唐敏嘉，何卓琳，蒲萬霞

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730050)

氨基糖苷類藥物(aminoglycosides，AGs)是一類作用于細(xì)菌核糖體，并抑制其蛋白合成的藥物，如阿米卡星和慶大霉素等。在臨床上，AG通常與β-內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)用來治療革蘭陰性菌感染。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，AG在抗菌和促生長等方面均具有重要作用。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，氨基糖苷類藥物可以分為4,6-二取代-2-脫氧鏈胺(deoxystreptamine，DOS)、4,5-二取代-2-DOS、單取代DOS和無DOS環(huán)。隨著這類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，其耐藥性問題日益突出，耐藥機(jī)制也日益復(fù)雜。AG主要的耐藥機(jī)制：1)酶修飾/失活；2)結(jié)合位點(diǎn)的突變或修飾；3)細(xì)胞膜通透性下降；4)細(xì)胞質(zhì)外排增加。而與臨床相關(guān)最常見的耐藥機(jī)制是修飾酶使藥物失活，根據(jù)其分子機(jī)制，修飾酶又進(jìn)一步分為乙?；D(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶，它們可通過細(xì)菌特異性DNA重組系統(tǒng)及可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒在病原菌之間傳播。近幾年又發(fā)現(xiàn)了一類新的耐藥決定因子，即16S rRNA甲基化酶(16S rRNA methyltransferases，16S-RMTases)，其耐藥機(jī)制是在16S rRNA A-位點(diǎn)內(nèi)的特定核苷酸殘基上添加來自SAM的CH3基團(tuán)，甲基化的16S rRNA與某些氨基糖苷類藥物的結(jié)合親和力明顯降低，從而導(dǎo)致對氨基糖苷類藥物的耐藥性顯著提高[1]。

放線菌是自然界產(chǎn)生氨基糖苷類化合物的細(xì)菌，如鏈霉菌屬和小單孢菌。這些細(xì)菌含有內(nèi)源性16S-RMTases基因，天生對氨基糖苷類藥物具有耐藥性。雖然產(chǎn)生氨基糖苷類化合物的細(xì)菌可以通過16S-RMTases來保護(hù)自己，但之前在引起人或動物感染性疾病的病原菌中尚未發(fā)現(xiàn)這一特性[2]。然而在2003年，日本報(bào)道稱銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)獲得性16S-RMTases，使菌株能夠?qū)Π被擒疹愃幬锂a(chǎn)生廣泛且高水平耐藥性[3]。需要引起高度重視的是，NDM-1 金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)和16S-RMTases在腸桿菌中常常偶聯(lián)存在，近年來攜帶這兩種酶的病原菌在全球范圍內(nèi)迅速傳播，對人類健康造成了嚴(yán)重威脅。

本文對引起氨基糖苷類藥物耐藥的16S-RMTases進(jìn)行綜述，并著重討論其作用機(jī)制、基因環(huán)境、流行病學(xué)及與其偶聯(lián)的抗性決定簇，同時(shí)介紹了如何檢測產(chǎn)16S-RMTases陽性菌的方法。

1 內(nèi)源性16S-RMTases

20世紀(jì)80年代，研究者在部分產(chǎn)氨基糖苷類化合物的放線菌中發(fā)現(xiàn)了16S-RMTases基因。這些放線菌對氨基糖苷類化合物所表現(xiàn)出的高水平的耐藥性，可以保護(hù)它們不受自身產(chǎn)生的氨基糖苷類化合物的傷害。近年來，隨著遺傳分析技術(shù)的發(fā)展，放線菌中與氨基糖苷類化合物合成有關(guān)的基因簇得到了很大的挖掘，遺傳分析結(jié)果表明，16S-RMTases基因大部分位于放線菌氨基糖苷的生物合成基因簇中。例如，在棘孢小單孢菌ATCC 15835的慶大霉素生物合成基因簇中發(fā)現(xiàn)了16S-RMTasess基因——grmA和grmO(GenBank登錄號：AY524043.1)；同時(shí)，在鏈霉菌菌株DSM 44523T的安普霉素生物合成基因簇中又發(fā)現(xiàn)了另一個16S-RMTases基因——kamB(GenBank登錄號：AJ875019.1)。在各種微生物競爭激烈的生存環(huán)境中，合成基因和耐藥基因偶聯(lián)給放線菌帶來了一定的生存優(yōu)勢。

根據(jù)在16S rRNA的A-位點(diǎn)上修飾的核苷酸位置不同，內(nèi)源性16S-RMTases主要分為兩類：N7-G1405 16S-RMTases和N1-A1408 16S-RMTases。KgmB、GrmO和Sgm等 N7-G1405 16S-RMTases修飾了16S rRNA內(nèi)G1405核苷酸的N7位，并使菌株對4,6-二取代-2-DOS產(chǎn)生抗性，但對4,5-二取代-2-DOS、安普霉素和鏈霉素不產(chǎn)生抗性。Kmr和KamB等N1-A1408 16S-RMTases修飾了16S rRNA內(nèi)A1408核苷酸的N1位，并使菌株具有對多種氨基糖苷類藥物的廣泛耐藥性。內(nèi)源性N1-A1408 16S-RMTases目前僅在鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)，而內(nèi)源性N7-G1405 16S-RMTases在鏈霉菌屬和小單孢菌屬中均有發(fā)現(xiàn)。

