甕茹茹，衛(wèi)鑫慧，李浩正，路福平，李 玉*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300457）

母乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是存在于母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用[1]。HMOs的結(jié)構(gòu)非常多樣化，目前已鑒定出200多種寡糖，其中2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）含量最高，約占總量的31%[2]。2015年9月由Glycom A/S公司進(jìn)行化學(xué)合成的兩種HMOs——2’-FL和乳糖基-N-新四糖（lacto-N-neotetrasaccharide，LNnT），作為嬰幼兒配方奶粉中的新型添加劑在美國(guó)獲得第一批監(jiān)管批準(zhǔn)（并于2016年11月批準(zhǔn)其微生物發(fā)酵產(chǎn)品），到2019年11月，歐盟批準(zhǔn)2’-巖藻糖基乳糖/二巖藻糖乳糖混合物作為新型食品投放市場(chǎng)，這些授權(quán)促進(jìn)了2’-FL的全球商業(yè)化，其首先是用作補(bǔ)充嬰兒配方食品的成分，還可用作膳食補(bǔ)充劑和醫(yī)療食品。此外，對(duì)2’-FL的食品安全性以及作為嬰兒食品添加劑的安全性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)嬰兒奶粉中添加1 g/L是安全的[3]；其他研究表明，添加2’-FL到低熱量嬰兒配方奶粉中，攝入奶粉的嬰兒可以達(dá)到與攝入母乳同樣的效果[4]。

從結(jié)構(gòu)組成來(lái)說(shuō)，2’-FL是在還原性末端連接有一個(gè)乳糖，在非還原端一個(gè)巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）通過(guò)α-1,2-鍵與乳糖結(jié)構(gòu)中的半乳糖（galactose，Gal）連接（圖1）[5]。研究表明，在腸道中，2’-FL可被有益微生物利用，從而調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[6]；還可抑制彎曲桿菌與人腸黏膜的結(jié)合，從而減少腹瀉[7]；也可以通過(guò)調(diào)節(jié)人腸道上皮細(xì)胞CD14的表達(dá)，從而減輕炎癥[8]。體外研究發(fā)現(xiàn)，2’-FL可使空腸彎曲桿菌對(duì)人體的侵襲能力降低80%，從而抑制腸道黏膜促炎因子和信號(hào)的釋放[9]，并減少由空腸彎曲桿菌引發(fā)嬰兒腹瀉的次數(shù)[10]。所以在嬰兒奶粉中加入食品級(jí)微生物生產(chǎn)的2’-FL可以增強(qiáng)新生嬰兒的免疫力，并有效增強(qiáng)新生嬰兒體質(zhì)[11]。2’-FL還可以通過(guò)提高非致病菌共生體的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)來(lái)間接抑制致病菌的生長(zhǎng)，并能直接充當(dāng)抗黏附抗菌劑減少微生物感染，使攝入2’-FL的嬰兒不容易患由肺炎鏈球菌、綠膿桿菌引起的中耳炎[12]。此外，2’-FL在大腦發(fā)育、神經(jīng)元傳遞和突觸的形成中也起作用，能夠刺激大腦發(fā)育[13-14]，所以在飲食中添加2’-FL可以促進(jìn)大腦發(fā)育并且能夠改善學(xué)習(xí)和記憶能力。由于2’-FL的突出生理功能，使得2’-FL成為市場(chǎng)上的急需產(chǎn)品。但目前2’-FL的產(chǎn)量還遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的需求，因此，如何提高2’-FL的生產(chǎn)規(guī)模，以滿足食品工業(yè)生產(chǎn)的需求，是值得思考的問(wèn)題。

圖1 2’-FL的結(jié)構(gòu)[5]Fig.1 Structure of 2’-FL[5]

