jìn)作用。大量研究表明，表觀遺傳學(xué)是指基因的核苷酸序列不發(fā)生改變，而基因功能發(fā)生穩(wěn)定的、可遺傳的變化，主要包括非編碼RNA調(diào)控[1]、DNA甲基化[2]、染色質(zhì)重塑[3]、組蛋白修飾[4]等。DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)將甲基催化轉(zhuǎn)移到基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性等發(fā)生變化，從而控制基因表達(dá)[5]。對DNA甲基化研究主要集中于主動甲基化和去甲基化方面，DNA高甲基化能夠減弱或者沉默基因的表達(dá)，而去甲基化時則能使基因活化或重新表達(dá)[6]。5-Aza-dC是目前用得較多的去甲基化方法之一，其對研究DNA甲基化對表觀遺傳的影響及特異性基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)理有著重要的作用。5-Aza-dC是一種胞唾陡類似物，常用名為地西他濱甲基化酶抑制劑，是目前已知的較為有效的一種去甲基化制劑[7]。5-Aza-dC大多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)方面，如Greville等[8]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC處理后，從化療敏感/非轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中分泌的n-聚糖的分支和唾液化增加。這些變化與卵巢癌細(xì)胞系中MGAT5和ST3GAL4轉(zhuǎn)錄本mRNA表達(dá)水平升高有關(guān)。Xie等[9]研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC能有效抑制DNMTs的表達(dá)和活性，逆轉(zhuǎn)MnSOD和GSTT1的表達(dá)。所以，通過藥物、試劑等對相關(guān)基因去甲基化探究其表達(dá)影響，也是從側(cè)面研究甲基化機(jī)制的一種方法。

近年來，大量研究表明，DNA甲基化所引起的表觀遺傳對于動物的生長發(fā)育有重要影響，并篩選與生長相關(guān)的甲基化位點作為分子標(biāo)記[10]。肌肉組織是動物機(jī)體的重要組成部分，而DNA甲基化也能調(diào)控肌肉的發(fā)育過程[11]。Li等[12]研究了3個品種豬不同部位骨骼肌，發(fā)現(xiàn)品種間、性別間存在DNA甲基化的相似性和特異性，并鑒定了差異甲基化區(qū)域。李秀金等[13]通過對五指山和長白豬DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析證實，DNA去甲基化酶Tet1在豬胚胎成肌細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中通過Myogenin啟動子去甲基化，上調(diào)Myogenin表達(dá)，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。萬火福等[14]用比色法測定不同品種肌肉組織DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平在不同品種及不同組織中會呈現(xiàn)一種動態(tài)變化，且高水平的DNA甲基化可能促進(jìn)霞煙雞腿肌組織的發(fā)育。綜上表明，不同畜禽肌肉發(fā)育過程中的甲基化模式具有一定特異性，不同家畜中甲基化狀態(tài)會產(chǎn)生特定變化，這種甲基化狀態(tài)變化能夠通過調(diào)控不同階段相關(guān)基因的表達(dá)，從而保證肌肉發(fā)育正常進(jìn)行。

動物肌肉發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，動物體內(nèi)相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)也呈現(xiàn)出動態(tài)變化趨勢[15]。肌分化因子(myogenic differentiation 1，MyoD1)是一種骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠識別、啟動骨骼肌特異基因的轉(zhuǎn)錄，具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和其他非骨骼肌細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞的能力[16]。近年來，MyoD1甲基化在豬[17]、羊[18]、雞[19]等家畜上主要通過對肌肉進(jìn)行全基因組甲基化檢測其甲基化水平；沈蘭等[20]發(fā)現(xiàn)，MyoD1的甲基化譜可能有助于預(yù)測接受標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)放射治療的浸潤性宮頸癌患者的反應(yīng)。目前，MyoD1甲基化對牛骨骼肌細(xì)胞發(fā)育影響的研究報道較少。本試驗以關(guān)嶺牛為研究對象，利用甲基化酶抑制劑(5-Aza-dC)處理牛成肌細(xì)胞，研究MyoD1啟動子區(qū)甲基化水平及其對成肌細(xì)胞生長發(fā)育和增殖的影響，為關(guān)嶺牛的改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛成肌細(xì)胞來源于貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物種質(zhì)資源庫。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol 試劑購于Gibco公司；5-Aza-dC(5-氮雜-2′-脫氧胞苷)、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購自美國Sigma公司；2×Es Taq Master Mix、DM 2000 Marker、丙三醇、無水乙醇、DEPC 水購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR-Green染料(SYBR Green PCR Master Mix)購自Bio-Rad公司；二甲基亞砜購于Hyclone 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和CCK8試劑盒購自MCE公司；一抗(Desmin)購自鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二抗購自Jackson immuno research。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇及鑒定 取出凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中。置于CO2培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件5% CO2、飽和濕度、37 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)，讓其長到對數(shù)生長期。將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待其生長至85%左右，進(jìn)行細(xì)胞鑒定；試驗參考間接免疫熒光(indirect immunofluorescence，IIF)的方法執(zhí)行。