2 獲得性16S-RMTases

2.1 獲得性16S-RMTases的發(fā)現(xiàn)

日本學(xué)者于1997年從唾液中分離到1株銅綠假單胞菌，該菌株對多種氨基糖苷類藥物表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)該菌株對氨基糖苷類藥物高度耐藥的是1種16S-RMTases，其后被命名為RmtA[3]。Galimand等[4]在2003年報(bào)道了1株臨床分離的肺炎克雷伯菌，該菌株對臨床上的氨基糖苷類藥物表現(xiàn)出高水平耐藥，研究發(fā)現(xiàn)，是armA造成了對氨基糖苷類藥物的耐藥。隨后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，armA可能與之前檢測到的pCTX-M3質(zhì)粒中的RMTase基因相同。armA和rmtA基因揭示了外源獲得性16S-RMTases的出現(xiàn)，這種酶使致病性革蘭陰性菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生廣泛且高水平的耐藥性。Liou等[5]詳細(xì)描述了ArmA的酶功能，并發(fā)現(xiàn)ArmA屬于N7-G1405 16S-RMTases的一員。基于氨基酸序列的相似性，RmtA也被認(rèn)為是N7-G1405 16S-RMTases的一員。

RmtB首次發(fā)現(xiàn)于日本的黏質(zhì)沙雷菌中，隨后在墨西哥的陰溝桿菌中鑒定出RmtB2(參考序列號：WP_063854854.1)，其與RmtB在41位和229位氨基酸存在差異；而美國的大腸桿菌臨床分離株鑒定到的RmtB3(參考序列號：WP_048266647.1)，與RmtB相比存在7個氨基酸差異；尼泊爾的奇異變形菌臨床分離株鑒定到的RmtB4(參考序列號：WP_032634099.1)，與RmtB相比存在6個氨基酸差異[6]。2006年，在日本的奇異變形桿菌的臨床分離株中首次發(fā)現(xiàn)了RmtC[7]。2005年，RmtD(現(xiàn)在被稱為RmtD1)首次發(fā)現(xiàn)于巴西的1株銅綠假單胞菌臨床菌株[8]。之后阿根廷報(bào)告了1株產(chǎn)氣腸桿菌臨床分離株能夠產(chǎn)RmtD2，其與RmtD相比存在9個氨基酸差異[9]。2012年，在美國的牛源共生大腸桿菌菌株中首次發(fā)現(xiàn)了RmtE[10]，隨后從中國食品動物源大腸桿菌中鑒定出RmtE2[11]，其與RmtE相比存在1個氨基酸的差異。2011年，從法國分離的肺炎克雷伯菌鑒定出RmtF[12]；2017年，尼泊爾報(bào)道的銅綠假單胞菌產(chǎn)生的RmtF2與 RmtF 相比有1個氨基酸差異[13]。2013年，巴西圣保羅州醫(yī)院從骨中分離的肺炎克雷伯菌首次鑒定出RmtG[14]。同年在美國，研究者從1名男性士兵分離到的肺炎克雷伯菌中首次鑒定出RmtH[15]。迄今為止，在病原菌中發(fā)現(xiàn)的16S-RMTases基因大多數(shù)位于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，或者是與轉(zhuǎn)座子等細(xì)菌特異性DNA重組系統(tǒng)相關(guān)(表1)。16S-RMTases的進(jìn)化樹見圖1。

圖1 N7-G1405 16S-RMTases和N1-A1408 16S-RMTases的進(jìn)化樹

表1 首次分離獲得性16S-RMTases的信息

2.2 16S-RMTases的作用機(jī)制

截至目前，報(bào)道了9種N7-G1405 16S-RMTases：ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE、RmtF、RmtG和RmtH。這些酶能使菌株對4,6-二取代-2DOS具有專一耐藥性(表2)。雖然armA、rmtB和rmtC編碼的氨基酸序列之間的相似性最高僅30%，但RmtB、RmtC和ArmA的三維結(jié)構(gòu)相似性卻很高[16]。在體外，用純化的蛋白質(zhì)探究RmtB、RmtC和ArmA的酶功能，結(jié)果證明，這些16S-RMTases可以把SAM的甲基作為輔助因子，添加到成熟的30S核糖體亞單位16S rRNA內(nèi)的G1405的N7位上，該位點(diǎn)的甲基化對4,6-二取代-2-DOS的III環(huán)3′端造成空間位阻[17]，但該酶無法將甲基轉(zhuǎn)移到裸露的16S rRNA分子或成熟的70S核糖體上，表明酶識別或修飾靶位需要16S rRNA和核糖體蛋白組成的三級結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行[18]。

