曾詩嫻,趙孝玲,左進(jìn)華,閆志成,史君彥,王 清,*,崔京春,隋 媛
(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097;2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116600;3.重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院,重慶 402160)
娃娃菜(Brassica oleraceavar.bullata),屬十字花科蕓薹屬白菜亞種,生長周期短、幫薄甜嫩、味道甘甜。娃娃菜營養(yǎng)價(jià)值較高,含有豐富的纖維素、維生素及微量元素,其中鈣、鉀含量是白菜的2~3 倍[1],深受消費(fèi)者喜愛。娃娃菜采后代謝旺盛,營養(yǎng)物質(zhì)損耗快,修整加工過程會造成損傷脅迫,加速娃娃菜切莖褐變,導(dǎo)致其品質(zhì)和商品價(jià)值降低[2]。因此,采用有效的保鮮方法抑制娃娃菜莖部褐變,對延長其貨架期及提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。目前抑制娃娃菜褐變的方法主要是使用二氧化硫、亞硝酸鹽和抗壞血酸等化學(xué)抑制劑。二氧化硫能夠通過其強(qiáng)還原性抑制褐變,但二氧化硫會在食品中殘留,可能會誘發(fā)過敏和哮喘[3]。亞硝酸鹽主要是通過抑制酶活性來延緩褐變,但亞硝酸鹽可能具有致癌性,會破壞組織維生素,并產(chǎn)生惡臭味??箟难崾峭ㄟ^自身氧化以導(dǎo)致缺氧條件,其在含氧量高的組織或包裝中作用不大[4]。
曲酸是一種由好氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸[5],具有抗氧化作用,對多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性具有抑制作用[6];相同濃度條件下,曲酸對PPO活性的抑制效果優(yōu)于抗壞血酸和植酸[3]。曲酸易溶于水,并具有抗菌能力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性高、pH值適應(yīng)范圍廣、對人體刺激性小等優(yōu)點(diǎn)[7]。曲酸具有的獨(dú)特性質(zhì)使其成為非常有潛力的果蔬保鮮劑。王擎等[8]發(fā)現(xiàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%和0.5%曲酸可將馬鈴薯片與蓮藕片的貨架期分別延長2~4 d和4~6 d。曲酸可應(yīng)用于防止蘋果汁褐變[9],還可用于鮮切山藥[10]及荔枝[11]的保鮮。Yan Zhicheng等[12]發(fā)現(xiàn)用曲酸和CaCl2復(fù)合處理西蘭花能有效延緩西蘭花黃化和異味的產(chǎn)生。張婷婷等[13]發(fā)現(xiàn)曲酸對鮮切蘋果褐變的抑制作用優(yōu)于檸檬酸和抗壞血酸,曲酸可作為鮮切蘋果的保鮮劑和護(hù)色劑。目前研究較多的是曲酸與其他物質(zhì)組成的復(fù)合保鮮劑對果蔬的保鮮效果[14-16],以及曲酸的抑菌效果[17],鮮有曲酸抑制娃娃菜莖部褐變的研究。本實(shí)驗(yàn)研究了曲酸處理對抑制娃娃菜莖部切口褐變的影響,以期為娃娃菜貯藏保鮮提供理論依據(jù)。
‘京春娃3號’娃娃菜采摘于北京市農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司順義農(nóng)場,采收后2 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,選擇大小一致且無爛葉、無萎蔫的新鮮娃娃菜作為實(shí)驗(yàn)材料。
聚乙烯(polyethylene,PE)膜(40 cm×30 cm,厚度0.03 mm) 北京華盾雪花有限公司;濃鹽酸、甲醇、乙酸、無水乙酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)、PVP-40、Triton X-100、愈創(chuàng)木酚 西隴化工有限公司;30%過氧化氫溶液、Na2HPO4、NaH2PO4國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;曲酸、鄰苯二酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、NaOH、硼酸、硼酸鈉、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸 北京科創(chuàng)欣達(dá)科技有限公司。
UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī) 廣州晟龍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;7820A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;CR-400色度計(jì) 日本Konica Minolta公司;GXH-3052L型便攜式紅外線氣體分析器 北京均方理化科技研究所;All Basic分析研磨機(jī) 德國IKA公司。
1.3.1 娃娃菜處理
去除娃娃菜莖部表層約1 mm后將其隨機(jī)平均分為2 組,每組24 袋,每袋3 顆娃娃菜。將娃娃菜莖部在超純水(對照)或0.05 g/L曲酸溶液中浸泡1 min,取出晾干水分后裝入PE袋(折口不密封),再將其于20 ℃、相對濕度90%冷庫中貯藏5 d,每天取樣測定相關(guān)指標(biāo)。
1.3.2 感官評價(jià)
參照SB/T 10879—2012《大白菜流通規(guī)范》[18]以及King等[19]的方法,根據(jù)娃娃菜莖部橫切面的外觀色澤、新鮮度、顏色均勻度以及整棵娃娃菜的完整性進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 娃娃菜的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of baby cabbages
1.3.3 莖部褐變指數(shù)測定
褐變指數(shù)測定參考虎云青等[20]的方法。按照娃娃菜莖部橫切面的褐變面積評級:0級,無褐變;1級,褐變面積比例≤5%;2級,5%<褐變面積比例≤10%;3級,10%<褐變面積比例≤30%;4級,30%<褐變面積比例≤60%;5級,褐變面積比例>60%。莖部褐變指數(shù)按式(1)計(jì)算。
1.3.4 莖部色澤測定
采用色差儀測定娃娃菜的L*值、a*值、b*值。選取娃娃菜莖部橫切面任意1/3面積測定,重復(fù)3 次。
1.3.5 質(zhì)量損失率測定
采用差量法測定質(zhì)量損失率,具體按公式(2)計(jì)算。
1.3.6 呼吸強(qiáng)度測定
呼吸強(qiáng)度采用氣流法[21]測定,將樣品從保鮮袋中取出,置入樣品所在庫中的呼吸罐,采用氣體分析儀測定呼吸罐中的CO2濃度,測定時(shí)長為30 min,每次測定結(jié)束后放回原處繼續(xù)貯藏,以備繼續(xù)測定。以每千克鮮質(zhì)量樣品每小時(shí)產(chǎn)生的CO2質(zhì)量定義為呼吸強(qiáng)度,單位為mg/(kg·h)。
1.3.7 乙烯釋放速率測定
乙烯釋放速率測定參照曹建康等[22]的方法。將專用于測定乙烯釋放速率的娃娃菜放于塑料筐中用保鮮膜密封1 h,用氣相微量進(jìn)樣器抽取1 000 μL氣體,利用氣相色譜儀測定乙烯體積分?jǐn)?shù),并以每千克鮮質(zhì)量樣品每小時(shí)釋放的乙烯體積定義為乙烯釋放速率,單位為μL/(kg·h)。
1.3.8 總酚、類黃酮含量測定
總酚、類黃酮含量采用曹建康等[22]的比色法測定。以每克樣品在280、325 nm波長處的光密度值分別表示總酚、類黃酮含量。
1.3.9 丙二醛含量測定
丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[22]。切取1 cm厚的娃娃菜莖部作為樣品,并用分析研磨機(jī)將樣品磨成粉末。取磨樣后的娃娃菜組織1 g,準(zhǔn)確量取5 mL 100 g/L的三氯乙酸與娃娃菜樣品均勻混合,然后4 ℃、13 000×g離心20 min,將2 mL上清液與2 mL 5 g/L的硫代巴比妥酸混合煮沸30 min,冷卻后測定混合液于450、532 nm和600 nm波長處的吸光度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.10 苯丙氨酸解氨酶活力測定
苯丙氨酸解氨酶(phenylalamine ammonia lyase,PAL)活力測定參考靜瑋等[23]的方法,取1.3.9節(jié)中研磨后的樣品1.0 g與5.0 mL 0.1 mol/L pH 8.8的硼酸-硼砂緩沖液(每100 mL含3 g PVP、0.037 g乙二胺四乙酸鈉鹽和0.137 mLβ-巰基乙醇,下同)混合,4 ℃、15 000 r/min離心15 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系包括0.1 mL粗酶液、3.9 mL硼酸-硼砂緩沖液和1.0 mL 0.6 mmol/LL-苯丙氨酸溶液,對照以0.1 mL蒸餾水代替0.1 mL粗酶液。將反應(yīng)液置于37 ℃恒溫水浴中保溫1 h后測定290 nm波長處的吸光度,以吸光度每小時(shí)變化0.01所需酶量為1 個(gè)PAL活力單位(U),結(jié)果以組織鮮質(zhì)量計(jì),單位為U/g。