1.3.2 CCK8檢測不同濃度5-Aza-dC對成肌細(xì)胞增殖凋亡的影響 細(xì)胞復(fù)蘇后，當(dāng)細(xì)胞長到85%以上進(jìn)行分瓶，當(dāng)關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化約4 min，并進(jìn)行計數(shù)，以每孔5×103個接種于96孔板內(nèi)(每孔加入100 μL)。置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h；12 h后加入添加了不同濃度5-Aza-dC的培養(yǎng)基，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3 μmol·L-1以及空白組(0 μmol·L-1)，每組設(shè)3個 重復(fù)，分別處理0、24和48 h。在每個孔內(nèi)加入10 μL CKK-8試劑，酶標(biāo)儀(450 nm)檢測吸光密度(OD)；確定在本實驗室條件下對細(xì)胞生長影響最小的5-Aza-dC最適濃度，并以此濃度進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，標(biāo)記處理組和空白組置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，用含有5-Aza-dC的DMEM/F12(“1.3.2”獲得5-Aza-dC最適濃度)培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)48 h，用3 mL PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞；加入1 mL 0.25%不含EDTA 的胰酶消化；將細(xì)胞輕輕重懸于所保留的培養(yǎng)基中，密度大約為1×106個·mL-1，1 000 r·min-1離心6 min，棄去上清液，PBS洗滌2次，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4 ℃，3 h；離心棄去固定液，3.5 mL PBS重懸5 min；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管內(nèi)，加入2 μL PI，5 μL Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min；室溫1 000 r·min-1離心5 min，去除上清；將細(xì)胞用0.5 mL Propidium Iodide預(yù)冷緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

5-Aza-dC處理細(xì)胞48 h后，用預(yù)冷PBS洗2次，加入1 mL 0.25%不含EDTA的胰酶消化，1 300 r·min-1離心6 min，獲取細(xì)胞沉淀，棄上清，重懸細(xì)胞，迅速打入3.5 mL 70%預(yù)冷的乙醇中，吹打均勻，4 ℃儲存過夜；離心乙醇固定過的細(xì)胞，棄上清；洗滌細(xì)胞3次以去除殘留的乙醇；加入100 μL RNase A重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min，加入500 μL PI染色液，4 ℃避光反應(yīng)30 min；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 qRT-PCR檢測MyoD1、DNMT1及相關(guān)基因mRNA表達(dá)