N7-G1405 16S-RMTases使菌株對4,6-二取代-2-DOS耐藥，但對4,5-二取代-2-DOS或其他氨基糖苷類藥物(如鏈霉素)不能產(chǎn)生耐藥性，這一特性可以從氨基糖苷類藥物和16S rRNA之間的結(jié)合模式來解釋。G1405殘基的N7位最接近4,6-二取代-2-DOS III環(huán)中3′端，在N7位引入CH3殘基可能會導(dǎo)致與III環(huán)側(cè)鏈的空間碰撞或靜電排斥，從而降低氨基糖苷類藥物結(jié)合的親和力，導(dǎo)致對4,6-二取代-2-DOS耐藥。與此相反，4,5-二取代-2-DOS的III環(huán)和IV環(huán)通常距離G1405的N7位置較遠(yuǎn)，16S-RMTases引入CH3不會干擾它們之間的結(jié)合，因此不會對4,5-二取代-2-DOS耐藥。其他與16S rRNA結(jié)合但未與G1405位點(diǎn)發(fā)生相互作用的氨基糖苷類化合物，仍可通過N7-G1405位點(diǎn)與16S rRNA結(jié)合并表現(xiàn)出正?；钚訹19]。

表2 N7-G1405和N1-A1408 16S-RMTases氨基糖苷類藥物耐藥譜

3 16S-RMTases的基因環(huán)境

3.1 armA

從多種來源中分離得到的armA，其周圍基因都較為保守。armA位于ISCR1的下游，ISCR1之后是由dhfrA12、aadA2和sul1組成的Ι類整合子，armA的下游經(jīng)常發(fā)現(xiàn)trpA、mel和mph等耐藥基因。Galimand等[22]報(bào)道，armA兩側(cè)是IS6的兩個拷貝，定位于復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn1548中，比較容易嵌入另一個DNA靶位點(diǎn)，這對于armA的傳播意義重大，可能是armA成為最常見的16S-RMTases基因的原因。

3.2 rmtA

rmtA位于銅綠假單胞菌中1個6.2 kb的遺傳區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域的兩側(cè)各分布著1個長為262 bp的κ-γ可移動元件，該元件是也曾被發(fā)現(xiàn)存在于假單胞菌屬攜帶汞耐藥基因的復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn5041中。據(jù)此推斷，包含rmtA和兩個κ-γ元件的6.2 kb遺傳區(qū)域可能可以嵌入Tn5041中。

3.3 rmtB

幾乎所有rmtB的上游都有攜帶blaTEM-1的Tn3轉(zhuǎn)座子，而rmtB的下游區(qū)域的變異性較大，但通常與喹諾酮外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因qepA和ISCR3插入序列相關(guān)。近期研究表明，在rmtB的上游還存在IS26插入序列，該插入序列位于Tn3轉(zhuǎn)座子之前。與此同時(shí)，還在rmtB的下游區(qū)域發(fā)現(xiàn)了編碼Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和401-氨基酸轉(zhuǎn)座酶的基因，該轉(zhuǎn)座酶基因?qū)儆贗SL3超家族，這可能與rmtB的水平傳播有關(guān)[23]。

3.4 rmtC

在奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)的rmtC位于ISEcp1元件附近，該元件含有轉(zhuǎn)座酶基因tnpA，主要參與鄰近rmtC的轉(zhuǎn)移，并為其表達(dá)提供啟動子。ISEcp1元件通常與blaCTX-M和blaCMY等β-內(nèi)酰胺酶基因偶聯(lián)，有研究發(fā)現(xiàn)ISEcp1元件與腸桿菌中blaCTX-M基因的傳播有關(guān)。在幾個攜帶NDM-1的分離株中也發(fā)現(xiàn)了RmtC，所以rmtC很可能通過ISEcp1元件的轉(zhuǎn)座活性在腸桿菌中廣泛傳播[24]。

3.5 rmtD

發(fā)現(xiàn)于巴西銅綠假單胞菌[25]的rmtD下游是ISCR14元件，以及由qacEΔ1和sul1組成的3′保守片段。其上游還有orfA、ΔgroEL和另一個ISCR14元件，故rmtD與兩個同向重復(fù)的ISCR14組合。在肺炎克雷伯菌中，rmtD附近的區(qū)域與銅綠假單胞菌相同，但兩端的ISCR14都被IS26截短。發(fā)現(xiàn)于阿根廷的rmtD2與巴西的rmtD的遺傳背景相似，但rmtD2上游的ΔgroEL的5′尾大部分被切除。Tijet等[9]推測，rmtD和rmtD2的兩端是由ISCR14 組成的不同基因組裝的，而不是由同一基因共同組裝。

3.6 rmtE和rmtF

rmtE位于Ι類整合子中，定位于攜帶blaCMY-2基因的質(zhì)粒上，質(zhì)粒序列顯示，rmtE可與ISCR20-like元件結(jié)合，也可與IS1294-like插入序列結(jié)合。這些轉(zhuǎn)座元件通常與16S-RMTases等耐藥基因相關(guān)，如rmtF的兩側(cè)有ISCR5-like和ISCR14元件[9,12,26]，這一現(xiàn)象表明，這些元件在rmtE的啟動過程中可能起到一定的作用。