目前合成2’-FL的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成方法中利用結(jié)晶媒介技術(shù)可實(shí)現(xiàn)2’-FL的合成[15]，但最終得率不足10%，該合成策略存在反應(yīng)步驟多、得率較低的問(wèn)題。隨后，一鍋法（one-pot）的出現(xiàn)一定程度地提高了2’-FL得率（仍然不足50%），但此法仍需10 步以上的反應(yīng)[16]。由此可見，化學(xué)法合成2’-FL雖然取得了很大的進(jìn)步，但是合成過(guò)程中需要對(duì)每個(gè)2’-FL分子進(jìn)行重復(fù)且多次的保護(hù)和去保護(hù)，過(guò)程繁瑣，還會(huì)降低產(chǎn)率并且增加成本[17]，想要利用化學(xué)合成法真正實(shí)現(xiàn)2’-FL的大量合成仍然十分困難。利用微生物進(jìn)行2’-FL的合成是目前大規(guī)模生產(chǎn)2’-FL的可行性方法，而且微生物合成的2’-FL與天然的2’-FL在功能上相同，臨床試驗(yàn)也不會(huì)引起不良反應(yīng)。與化學(xué)合成方法相比，微生物合成方法更加安全快捷，合成過(guò)程中不用引入大量的有毒試劑，更是可以直接用食品安全級(jí)別的微生物生產(chǎn)2’-FL，這樣大大增加了產(chǎn)物的安全性。然而沒(méi)有任何一種已知的微生物具有直接合成2’-FL的代謝途徑。研究表明，在大腸桿菌（E.coli）中過(guò)表達(dá)不同來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶可以實(shí)現(xiàn)將內(nèi)源和外源的糖基受體轉(zhuǎn)化成各種類型的HMOs[18]，合成2’-FL的最高產(chǎn)量達(dá)到47.0 g/L[19]。其他微生物如釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等，通過(guò)表達(dá)合成2’-FL的相關(guān)基因也已經(jīng)成功合成2’-FL。

2’-FL的微生物合成是在α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,2-fucosyltransferase，1,2-FT）的作用下，將巖藻糖基殘基從鳥苷5’-二磷酸-L-巖藻糖（guanosine 5’-diphosphate-L-fucose，GDP-L-fucose）轉(zhuǎn)移到乳糖上[20]。GDP-巖藻糖作為合成2’-FL的供體，在微生物合成方法中確定了兩種不同的代謝途徑：從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑[21]。2’-FL的生物合成過(guò)程如圖2所示。1996年Stevenson等發(fā)現(xiàn)GDP-巖藻糖作為莢膜異多糖酸的前體之一存在于大腸桿菌中[22]，隨后研究人員進(jìn)一步探究了GDP-巖藻糖的從頭合成途徑[23]。補(bǔ)救合成途徑最初發(fā)現(xiàn)僅存在于真核生物中[24]，直到Coyne等從脆弱類擬桿菌（Bacteroides fragilis9343）中發(fā)現(xiàn)雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶（L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase，F(xiàn)KP）[25]，才確定在原核生物中也存在2’-FL的補(bǔ)救合成途徑。

圖2 2’-FL的微生物合成途徑[23,25]Fig.2 Biosynthesis pathway for 2’-FL[23,25]

1 微生物合成2’-FL的關(guān)鍵步驟和限制因素

1.1 GDP-巖藻糖的含量

GDP-巖藻糖作為2’-FL合成的關(guān)鍵前體，其含量對(duì)于2’-FL的高效生產(chǎn)具有重要意義[26]。在微生物合成方法中確定了GDP-巖藻糖的兩種不同合成途徑：從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑。在從頭合成途徑中，輔因子NADPH在實(shí)現(xiàn)GDP-巖藻糖高濃度和高生產(chǎn)率方面起重要作用[27]，其來(lái)源主要有磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)和脫氫酶系統(tǒng)（圖3A）[28]。通過(guò)過(guò)表達(dá)zwf、gnd、icd、pntAB和gapN基因，可以顯著促進(jìn)NADPH再生、GDP-巖藻糖的形成和2’-FL的產(chǎn)生[6,29-30]。GTP作為GDP的供體和能源物質(zhì)，則參與到GDP-巖藻糖的補(bǔ)救合成過(guò)程中，其主要來(lái)源是鳥嘌呤核苷的代謝（圖3B）。通過(guò)操縱GTP的生物合成途徑，過(guò)表達(dá)xpt、guaA、gmk、ndk和deoD基因，敲除ykfN和guaC基因，也能夠提高GDP-巖藻糖的合成量[31-33]。

圖3 微生物合成2’-FL的輔助因子的來(lái)源途徑[29,33]Fig.3 Sources and reaction pathways of cofactors for the biosynthesis of 2’-FL[29,33]