1.6.1 RNA提取及第一條cDNA的合成 5-Aza-dC處理細(xì)胞48 h后，處理組和空白組的細(xì)胞用Trizol提取總RNA。將RNA定量至2 ng，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI公布的牛MyoD1(NM_001040478.2)、DNMT1(NM_182651.2)、Caspase-9(NM_001205504.2)、Bax(NM_173894.1)、Bcl(CX950904.1)、CyclinA2(NM_001075123.1)、CyclinB1(BC116011.1)、CyclinD(XM_024991034.1)以及內(nèi)參基因GAPDH(NM_001034034.2)。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行定量引物設(shè)計，最后由重慶擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6.3 qRT-PCR 檢測MyoD1、DNMT1及相關(guān)基因表達(dá) 以處理組和空白組cDNA為模板分別擴(kuò)增MyoD1以及相關(guān)基因，采用SYBR Green 熒光染料法在實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量反應(yīng)。根據(jù)伯樂公司Bio-rad iTaq Univer SYBR(1725121)熒光定量qPCR mix試劑盒制作上機(jī) PCR 混池，混池體系為10 μL：ULtraSYBR Mixture(High ROX)5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板0.7 μL，ddH2O 2.3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s；58 ℃ 30 s，40 個循環(huán)后，進(jìn)行熔解曲線分析；以每5 s 上升0.5 ℃的速率從65 ℃升高到95 ℃，熒光信號在循環(huán)結(jié)束時檢測，每個樣品做3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.7 高通量檢測MyoD1啟動子區(qū)甲基化

依據(jù)原始提供的牛MyoD1啟動子區(qū)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(表2)，選取檢測位置區(qū)域(NC_037342.1)將樣品送往重慶擎科生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

表2 甲基化測序引物序列

1.8 統(tǒng)計分析

運用Excel 2010軟件對各組織中目的基因和內(nèi)參基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行處理，運用2-ΔΔCt法計算。采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(SPSS 21.0)，多重比較采用Duncan’s多重極差檢驗法，運用Graphpad6 作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 間接免疫熒光細(xì)胞鑒定

如圖1所示，Desmin抗體發(fā)生特異性結(jié)合，呈陽性反應(yīng)顯紅色，細(xì)胞核在DAPI的染色下呈藍(lán)色，Merge后能完全重合，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為成肌細(xì)胞。

A.DAPI核染；B.Desmin染色；C.合圖Merge；D.DAPI核染對照；E.不加Desmin一抗對照染色

2.2 CCK8檢測不同濃度5-Aza-dC對成肌細(xì)胞增殖的影響

本試驗在成肌細(xì)胞中添加不同濃度的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC后，用CCK8檢測0、24、48 h成肌細(xì)胞增殖情況。表3可以看出，與對照組相比，成肌細(xì)胞中添加0.05或0.1 μmol·L-15-Aza-dC時細(xì)胞存活率呈上升趨勢，但是隨著濃度增加細(xì)胞存活率逐漸下降，其中0.3 μmol·L-15-Aza-dC濃度下細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01)；處理24 h后，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理細(xì)胞的存活率呈顯著上升(P<0.05)，在0.1 μmol·L-1存活率最高。處理48 h后，細(xì)胞存活趨勢與24 h相同，但是同24 h相比提高不明顯。表明0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組適合用于后續(xù)試驗。

表3 不同濃度5-Aza-dC對細(xì)胞存活率的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測成肌細(xì)胞凋亡

從圖2可知，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細(xì)胞凋亡率較空白組極顯著增加(P<0.01)。為進(jìn)一步檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC是否與Bcl、Bax、Caspase-9等細(xì)胞凋亡因子有關(guān)，通過qRT-PCR檢測，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細(xì)胞能夠極顯著的降低細(xì)胞抗凋亡因子Bcl的表達(dá)(P<0.01)，極顯著的提高促凋亡因子Bax表達(dá)(P<0.01)，顯著提高促凋亡因子Caspase-9的表達(dá)(P<0.05)。

A.空白組細(xì)胞凋亡；B.試驗組細(xì)胞凋亡；C.細(xì)胞凋亡率；D.細(xì)胞凋亡因子mRNA的表達(dá)。Q1.機(jī)械性損傷細(xì)胞；Q2.晚期凋亡細(xì)胞；Q3.正常細(xì)胞；Q4.早期凋亡細(xì)胞

2.4 流式細(xì)胞儀檢測成肌細(xì)胞周期

通過流式細(xì)胞儀檢測0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細(xì)胞及空白組細(xì)胞，結(jié)果顯示(圖3)，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組G0/G1期細(xì)胞比例較高于空白組，但差異不顯著(P>0.05)，S期及G2/M期細(xì)胞低于空白組，差異也不顯著(P>0.05)。為進(jìn)一步檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC對細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinB1、CyclinA2、CyclinD 表達(dá)的影響，通過qRT-PCR檢測相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC顯著的提高了周期因子CyclinA2的表達(dá)(P<0.05)，對細(xì)胞因子CyclinB1、CyclinD的表達(dá)影響不顯著(P>0.05)。