現(xiàn)有研究表明，rmtF位于blaNDM下游的Ι類整合子中。

3.7 rmtG 和rmtH

rmtG位于ISVsa3下游，但該序列可能是攜帶rmtG的組件的插入位點(diǎn)，而不是rmtG本身所攜帶的。有研究證明，rmtG由不同的Inc質(zhì)粒(N，A/C，B/O)攜帶，通常位于具有其他耐藥基因的轉(zhuǎn)座子中。

rmtH的側(cè)翼是兩個拷貝的ISCR2，該元件可能與rmtH的啟動有關(guān)。

3.8 npmA

npmA位于1個9.1 kb大小的遺傳區(qū)域中，其兩側(cè)是兩個拷貝的IS26，位于可轉(zhuǎn)移的IncF質(zhì)粒上，該元件可能與npmA的啟動有關(guān)。遺傳區(qū)域的兩側(cè)可能是轉(zhuǎn)座元件，該元件與數(shù)據(jù)庫中各種多重耐藥質(zhì)粒的部分序列有著很大的序列同源性。

4 16S-RMTases的流行病學(xué)

攜帶16S-RMTases基因的可移動遺傳元件已經(jīng)嵌入到各種可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中，并且擁有廣泛的質(zhì)粒宿主，例如IncN和IncA/C等。這些質(zhì)粒除了攜帶16S-RMTases基因之外，還含有多種其他耐藥基因。研究表明，腸桿菌通常能共同攜帶NDM-1 MBL和16S-RMTases(RmtB、RmtC和ArmA)[27]。目前碳青霉烯類藥物是治療革蘭陰性菌所致感染性疾病的重要藥物，而細(xì)菌通過碳青霉烯酶水解β-內(nèi)酰胺類藥物，給臨床治療帶來很大的困難。需要引起重視的是，這兩種抗性決定簇通常位于腸桿菌的同一種接合質(zhì)粒上[28]，而這些質(zhì)粒的快速轉(zhuǎn)移大大加快了多重耐藥基因的傳播。

4.1 armA

armA是最常見的16S-RMTases基因之一，廣泛分布于腸桿菌和鮑曼不動桿菌中。在腸桿菌中，它主要分布在與公共衛(wèi)生相關(guān)的病原菌中，如肺炎克雷伯菌。此外，在食源性和腹瀉疾病的相關(guān)致病菌中也有armA的相關(guān)報(bào)道，如腸沙門菌和福氏志賀菌[22]。研究人員推測，食用動物中可能存在armA的儲存庫。例如，在中國的雞源大腸桿菌和留尼旺島的雞源腸沙門菌分離株中都鑒定出armA[29]。不過，armA在食用動物中的傳播程度目前還不清楚。

在攜帶碳青霉烯酶基因blaOXA-23的鮑曼不動桿菌耐藥菌株中，經(jīng)常能鑒定出armA，但兩個基因位于不同的質(zhì)粒上[30]。2007年，美國在多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug-resistantA.baumannii，MDRA)中首次發(fā)現(xiàn)了blaOXA-23和armA的偶聯(lián)[31]。此后，中國和印度有MDRA聯(lián)合生產(chǎn)OXA-23和ArmA的少數(shù)報(bào)道，有些MDRA還可以生產(chǎn)NDM-1[32-33]。最近，希臘的一項(xiàng)研究收集了耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的相關(guān)數(shù)據(jù)，其中armA的流行率高達(dá)93.7%，且其陽性分離株絕大多數(shù)(98.5%)都攜帶blaOXA-23[34]。另一個armA流行率較高的是產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶腸桿菌，許多攜帶NDM-1或其突變體的腸桿菌對4,6-二取代-2-DOS類藥物也具有耐藥性[35]。在肺炎克雷伯菌中研究者還發(fā)現(xiàn)blaNDM和blaOXA-48-like兩個基因同時(shí)與兩個16S-RMTases 基因(其中包含armA)偶聯(lián)，并且這些基因且位于同一質(zhì)粒上[36]。在英國進(jìn)行的一項(xiàng)全國性調(diào)查顯示，16S-RMTases陽性菌大多數(shù)(93.4%)也攜帶碳青霉烯酶基因，其中以blaNDM最為常見(83.1%)[37]。對攜帶NDM的質(zhì)粒進(jìn)行分析表明，blaNDM常常與armA或其他16S-RMTases基因(特別是rmtB、rmtC和rmtF)位于同一質(zhì)粒上，而且有些質(zhì)粒還攜帶氟喹諾酮耐藥基因，例如qnrB1[38]。攜帶這些多重耐藥質(zhì)粒會同時(shí)對大多數(shù)藥物產(chǎn)生耐藥性，包括碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物，而這三類藥物對臨床治療革蘭陰性菌感染具有重要意義。