1.3.11 PPO、過氧化物酶、過氧化氫酶活力測定
PPO、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活力的測定均參考曹建康等[22]的方法。
采用Origin 8.5軟件作圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3 次測定平均值,利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan法)及皮爾遜相關(guān)性分析,P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著、極顯著。使用HemI軟件制作熱圖。
感官評分能直觀體現(xiàn)娃娃菜的商品價(jià)值。由圖1A可知,娃娃菜的感官評分在整個(gè)貯藏期間呈下降趨勢,其中曲酸處理組感官評分一直高于對照組,且2 d后組間呈極顯著差異(P<0.01)。由此表明,曲酸處理可明顯提高娃娃菜的外觀品質(zhì)。由圖1B可知,娃娃菜的褐變指數(shù)在整個(gè)貯藏期間呈上升趨勢。曲酸處理組的褐變指數(shù)在3~5 d顯著低于對照組(P<0.05)。說明0.05 g/L曲酸處理能有效抑制娃娃菜在貯藏后期的切莖褐變。
圖1 曲酸處理對娃娃菜感官評分(A)和褐變指數(shù)(B)的影響Fig.1 Effect of kojic acid treatment on sensory evaluation (A) and browning index (B) of baby cabbages
L*值表示亮度,L*值越接近100,表示樣品越亮。由圖2A可知,在整個(gè)貯藏期間,曲酸處理組的L*值明顯高于對照組,且2 d后存在顯著差異(P<0.05),表明0.05 g/L曲酸處理組娃娃菜的莖部亮度更高。a*值代表紅綠度,正值代表紅色,負(fù)值代表綠色。如圖2B所示,兩組娃娃菜莖部在貯藏過程中的a*值均呈上升趨勢,在2 d后曲酸處理組a*值開始明顯低于對照組,從第3天開始存在顯著差異(P<0.05)。b*值代表藍(lán)黃度,正值為黃色,負(fù)值為藍(lán)色。在本實(shí)驗(yàn)中,b*值越大,表示娃娃菜莖部切口褐變程度越深。由圖2C可知,從第1天開始,曲酸處理組b*值顯著低于對照組(P<0.05),與貯藏0 d相比,曲酸處理組和對照組在貯藏第5天時(shí)b*值分別增加了34%、43%。
圖2 曲酸處理對娃娃菜L*值(A)、a*值(B)、b*值(C)的影響Fig.2 Effect of kojic acid treatment on L*(A), a*(B) and b*(C) values of baby cabbages
以上結(jié)果說明0.05 g/L曲酸處理的娃娃菜莖部切口顏色變化比對照組小,褐變程度更低,與感官評分和褐變指數(shù)結(jié)果一致。
質(zhì)量損失率常作為果蔬保鮮的一項(xiàng)重要考核指標(biāo)[24]。由圖3可知,隨著貯藏時(shí)間的延長,娃娃菜的質(zhì)量損失率逐漸增加,且曲酸處理組的質(zhì)量損失率極顯著低于對照組(P<0.01)。可能是曲酸處理能抑制娃娃菜貯藏期間的蒸騰作用和呼吸作用,減少水分流失。
圖3 曲酸處理對娃娃菜質(zhì)量損失率的影響Fig.3 Effect of kojic acid treatment on mass loss percentage of baby cabbages
呼吸消耗是果蔬采后貯藏過程中質(zhì)量損耗和新鮮度下降的主要原因之一。如圖4A所示,在貯藏期間,兩組娃娃菜呼吸強(qiáng)度總體均呈先上升再下降的趨勢,對照組和曲酸處理組娃娃菜的呼吸強(qiáng)度均在貯藏的第1天達(dá)到最高峰,分別為182.56 mg/(kg·h)和155.45 mg/(kg·h)。在貯藏前3 d,曲酸處理組呼吸強(qiáng)度極顯著低于對照組(P<0.01)。說明曲酸處理對娃娃菜的呼吸有抑制作用。
圖4 曲酸處理對娃娃菜呼吸強(qiáng)度(A)和乙烯釋放速率(B)的影響Fig.4 Effect of kojic acid treatment on respiration intensity (A) and ethylene release rate (B) of baby cabbages