A.空白組細(xì)胞周期；B.試驗組細(xì)胞周期；C.細(xì)胞周期不同時期比例；D 細(xì)胞周期因子mRNA的表達(dá)

2.5 qRT-PCR 檢測MyoD1、DNMT1 mRNA相對表達(dá)量

2.5.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖4可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，沒有拖帶和二聚體，片段大小符合試驗預(yù)期。

A.關(guān)嶺牛MyoD1基因熒光引物電泳圖；B.關(guān)嶺牛DNMT1基因熒光引物電泳圖。M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.5.2 Real-time PCR 檢測結(jié)果擴(kuò)增曲線和峰圖 由圖5、圖6、圖7可知設(shè)計的引物通過實時熒光定量PCR檢測，擴(kuò)增曲線拐點清晰，熔解曲線均為單峰，無雜峰，引物特異性好。

A.MyoD1擴(kuò)增曲線；B.MyoD1熔解峰

A.DNMT1擴(kuò)增曲線；B.DNMT1熔解峰

A.GAPDH擴(kuò)增曲線；B.GAPDH熔解峰

2.5.3MyoD1、DNMT1基因表達(dá)分析 由圖8可知，空白組中MyoD1的mMRNA的表達(dá)量極顯著低于試驗組的表達(dá)量(P<0.01)，DNMT1的表達(dá)量也極顯著低于試驗組(P<0.01)。

A.MyoD1相對表達(dá)量；B.DNMT1相對表達(dá)量

2.6 MyoD1啟動子區(qū)甲基化檢測

由表4可知，處理48 h后，空白組的MyoD1啟動子區(qū)CpG甲基化率為28.0%，CHG甲基化率為2.0%，CHH甲基化率為1.9%，試驗組的MyoD1啟動子區(qū)CpG甲基化率為19.8%，CHG甲基化率為1.3%，CHH甲基化率為1.8%。并且0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的試驗組極顯著的降低了MyoD1啟動子區(qū)的甲基化率(P<0.01，圖9)。

表4 5mC 位點覆蓋統(tǒng)計

圖9 MyoD1基因啟動子甲基化率

3 討 論

DNA甲基化作為一種相對穩(wěn)定的修飾狀態(tài)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，可隨DNA的復(fù)制過程遺傳給新生的子代DNA，是一種重要的表觀遺傳機(jī)制[21]。DNA甲基化通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methylthansferase，DNMT)來實現(xiàn)，并分為2類，即維持DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)和從頭甲基化酶[22-24]。隨著對DNA甲基化的繼續(xù)深入研究，發(fā)現(xiàn)一些可以抑制甲基化酶的藥物，甲基化酶抑制劑是一種嘧啶核苷類似物，可以致使多種抑癌基因重新激活恢復(fù)功能，重新發(fā)揮抗腫瘤的作用，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，因而有其廣闊的臨床應(yīng)用前景，應(yīng)用較廣泛的是甲基化抑制劑5-氮雜-2甲基脫氧胞苷(5-Aza-dC)。利用藥物手段調(diào)節(jié)DNA甲基化水平可以幫助了解基因甲基化對其的影響。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除冗余或異常細(xì)胞中起著必要的作用，在生物體進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用[25-27]。Kiianitsa等[28]發(fā)現(xiàn)，PARP1在5-Aza-dC處理的人成纖維細(xì)胞中形成共價DNA加合物并可以誘導(dǎo)凋亡，阻斷DNA復(fù)制。Shire等[29]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC恢復(fù)了SULF1陰性細(xì)胞系中SULF1 mRNA的表達(dá)，與此相關(guān)的是硫酸酯酶活性的增加和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。李瑾[30]研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC通過影響DNA甲基化水平，引起細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞發(fā)生凋亡從而具有抗腫瘤作用。