其他耐藥基因也有與armA偶聯(lián)的報(bào)道。在韓國報(bào)道了blaIMP-1和armA偶聯(lián)的銅綠假單胞菌；中國報(bào)道了blaKPC-2和armA偶聯(lián)的肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌[39]；在質(zhì)粒pCTX-M3和肺炎克雷伯菌質(zhì)粒pIP1204上鑒定出了armA和blaCTX-M-3[22]；土耳其還報(bào)道了黏質(zhì)葡萄球菌中blaOXA-48與armA的偶聯(lián)[40]；2015年，我國首次在armA陽性的分離株中同時(shí)檢出blaTEM、blaSHV和blaCTX-M-3[41]。

4.2 rmtA

rmtA在東亞(如日本和韓國)的銅綠假單胞菌中報(bào)道較多[42-43]，但最近在其他地區(qū)也有關(guān)于rmtA的相關(guān)報(bào)道。伊朗西北部在大腸桿菌中鑒定出rmtA，但流行率較低，僅為0.91%[44]；印度北部在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)陽性的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中分離出rmtA[45]；最近由我國湘雅二院收集的多重耐藥鮑曼不動菌的rmtA分離率竟達(dá)到了94.12%，而且還攜帶了其他多種耐藥基因，包括Ι類整合子和編碼碳青霉烯酶、ESBLs和其他16S-RMTases的基因[46]。Ι類整合子在耐藥基因的水平傳播中具有重要意義，多種耐藥基因與整合子偶聯(lián)使細(xì)菌能夠?qū)苟喾N臨床治療方案。如果這種“超級細(xì)菌”進(jìn)一步傳播，其后果將不堪設(shè)想。

4.3 rmtB

rmtB是繼armA之后編碼16S-RMTases最常見的基因，主要分布在東亞、歐洲、南北美洲和大洋洲的腸桿菌中[43,47-53]。攜帶rmtB的細(xì)菌不僅能從人的臨床環(huán)境中分離出來，還從可以家畜和寵物中分離出來，這表明該耐藥基因可能會在人和動物之間相互傳播[54]。在畜牧業(yè)中，rmtB似乎比armA更常見。rmtB在豬、農(nóng)場工人及其環(huán)境[54]和寵物[55]的大腸桿菌中檢出率較高。近年來國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，rmtB能夠在食品性動物中持續(xù)傳播[56]。

腸桿菌中CTX-M型ESBLs基因，特別是blaCTX-M-15，是一種全球流行的ESBLs基因，經(jīng)常與armA/rmtB同時(shí)檢出[26]。有研究表明，rmtB和blaCTX-M-15位于同一質(zhì)粒上[23]。研究者還發(fā)現(xiàn)rmtB經(jīng)常與另一CTX-M型(CTX-M-9和CTX-M-14)基因偶聯(lián)[57]。rmtB在碳青霉烯酶陽性的腸桿菌的分布尤為普遍，如中國報(bào)道了blaKPC-2和rmtB偶聯(lián)的肺炎克雷伯菌分離株[58]；安哥拉報(bào)道了rmtB和blaNDM偶聯(lián)的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌[59]。2015年，我國研究者首次從牛乳房炎大腸桿菌中分離出rmtB，且所有陽性菌株均攜帶blaTEM-1和blaCTX-M-15[60]；同年，我國還報(bào)道了一株同時(shí)攜帶rmtB、喹諾酮類耐藥基因(gyrA和parC)和多種β-內(nèi)酰胺酶基因(blaCTX-M-14、blaTEM-1和blaOXA-1)的黏質(zhì)鏈球菌[61]；最近，國內(nèi)又報(bào)道了一株耐碳青霉烯類超強(qiáng)毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae，CR-hvKP)，該菌株同時(shí)攜帶編碼碳青霉烯酶、ESBLs和16S-RMTases的基因以及喹諾酮類耐藥基因[62]。擁有這些多重耐藥質(zhì)粒的細(xì)菌會同時(shí)對大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，給臨床治療帶來極大的困難。盡管我國研究者們在越來越多的物種中檢測出16S-RMTases，但目前還缺乏全國范圍內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查，很多潛在的攜帶16S-RMTases的物種及其流行地區(qū)尚待進(jìn)一步明確。

4.4 rmtC

最初rmtC僅在日本和澳大利亞的奇異變形桿菌中檢出[7,63]。隨后在英國發(fā)現(xiàn)了13株顯著表達(dá)rmtC的腸炎沙門菌[64]，這13例腸炎沙門菌感染的患者中，4例患者存在印度旅游史。此后不久，開始出現(xiàn)rmtC與blaNDM-1偶聯(lián)的報(bào)道。在英國、印度[65]和新西蘭[66]的大腸桿菌分離株中，研究者發(fā)現(xiàn)blaNDM-1和rmtC有顯著相關(guān)性。其他致病性革蘭陰性菌中也有rmtC的相關(guān)報(bào)道，如安哥拉[59]、伊朗[44]的肺炎克雷伯菌臨床分離株和巴西的鮑曼不動桿菌[66]。