乙烯是果蔬自身生成的內(nèi)源激素,能催化果實(shí)成熟,加速果實(shí)衰老;且乙烯釋放速率越高,衰老程度越嚴(yán)重[25]。如圖4B所示,對照組娃娃菜乙烯釋放速率在前3 d處于上升趨勢,在第3天達(dá)到最大值,為0.108 1 μL/(kg·h),隨后下降,第5天時(shí)為0.084 8 μL/(kg·h)。而曲酸處理組娃娃菜乙烯釋放速率在前2 d處于上升趨勢,第2天達(dá)到最大值,為0.100 8 μL/(kg·h),隨后下降,第5天時(shí)為0.077 7 μL/(kg·h)。對照組的乙烯釋放速率最大值高于曲酸處理組,且在貯藏第3~5天,曲酸處理組的乙烯釋放速率顯著低于對照組。
娃娃菜莖部受到機(jī)械傷后產(chǎn)生大量活性氧,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,從而加速酶促反應(yīng)[26]。酚類化合物和PPO接觸后被氧化形成醌類物質(zhì),醌再進(jìn)一步合成黑褐色物質(zhì),從而引起褐變[27-29]。不同果蔬中酚類物質(zhì)的含量和種類差異較大,且在褐變過程中起主要作用的酚類物質(zhì)各不相同。譚興杰等[30]發(fā)現(xiàn)荔枝皮中含有6 種酚類化合物,其中只有一種是PPO作用底物,PPO對其他酚類物質(zhì)未表現(xiàn)出氧化活性。如圖5A所示,曲酸處理組的總酚含量在第3天達(dá)到最大值,隨后逐漸下降。而對照組的總酚含量從第1天開始逐漸上升,在第5天超過曲酸處理組。在貯藏的前4 d,曲酸處理組的總酚含量明顯高于對照組,且在第2~4天有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。雖然曲酸處理組的總酚含量高于對照組,但是褐變程度卻低于對照組,可能是因?yàn)榭偡雍可?,但娃娃菜褐變被抑制,而PPO作用的底物含量沒有升高。
圖5 曲酸處理對娃娃菜總酚含量(A)和類黃酮含量(B)的影響Fig.5 Effect of kojic acid treatment on total phenol (A) and flavonoid (B)contents of baby cabbages
如圖5B所示,在整個(gè)貯藏期中,曲酸處理組和對照組類黃酮含量總體均呈上升趨勢,但曲酸處理組的類黃酮含量極顯著高于對照組(P<0.01)。曲酸處理組的類黃酮含量高于對照組,但是褐變程度卻低于對照組,可能是因?yàn)轭慄S酮不是PPO作用的底物。
果蔬中膜系統(tǒng)的損傷是導(dǎo)致酶促褐變發(fā)生的一個(gè)重要條件。MDA是膜脂過氧化的主要副產(chǎn)物,其含量通常作為反映脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[31-32]。如圖6所示,曲酸處理組和對照組的MDA含量呈波動變化。在貯藏的前3 d,曲酸處理組MDA含量低于對照組。貯藏結(jié)束時(shí),對照組MDA含量為2.25 μmol/g,比此時(shí)曲酸處理組MDA含量高32.3%。
圖6 曲酸處理對娃娃菜MDA含量的影響Fig.6 Effect of kojic acid treatment on MDA content of baby cabbages
PAL是植物次生代謝物質(zhì)木質(zhì)素、酚類等生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,切割損傷可誘導(dǎo)PAL活性升高[33]。如圖7所示,曲酸處理的娃娃菜在貯藏期內(nèi)PAL活力高于對照組,在第1、4、5天存在極顯著差異(P<0.01)。第5天曲酸處理組PAL活力比對照組高1.0%。
圖7 曲酸處理對娃娃菜PAL活力的影響Fig.7 Effect of kojic acid treatment on PAL activity of baby cabbages
PPO是果蔬發(fā)生酶促褐變的重要酶類,它能夠氧化酚類成醌,引起果實(shí)褐變[34]。如圖8A所示,在貯藏期內(nèi),兩組的PPO活力均呈上升趨勢,且曲酸處理組的PPO活力極顯著低于對照組(P<0.01)。POD在果蔬的貯藏過程中會引起其緩慢褐變[35]。如圖8B所示,在貯藏的前4 d,曲酸處理組的POD活力上升并達(dá)到最大值(36.80 U/g),之后下降。而對照組POD活力在貯藏的0~2 d上升,2~3 d下降,3~5 d上升,且在第5天達(dá)到最大值(45.31 U/g)。在整個(gè)貯藏過程中,曲酸處理組POD活力明顯低于對照組。貯藏結(jié)束時(shí)曲酸處理組PPO、POD活力比對照組分別低28.5%和29.7%。以上結(jié)果說明曲酸處理可顯著抑制PPO、POD活性。