1.2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性

1,2-FT能將巖藻糖基殘基從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移到乳糖上，是2’-FL生產(chǎn)過(guò)程中的核心酶，其來(lái)源不同不僅決定了2’-FL的形成速率，而且決定了有無(wú)副產(chǎn)物的形成。然而，微生物來(lái)源的1,2-FT活力是一般代謝酶活力數(shù)百分之一，是合成2’-FL的限制因素?，F(xiàn)階段合成2’-FL的過(guò)程中，主要是通過(guò)篩選微生物來(lái)源的高活力1,2-FT來(lái)提高2’-FL的產(chǎn)量。到目前為止，已經(jīng)篩選并驗(yàn)證了幾種酶活力較高的1,2-FT，其中，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）來(lái)源的FutC和FucT2是目前使用最多的1,2-FT，此外Chin等通過(guò)在FucT2的N端加入3 個(gè)天冬氨酸標(biāo)記，使2’-FL的濃度提高了約2.5 倍[34]，但發(fā)現(xiàn)FutC會(huì)催化產(chǎn)生副產(chǎn)物二巖藻糖乳糖。為獲得其他高活力的1,2-FT，Chin等[35]繼續(xù)在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）中，通過(guò)比對(duì)FucT2的氨基酸序列，從11 個(gè)預(yù)測(cè)的基因中篩選出來(lái)源于脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis）的wcfB基因，用其取代FucT2，使大腸桿菌工程菌發(fā)酵液中的2’-FL產(chǎn)量提高了10 倍，且無(wú)副產(chǎn)物二巖藻糖乳糖的產(chǎn)生。而Seydametova等[36]利用基因篩選方法從安全菌來(lái)源中鑒定出10 個(gè)1,2-FT的候選基因，最后篩選出一種來(lái)源于長(zhǎng)熱性球菌 （Thermosynechococcus elongatus）的Te2FT，與FutC相比，使大腸桿菌工程菌發(fā)酵液中的2’-FL含量提高了2.7 倍。

1.3 2’-FL的輸出

對(duì)于所有宿主菌，大部分的2’-FL都無(wú)法輸出到細(xì)胞外，而胞內(nèi)積累過(guò)多的2’-FL可能會(huì)通過(guò)反饋?zhàn)饔脕?lái)抑制2’-FL的繼續(xù)合成。有效地將2’-FL輸出細(xì)胞會(huì)降低其反饋抑制作用，減少副產(chǎn)物形成，同時(shí)促進(jìn)生產(chǎn)并方便下游純化[37]，但有關(guān)這方面的研究報(bào)道還比較少。Jennewein等首先發(fā)現(xiàn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SetA在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)了3’-FL的輸出[38]。Hollands等證實(shí)表達(dá)大腸桿菌的SetA和粗糙脈孢菌的纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)體CDT2能夠?qū)?’-FL從酵母細(xì)胞中輸出[39]。然而Zhai Yafei等研究發(fā)現(xiàn)SetA的表達(dá)也能將乳糖輸出細(xì)胞[31]，所以SetA的過(guò)度表達(dá)是否有利于2’-FL的產(chǎn)生還有待進(jìn)一步的研究。

2 大腸桿菌合成2’-FL的途徑改造與優(yōu)化

大腸桿菌是研究較為透徹的模式微生物，在實(shí)驗(yàn)研究和工業(yè)生產(chǎn)中，大多數(shù)用于HMOs生產(chǎn)的發(fā)酵過(guò)程仍然使用大腸桿菌。在合成2’-FL的過(guò)程中，由于大腸桿菌本身具有合成和代謝GDP-巖藻糖的能力，研究者們多是通過(guò)改造，在增加GDP-巖藻糖積累、提高乳糖的巖藻糖基化的基礎(chǔ)上來(lái)提高2’-FL的產(chǎn)量，具體優(yōu)化方法如表1所示。

表1 大腸桿菌中合成2’-FL代謝途徑的優(yōu)化Table 1 Optimization of metabolic pathways for the synthesis of 2’-FL in E.coli