大量數(shù)據(jù)表明，rmtC已經(jīng)在多藥耐藥(multidrug-resistant，MDR)和廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)腸桿菌，尤其是在攜帶NDM型碳青霉烯酶的腸桿菌之間傳播。一項(xiàng)來自英國和愛爾蘭的全國性調(diào)查結(jié)果顯示，在大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌等多種革蘭陰性菌中檢測出rmtC，其分離率為19.2%，其中一些菌株除blaNDM之外還攜帶blaOXA-48-like[37]。

4.5 rmtD和rmtD2

rmtD和rmtD2分布于南美國家分離的銅綠假單胞菌和腸桿菌中，巴西、智利和阿根廷[9,48,68]都有rmtD和rmtD2的相關(guān)報(bào)道。而最近緬甸[69]和波蘭[70]分別報(bào)道的攜帶rmtD3的銅綠假單胞菌臨床分離株，表明rmtD開始向南美洲以外地區(qū)傳播。blaSPM-1是一種與rmtD偶聯(lián)的MBL基因[8]，這一現(xiàn)象在巴西的銅綠假單胞菌臨床分離株中得到了證實(shí)[71]。而且在來自河流的銅綠假單胞菌中也檢出了blaSPM-1和rmtD，這表明它可能可以通過環(huán)境進(jìn)行傳播[72]。與此同時(shí)，在肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了rmtD，表明該基因具有跨物種遷移的能力[9,48]。從巴西分離出的肺炎克雷伯菌中，發(fā)現(xiàn)了rmtD與blaKPC-2的偶聯(lián)[14]，與產(chǎn)NDM-1的腸桿菌不同，rmtD和blaKPC位于不同的質(zhì)粒上。研究人員對攜帶rmtD的質(zhì)粒序列進(jìn)行的分析表明，質(zhì)粒中還同時(shí)存在ESBL類(blaTEM-1、blaCTX-M-8)、修飾酶類[aac(6′)-Ⅰb、ant(3′′)-Ⅰa)]和磺胺類(sul1)耐藥基因[73]。在印度北部的大腸桿菌[74]中發(fā)現(xiàn)了rmtD與ESBL類(blaCTX-M-15)和碳青霉烯類(blaNDM、blaOXA-48)的共攜帶。最近我國研究者在禽源沙門菌中還發(fā)現(xiàn)了rmtD與ESBL類(blaCTX-M)、修飾酶類[aac(6′)-Ib-cr]和PMQR(qepA、qnrB、qnrD、oqxAB)的偶聯(lián)[75]。

4.6 rmtE和rmtF

關(guān)于rmtE(rmtE1～rmtE3)的報(bào)道非常有限，其中3例來自美國(均為大腸桿菌)[10,76-77]，1例來自中國的大腸桿菌[11]，還有最近1例來自緬甸的銅綠假單胞菌[78]。

rmtF是繼armA、rmtB、rmtC之后最流行的16S-RMTases基因。2011年，首次發(fā)現(xiàn)于法國的肺炎克雷伯菌分離株中[12]，隨后陸續(xù)在印度[65]、英國[37,65]、澳大利亞[79]、埃及[80]和愛爾蘭[37]的腸桿菌和尼泊爾[13]的銅綠假單胞菌鑒定出rmtF。rmtF與blaNDM的關(guān)系非常密切，比迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的任何其他的16S-RMTases基因都有更強(qiáng)的相關(guān)性。第一例rmtF是從blaNDM陽性的肺炎克雷伯菌分離株中發(fā)現(xiàn)的[80]，并且來自印度[65]和埃及[80]的數(shù)據(jù)顯示，blaNDM陽性菌株中rmtF的檢出率更高。此外也有rmtF與其他基因偶聯(lián)的情況，在土耳其曾報(bào)道了陰溝桿菌中rmtF和blaOXA-48的偶聯(lián)[40]。

4.7 rmtG和rmtH

最初在巴西的blaKPC-2和blaCTX-M偶聯(lián)的肺炎克雷伯菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了rmtG[14]，隨后在智利[81]、美國[14]和瑞士[82]出現(xiàn)rmtG的相關(guān)報(bào)道，均為肺炎克雷伯菌。但之后在銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣克雷伯菌臨床分離株中也報(bào)道了rmtG[83]。最近，從印度東北部[74]的大腸桿菌中鑒定出rmtG，并發(fā)現(xiàn)其與blaCTX-M-15、blaNDM、blaOXA-48偶聯(lián)。

rmtH的來源非常有限，首次分離自美國的肺炎克雷伯菌[7]。另一例也是肺炎克雷伯菌，分離自黎巴嫩的一名新生兒[84]。最近在印度東北部發(fā)現(xiàn)了rmtH與blaCTX-M-15、blaNDM、blaOXA-48偶聯(lián)的大腸桿菌[74]。