圖8 曲酸處理對娃娃菜PPO(A)和POD(B)活力的影響Fig.8 Effect of kojic acid treatment on PPO (A) and POD (B) activity of baby cabbages
CAT是最主要的活性氧清除劑,它能將代謝產(chǎn)生的H2O2分解成氧氣和水[36],維持活性氧代謝平衡[21]。從圖9可以看出,在整個(gè)貯藏期間,曲酸處理組的CAT活力始終高于對照組,除第2天外,其他時(shí)間點(diǎn)均存在極顯著差異(P<0.01)。第5天CAT處理組活力比對照組高12.4%。由此可知,曲酸處理能提高娃娃菜中CAT的活力,抑制H2O2對組織造成的氧化損傷,從而延緩?fù)尥薏饲o部切口的褐變。
圖9 曲酸處理對娃娃菜CAT活力的影響Fig.9 Effect of kojic acid treatment on CAT activity of baby cabbages
由圖10可知,褐變指數(shù)與呼吸強(qiáng)度、MDA含量、類黃酮含量、PAL活力和CAT活力呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著,與乙烯釋放速率、總酚含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與質(zhì)量損失率、a*值、b*值、PPO活力和POD活力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與L*值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與感官評分呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。
圖10 曲酸處理后娃娃菜各生理生化指標(biāo)皮爾遜相關(guān)性矩陣Fig.10 Pearson correlation coefficient matrix among physiological and biochemical indicators of baby cabbages treated with kojic acid
娃娃菜味道清甜、口感脆嫩,且含有豐富的營養(yǎng)成分,能夠預(yù)防各種疾病。娃娃菜在采后修整加工過程中莖部受到機(jī)械損傷,導(dǎo)致娃娃菜莖部切口快速褐變,進(jìn)一步導(dǎo)致娃娃菜的軟化和腐爛,最終失去其原有感官及商品價(jià)值,且其呼吸作用和蒸騰作用等生理活動加劇會引起水分和營養(yǎng)物質(zhì)的流失。因此需要尋找一種安全有效的保鮮方法。
已有研究發(fā)現(xiàn),2.5%曲酸處理可有效減少鮮切西藍(lán)花貯藏期間的水分流失,延緩可滴定酸、VC和葉綠素含量的下降,顯著提高鮮切西藍(lán)花的貯藏品質(zhì)[37]。0.5%和1%曲酸通過在油菜表面形成保護(hù)膜起到抑制葉綠素降解的作用,同時(shí)可以減緩蒸騰失水,延緩葉綠素的降解,從而延緩油菜黃化[38]。
本研究發(fā)現(xiàn),與對照相比,0.05 g/L曲酸溶液處理可以有效降低娃娃菜采后呼吸速率和乙烯釋放速率;且曲酸處理能有效抑制PPO和POD活力,延緩?fù)尥薏饲o部切口褐變的發(fā)生。其主要原因可能是曲酸結(jié)構(gòu)與酚類底物結(jié)構(gòu)相似,可與PPO發(fā)揮活性所需的銅離子螯合,從而抑制黑色素的形成[39]。曲酸處理后娃娃菜總酚含量較高,可能是因?yàn)镻PO對娃娃菜中所含的酚類物質(zhì)不表現(xiàn)出活性,也可能是由于曲酸處理抑制了POD和PPO活力,延緩了酚類物質(zhì)的氧化,減少了酚類向醌類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。0.05 g/L曲酸溶液還能有效提高抗氧化酶PAL和CAT活力,使得細(xì)胞內(nèi)大量活性氧被及時(shí)清除,防止膜過氧化、功能結(jié)構(gòu)被破壞,維持細(xì)胞內(nèi)部的動態(tài)平衡,使娃娃菜具有更好的貯藏品質(zhì),延長其貯藏時(shí)間。
綜上,使用0.05 g/L曲酸溶液處理娃娃菜莖部切口,可有效保持娃娃菜的感官品質(zhì),抑制莖部切口褐變,降低質(zhì)量損失率、呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放速率,并減少M(fèi)DA含量,提高類黃酮及總酚含量;還能降低娃娃菜的POD、PPO活力,提高PAL、CAT活力。因此,0.05 g/L曲酸處理能夠有效抑制娃娃菜莖部褐變,增強(qiáng)娃娃菜的抗氧化能力,延長娃娃菜的貨架期。