2.1 增加GDP-巖藻糖的積累

GDP-巖藻糖是在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)從頭合成途徑或補(bǔ)救合成途徑獲得的，其含量決定了2’-FL的整體生產(chǎn)力以及產(chǎn)量[40]。除了可以通過(guò)調(diào)節(jié)輔因子NADPH和GTP的再生來(lái)提高GDP-巖藻糖的產(chǎn)量，還可以通過(guò)基因工程技術(shù)在提高GDP-巖藻糖合成的同時(shí)抑制其代謝，從而增加GDP-巖藻糖的積累。在從頭合成途徑中，主要是過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶基因manB、manC、gmd、wcaG[41]，過(guò)表達(dá)rcsA、rcsB基因[42]，敲除GDP-巖藻糖支路代謝路徑相關(guān)基因如wcaJ、lon[43]從而提高GDP-巖藻糖的合成量。其中，RcsA和RcsB是大腸桿菌合成莢膜異多糖酸的一種正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠使GDP-巖藻糖合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)能力上調(diào)，但會(huì)被溫度敏感的ATP依賴性蛋白酶Lon迅速降解；所以，過(guò)表達(dá)rcsA或rcsB基因同時(shí)敲除lon基因可提高GDP-巖藻糖的合成量[44]。WcaJ是莢膜異多糖酸合成途徑中的UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶，敲除wcaJ基因可避免GDP-巖藻糖代謝為莢膜異多糖酸，從而實(shí)現(xiàn)GDP-巖藻糖在細(xì)胞質(zhì)的積累[43]。Huang Di等通過(guò)過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶基因以及rcsA基因，敲除wcaJ、lon基因，得到9.12 g/L的2’-FL[6]。

在補(bǔ)救合成途徑中，底物L(fēng)-巖藻糖可以通過(guò)L-巖藻糖異構(gòu)酶（L-fucose isomerase，F(xiàn)ucI）、L-巖藻糖激酶（L-fuculose kinase，F(xiàn)ucK）和L-巖藻糖1-磷酸醛縮酶（L-fucose 1-phosphate aldolase，F(xiàn)ucA）的連續(xù)反應(yīng)進(jìn)行代謝[45]。同時(shí)，D-阿拉伯糖異構(gòu)酶（D-arabinose isomerase，D-AraA）、L-鼠李糖異構(gòu)酶（L-rhamnose isomerase，L-RhaA）[46]也會(huì)催化巖藻糖異構(gòu)化。因此，為使L-巖藻糖的代謝更多的趨向GDP-巖藻糖，Jung等通過(guò)敲除分解巖藻糖的araA、rhaA、fucI、fucK基因以及分解乳糖的lacZ基因，在大腸桿菌BL21（DE3）中過(guò)表達(dá)fkp和fucT2基因，最終得到2’-FL的產(chǎn)量為47.0 g/L[19]。

2.2 提高乳糖的巖藻糖基化

乳糖作為受體底物，必須保證其胞內(nèi)有足夠量可用于合成2’-FL。大腸桿菌中存在將胞外乳糖運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)的乳糖透過(guò)酶基因（lacY）[42]，同時(shí)也存在代謝乳糖的β-半乳糖苷酶基因（lacZ），為了陰斷細(xì)胞內(nèi)乳糖的代謝，一般是刪除內(nèi)源性的lacZ基因，或是選擇β-半乳糖苷酶缺陷型（lacZ）的大腸桿菌JM109作為宿主菌[40]。但文獻(xiàn)報(bào)道，在大腸桿菌BL21（DE3）中缺失lacZ基因后并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2’-FL的產(chǎn)生，這表明乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)受到lacZ基因缺失的影響[34]。這可能是因?yàn)閘acZ基因的缺失是極性突變，影響缺失位點(diǎn)下游基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄或翻譯，導(dǎo)致lacY基因表達(dá)的乳糖透過(guò)酶合成減少[47]。因此為了減緩乳糖的代謝又不改變對(duì)乳糖的運(yùn)輸功能，可對(duì)lacZ基因進(jìn)行部分敲除，如用含有l(wèi)acZΔM15（lacZ敲除第11～42密碼子）修飾的lac操縱子取代內(nèi)源性lac操縱子，與野生型大腸桿菌相比，β-半乳糖苷酶的活性降低了97%[34]；還可通過(guò)敲除lacZ基因，同時(shí)過(guò)表達(dá)lacY基因，來(lái)實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的活性降低，而乳糖透過(guò)酶活性不變[6]。