4.8 npmA

自2007年首次報(bào)道npmA以來，與armA、rmtB和rmtC等N7-G1405 MTases基因相比，很少有關(guān)于npmA的報(bào)道[44]。npmA首次分離自日本的大腸桿菌[20]，隨后在沙特阿拉伯、伊朗、印度東北部的腸桿菌中鑒定到npmA[44,74]。值得注意的是，最近在艱難梭菌中發(fā)現(xiàn)了NpmA2，與NpmA相比有1個氨基酸的差異[85]。

4.9 兩類16S-RMTases流行率比較

armA、rmtB、rmtC等N7-G1405 16S-RMTases基因廣泛存在，而有關(guān)npmAN1-A1408 16S-RMTases基因的報(bào)道卻非常有限。為了探索這一差異，一些研究人員研究了攜帶16S-RMTases的細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià)與流行率之間的關(guān)系。

在大腸桿菌中，16S-RMTases能夠修飾G1405或A1408位點(diǎn)，這兩個位點(diǎn)接近內(nèi)源性甲基化殘基C1402位(由內(nèi)源性16S-RMTases RsmI修飾)和C1407位(由內(nèi)源性16S-RMTases RsmF修飾)。G1405和A1408的甲基化可能會影響C1402和C1407位點(diǎn)的正常內(nèi)源性甲基化過程，從而降低最佳的核糖體功能。ArmA引起的G1405甲基化阻礙了C1402位點(diǎn)的甲基化，而RmtC和NpmA則阻礙C1407的甲基化[86]。不同內(nèi)源性甲基化缺陷對細(xì)胞的影響不同：C1407甲基化的缺陷不會影響細(xì)胞生長，而C1402甲基化缺陷會導(dǎo)致不同程度的生長障礙[87]。

armA已見諸于世界范圍內(nèi)的許多細(xì)菌種屬，而npmA則很少被報(bào)道，這與內(nèi)源性甲基化缺陷對生長的影響結(jié)果大相徑庭?？赡艿脑蚴莂rmA是Tn1548功能轉(zhuǎn)座子的一部分[88]，由pIP1204接合質(zhì)粒攜帶[4]，與那些β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類耐藥基因偶聯(lián)[89]，而這兩類藥物被廣泛應(yīng)用，這種基因環(huán)境有利于armA在抗生素的選擇壓力下傳播。而npmA位于沒有其他耐藥基因的質(zhì)粒上[90]，由于基因環(huán)境缺乏共抗性基因，導(dǎo)致攜帶該基因的細(xì)菌在抗生素的壓力下被淘汰，從而限制了其傳播。不過，npmA的表達(dá)不會影響宿主的生長，因此該基因在沒有抗生素選擇壓力的情況下得以保留。

5 16S-RMTases陽性菌的檢測

5.1 N7-G1405 16S-RMTases的檢測

開發(fā)實(shí)用的16S-RMTases病原菌檢測技術(shù)，有助于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行流行病學(xué)研究和快速鑒定。N7-G1405 16S-RMTases陽性菌的特點(diǎn)是對4,6-二取代-2-DOS組具有高度耐藥性(表2)。阿米卡星和慶大霉素的高M(jìn)IC值(≥128 μg·mL-1)是檢測N7-G1405 16S-RMTases陽性菌的良好指標(biāo)[91]。所以檢測N7-G1405 16S-RMTases陽性菌時(shí)，首先通過常規(guī)藥敏試驗(yàn)，確定菌株同時(shí)對阿米卡星和慶大霉素耐藥，然后進(jìn)行高M(jìn)IC范圍的藥敏試驗(yàn)。可以采用紙片擴(kuò)散法篩選，N7-G1405 16S-RMTases陽性菌在阿米卡星和慶大霉素中幾乎沒有抑菌圈。到目前為止，這種檢測方法應(yīng)用于腸桿菌和部分非發(fā)酵革蘭陰性桿菌(如銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌)的試驗(yàn)已被證明有效。對4,5-二取代-2-DOS和鏈霉素的敏感性不能作為檢測N7-G1405 16S-RMTases陽性菌的指標(biāo)，因?yàn)镹7-G1405 16S-RMTases對這類氨基糖苷類藥物沒有明顯的抗性，而氨基糖苷磷酸化酶和核苷酸轉(zhuǎn)移酶可以使菌株對這些藥物產(chǎn)生抗性。所以先通過藥敏試驗(yàn)對N7-G1405 16S-RMTases陽性菌進(jìn)行初期篩選，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)耐藥基因，可能是目前唯一檢測N7-G1405 16S-RMTases基因的方法。