吳元等[31]用5-Aza-dc處理T24細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl2蛋白表達(dá)降低，Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)上升，但不顯著。Kiianitsa等[32]發(fā)現(xiàn)，在5-Aza-dC處理的人成纖維細(xì)胞中PARP1形成共價的DNA加合物并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而本試驗在牛成肌細(xì)胞中添加不同濃度的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC后，用CCK8檢測0、24、48 h細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組是本試驗組中最適濃度并用于后續(xù)試驗，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組能夠極顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞凋亡(P<0.01)；對細(xì)胞凋亡因子檢測表明，該濃度極顯著地降低細(xì)胞抗凋亡因子Bcl的表達(dá)(P<0.01)，極顯著地提高了促凋亡因子Bax表達(dá)(P<0.01)，顯著提高了促凋亡因子Caspase-9的表達(dá)(P<0.05)；這表明5-Aza-dC能夠極顯著促進(jìn)關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞的凋亡。同時對細(xì)胞周期的檢測發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC對細(xì)胞周期的影響差異不顯著(P>0.05)，為進(jìn)一步驗證5-Aza-dC對細(xì)胞周期的影響，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，周期因子CyclinA2表達(dá)顯著提高(P<0.05)，而細(xì)胞因子CyclinB1、CyclinD表達(dá)未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。李鳳珍[33]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度范圍的5-Aza-dC(0.005 μmol·L-1)不會顯著的影響細(xì)胞周期。李瑾[30]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1的5-Aza-dC處理人肺癌細(xì)胞A549 48 h后，人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，且細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高(P<0.05)。本試驗發(fā)現(xiàn)，使用0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理后，周期因子CyclinA2的表達(dá)顯著提高(P<0.05)，推測可能是由于5-Aza-dC濃度偏高。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期都是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施以及維持胚胎正常發(fā)育、機(jī)體健康的基本生物學(xué)現(xiàn)象[34-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是對于細(xì)胞周期影響不明顯，對于5-Aza-dC的最適濃度和時間還要進(jìn)一步驗證。

MyoD1基因在調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的生長、代謝及促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖、分化等功能上均具有的重要作用[38]。Megiorni等[39]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC處理后的DNA去甲基化能夠上調(diào)miR-378a-3p水平，提高M(jìn)yHC基因表達(dá)量。MyoD1同是重要的肌肉發(fā)育基因，通過0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，試驗組極顯著的降低MyoD1啟動子區(qū)的甲基化率(P<0.01)。而空白組中MyoD1的mRNA的表達(dá)量極顯著低于試驗組(P<0.01)，同時也發(fā)現(xiàn)，DNMT1的表達(dá)量極顯著低于試驗組(P<0.01)?？赡苡捎?-Aza-dC的作用主要是在 DNA復(fù)制過程中能夠與甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)結(jié)合形成共價復(fù)合物而達(dá)到去甲基化，能夠明顯抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性但是并不影響DNMTs表達(dá)。本研究結(jié)果提示，5-Aza-dC通過調(diào)節(jié)Caspase-9、Bcl、Bax和CyclinA2 mRNA表達(dá)水平影響牛成肌細(xì)胞的增殖和凋亡，并且低濃度水平5-Aza-dC(0.1 μmol·L-1)極顯著降低了MyoD1啟動子區(qū)甲基化水平。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC能夠通過改變Caspase-9、Bcl、Bax、CyclinA2等基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞的增殖、凋亡。檢測發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol·L-15-Aza-dC能極顯著降低MyoD1基因啟動子區(qū)甲基化水平(P<0.01)，極顯著提高其mRNA的表達(dá)量(P<0.01)。因此，低濃度水平5-Aza-dC(0.1 μmol·L-1)能有效降低成肌細(xì)胞中MyoD1啟動子區(qū)甲基化水平進(jìn)而提高M(jìn)yoD1 mRNA的表達(dá)量。所以，低濃度的5-Aza-dC能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡及調(diào)控關(guān)嶺牛MyoD1的甲基化水平來調(diào)控MyoD1的表達(dá)；同時，MyoD1啟動子甲基化可作為遺傳標(biāo)記，為后續(xù)關(guān)嶺牛的品種改良提供理論依據(jù)。