除了保證有足夠的乳糖用于合成2’-FL外，還必須提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性以提高乳糖的巖藻糖基化水平[48]。所以，選擇和表達(dá)高活力的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因是提高2’-FL產(chǎn)量的另一重要步驟。研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶都能利用乳糖作為唯一受體產(chǎn)生2’-FL。來(lái)自幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）的futC和fucT2基因表達(dá)活性較高，但其可以利用多種底物[20]，這一特性使其在產(chǎn)生2’-FL的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同類型的低聚糖副產(chǎn)品。而來(lái)源于脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis）的wcfB基因的出現(xiàn)解決了這個(gè)問(wèn)題[35]。另外，最新篩選得到的來(lái)源于長(zhǎng)熱性球菌（Thermosynechococcus elongatus）的Te2FT，不僅使2’-FL的產(chǎn)量提高了，而且總2’-FL中只有12.3%是胞內(nèi)的，其余87.7%存在于發(fā)酵上清液中；而依靠FutC產(chǎn)生的2’-FL中，胞內(nèi)含量達(dá)到49%[36]。這一特性說(shuō)明Te2FT的表達(dá)可使2’-FL外排更容易。

3 其他微生物合成2’-FL的研究進(jìn)展

到目前為止，在2’-FL的生物合成中主要宿主菌是大腸桿菌，其生產(chǎn)2’-FL的能力最高可達(dá)到47.0 g/L。但是除大腸桿菌外，其他微生物如釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等也已經(jīng)被選為生產(chǎn)2’-FL的宿主菌，因?yàn)樗鼈兺ǔ１徽J(rèn)為是安全的（generally recognized as safe，GRAS），而且已被廣泛應(yīng)用于食品和制藥行業(yè)。

3.1 釀酒酵母合成2’-FL

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細(xì)胞真核微生物，也是發(fā)酵中最常用的生物種類，具有生長(zhǎng)周期短、發(fā)酵能力強(qiáng)、容易進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以及含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)，一直是基礎(chǔ)及應(yīng)用研究的主要對(duì)象，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[49]。在酵母的細(xì)胞質(zhì)中存在相對(duì)豐富的GDP-甘露糖來(lái)源[50]，通過(guò)表達(dá)外源gmd和wcaG/GMER基因或fkp基因可以成功合成GDP-巖藻糖[51-53]。釀酒酵母不具有2’-FL的外排活性，在釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建2’-FL的代謝途徑，可得到總產(chǎn)量為0.5 g/L的2’-FL[54-55]。Hollands等通過(guò)篩選在釀酒酵母中表達(dá)能夠分泌2’-FL的轉(zhuǎn)運(yùn)體CDT2（來(lái)源于Neurospora crassa），使2’-FL的最高產(chǎn)量達(dá)到了15 g/L[39]。在補(bǔ)救合成途徑中，釀酒酵母細(xì)胞中由于缺乏巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[56]，致使巖藻糖利用率較低、細(xì)胞內(nèi)GDP-巖藻糖水平不夠高，這可能是限制2’-FL產(chǎn)量的另一重要因素。通過(guò)篩選獲得巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體并在釀酒酵母中表達(dá)，會(huì)是提高2’-FL產(chǎn)量的有效措施。

3.2 枯草芽孢桿菌合成2’-FL

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為革蘭氏陽(yáng)性菌，其生長(zhǎng)、繁殖速度較快，可形成內(nèi)生抗逆芽孢，由于其較高的分泌和生產(chǎn)能力，加上粗放的發(fā)酵培養(yǎng)要求，長(zhǎng)期以來(lái)一直被用作生產(chǎn)工業(yè)酶、維生素、功能性糖等的細(xì)胞工廠[57-59]。此外，還針對(duì)枯草芽孢桿菌開發(fā)了多種遺傳工具，以便更安全和更有效地生產(chǎn)食品添加劑[60]。上述工作的開展使枯草芽孢桿菌成為2’-FL生產(chǎn)的理想宿主?？莶菅挎邨U菌本身不表達(dá)乳糖透過(guò)酶基因，通過(guò)在基因組中插入外源乳糖透過(guò)酶基因，并表達(dá)外源fkp基因和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，即可實(shí)現(xiàn)2’-FL的生產(chǎn)。在Deng Jieying等[61]的一項(xiàng)研究中，通過(guò)對(duì)底物巖藻糖運(yùn)輸和GTP再生模塊進(jìn)行優(yōu)化——引入了一種編碼L-巖藻糖滲透酶的基因（glcP），微調(diào)GTP再生模塊基因，并敲除內(nèi)源性β-半乳糖苷酶基因（yesZ），成功地構(gòu)建了一種高效生產(chǎn)2’-FL的枯草芽孢桿菌菌株，2’-FL的最高產(chǎn)量達(dá)到5.01 g/L，巖藻糖和乳糖的2’-FL產(chǎn)率分別達(dá)到0.85 mol 2’-FL/mol巖藻糖和0.27 mol 2’-FL/mol乳糖。雖然工程枯草芽孢桿菌2’-FL的產(chǎn)量低于工程大腸桿菌的產(chǎn)量（47.0 g/L），但巖藻糖的2’-FL產(chǎn)率高于工程大腸桿菌（0.52 mol 2’-FL/mol巖藻糖），這也是工程枯草芽孢桿菌合成2’-FL的一個(gè)優(yōu)勢(shì)?？莶菅挎邨U菌中不具有2’-FL轉(zhuǎn)運(yùn)體，進(jìn)一步在枯草芽孢桿菌中表達(dá)2’-FL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，還可能會(huì)大幅度提高2’-FL的產(chǎn)量。