5.2 N1-A1408 16S-RMTases的檢測

目前關(guān)于該酶陽性菌的報(bào)道較少，尚未建立實(shí)用的N1-A1408 16S-RMTases陽性菌檢測方法。單憑常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，很難找到N1A1408 16S-RMTases陽性菌，因?yàn)閿y帶N1-A1408 16S-RMTases的菌株幾乎沒有任何顯著特征，對臨床使用的氨基糖苷類抗生素的耐藥譜與多種氨基糖苷類修飾酶聯(lián)合產(chǎn)生的耐藥譜相似。N1-A1408 16S-RMTases陽性菌可能對單取代DOS和安普霉素具有很高的耐藥性，實(shí)際上，在對安普霉素耐藥菌的檢測中，已經(jīng)鑒定出一株產(chǎn)N1-A1408 16S-RMTases(即NpmA)的大腸桿菌臨床分離株(ARS3)。對安普霉素耐藥還存在另一種耐藥機(jī)制，即aac(3)-IV修飾酶，這是大腸桿菌中對安普霉素耐藥最普遍的基因[92]，因而對安普霉素的敏感性不能作為檢測N1-A1408 16S-RMTases基因的指標(biāo)。因此，有必要進(jìn)一步收集N1-A1408 16S-RMTases非克隆陽性菌株并進(jìn)行大量檢測，以建立一種實(shí)用可行的N1-A1408 16S-RMTases陽性菌檢測方法。

6 展 望

6.1 16S-RMTases在革蘭陽性菌中的潛在轉(zhuǎn)移

革蘭陰性菌的多重耐藥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的問題之一。引起氨基糖苷類藥物耐藥的遺傳因素中，16S-RMTases陽性菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性高于目前所知的其他耐藥決定因素，且范圍更廣，是導(dǎo)致腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要因素。到目前為止，僅在革蘭陰性致病菌中鑒定出了16S-RMTases，而對革蘭陽性致病菌如葡萄球菌屬、鏈球菌和腸球菌等尚未見報(bào)道。然而已有研究表明，在天然啟動子的作用下，革蘭陰性病原菌的16S-RMTases在異源革蘭陽性菌、枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌中具有高水平的氨基糖苷類藥物耐藥性[17]。因此16S-RMTases陽性菌的出現(xiàn)和傳播應(yīng)該引起人們的密切關(guān)注。

6.2 新型抗16S-RMTases陽性菌強(qiáng)效劑的研制

針對16S-RMTases所帶來的問題，開發(fā)能特異性阻斷16S-RMTases活性的有效抑制劑是一種可行的方法。因此，有必要通過X射線晶體學(xué)分析16S-RMTases三維結(jié)構(gòu)，了解該酶與其底物之間的相互作用方式。到目前為止，從放線菌和病原菌中分離出的N7-G1405 16S-RMTases(Sgm、ArmA、RmtB)和N1-A1408 16S-RMTases(KamB、NpmA)的結(jié)構(gòu)已被解析并保存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。盡管放線菌和病原菌之間的氨基酸殘基差異很大(相似性不到30%)，但它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似，活性中心的關(guān)鍵氨基酸殘基具有很高的保守性。9個獲得性N7-G1405 16S-RMTases在氨基酸序列水平上有相當(dāng)大的相似性，一般至少有6個保守性氨基酸殘基，初步推測這些保守性殘基形成了酶的活性中心，在酶反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中一些氨基酸殘基后來被發(fā)現(xiàn)位于甲基轉(zhuǎn)移所涉及的酶的催化基團(tuán)中[93-94]。包括NpmA在內(nèi)的N1-A1408 16S-RMTases之間也存在保守的氨基酸殘基，但N7-G1405和N1-A1408 16S-RMTases之間的氨基酸序列沒有太大的相似性。進(jìn)一步明確16S-RMTases的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)將為開發(fā)有效的特異性抑制劑奠定基礎(chǔ)，還可用于建立臨床和獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測16S-RMTases陽性菌的檢測方法。

6.3 16S-RMTases陽性菌的監(jiān)測

如上所述，產(chǎn)16S-RMTases的革蘭陰性病原菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)傳播，它們通過獲得blaNDM-1和blaCTX-M-15等各種耐藥基因表現(xiàn)出多重耐藥表型。此外，沙門菌和志賀菌屬等高致病性微生物已經(jīng)攜帶16S-RMTases基因，并且已經(jīng)從家畜和寵物的養(yǎng)殖環(huán)境甚至食物分離得到。因此，在全國范圍的人和動物監(jiān)測計(jì)劃下，繼續(xù)監(jiān)測16S-RMTases陽性菌的傳播趨勢是非常重要的。

7 小 結(jié)

自21世紀(jì)初首次發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)高水平氨基糖苷類藥物耐藥性的產(chǎn)16S-RMTases革蘭陰性菌以來，獲得性16S-RMTases已經(jīng)在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，且出現(xiàn)了新的16S-RMTases變體。16S-RMTases陽性菌經(jīng)常攜帶其他臨床相關(guān)的耐藥基因，包括碳青霉烯酶基因(如blaNDM和blaKPC)、ESBLs基因和大腸桿菌素耐藥基因(mcr)，使得其治療變得更為復(fù)雜。因此，獲得性16S-RMTases在革蘭陰性病原菌中的出現(xiàn)和傳播必須引起高度重視。