3.3 谷氨酸棒狀桿菌合成2’-FL

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是目前全球用以氨基酸發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)菌，最重要的是，其具有較高的NADPH再生能力[62]，這是合成GDP-巖藻糖過(guò)程中所需的輔助因子。谷氨酸棒狀桿菌本身具有manB和manC基因，可將甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖，Chin等[63]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)過(guò)表達(dá)gmd、wcaG、manB和manC，以葡萄糖和甘露糖為底物，可提高目標(biāo)產(chǎn)物GDP-巖藻糖的產(chǎn)量，含量達(dá)到5.5 mg/gmd，是相同條件下大腸桿菌的2.4 倍。在此基礎(chǔ)上表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fucT2和乳糖透過(guò)酶基因lacY，以葡萄糖和乳糖為底物，通過(guò)分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，最終2’-FL的產(chǎn)量達(dá)到5.8 g/L；進(jìn)一步對(duì)基因fucT2進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，2’-FL的最終產(chǎn)量達(dá)到了8.1 g/L[64]。

通過(guò)優(yōu)化改造后GRAS微生物生產(chǎn)2’-FL的能力見表2。

表2 GRAS微生物生產(chǎn)2’-FL的能力Table 2 GRAS microbial capacity to produce 2’-FL

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，國(guó)際上對(duì)2’-FL生產(chǎn)和用途的研究熱度逐漸提高，如何高效、安全地生產(chǎn)2’-FL正受到越來(lái)越多的關(guān)注。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于2’-FL生產(chǎn)菌株構(gòu)建技術(shù)的研究尚處于前期階段，主要以合成途徑的構(gòu)建和優(yōu)化為主。2’-FL的生產(chǎn)包括4 個(gè)關(guān)鍵部分：GDP-巖藻糖的產(chǎn)生、乳糖的有效供給、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇以及2’-FL的外排。目前對(duì)于GDP-巖藻糖的產(chǎn)生和乳糖的有效供給研究比較多，進(jìn)一步通過(guò)改造提高1,2-藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，或篩選其他高效的2’-FL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)是提高2’-FL產(chǎn)量的方向。此外，在菌株水平上，傳代過(guò)程中會(huì)因?yàn)橘|(zhì)粒的不穩(wěn)定性導(dǎo)致目的基因丟失，最重要的是抗生素的使用在食品安全生產(chǎn)中存在風(fēng)險(xiǎn)，所以將目的基因整合到染色體上進(jìn)行過(guò)表達(dá)會(huì)相對(duì)安全許多。據(jù)報(bào)道，Baumg?rtner等以β-半乳糖苷酶缺陷型（lacZ-）的大腸桿菌JM109為宿主菌，通過(guò)在染色體上整合從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑的相關(guān)基因來(lái)生產(chǎn)2’-FL，2’-FL的產(chǎn)量可達(dá)20.28 g/L[41]。但是，選擇食品安全級(jí)微生物，例如廣泛用于乳制品生產(chǎn)的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作為生產(chǎn)2’-FL的宿主菌，在不引入抗性基因的同時(shí)在染色體上整合合成2’-FL的基因，同時(shí)優(yōu)化代謝途徑，可能是生產(chǎn)2’-FL時(shí)更具應(yīng)用前景的方法。