李西棟，孫紹霞，梁亞楠，石塔拉，宓 偉,*

（1.臨沂市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 臨沂 276000；2.濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 煙臺 264003）

胰島素抵抗是由胰島素的受體數(shù)量下降、分子結(jié)構(gòu)功能異常和拮抗激素分泌過多等因素引起的胰島素靶器官對內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低[1]。胰島素抵抗使機(jī)體對葡萄糖的攝取和利用率降低，長時間持續(xù)會使調(diào)節(jié)血糖水平的肝臟受損，所以肝臟氧化應(yīng)激在胰島素抵抗的發(fā)展進(jìn)程中起著非常重要的作用[2-4]。

山楂原花青素（hawthorn proanthocyanidin，HPC）主要來源于山楂，是低聚體形式的原花青素，研究結(jié)果顯示其抗氧化能力遠(yuǎn)高于來源于葡萄籽和松樹皮的高聚體原花青素[5-6]。另外，大多數(shù)研究認(rèn)為原花青素是改進(jìn)胰島素敏感性的有效物質(zhì)，但機(jī)制尚未闡明。原花青素增加胰島素敏感性機(jī)制的研究主要集中在胰島素信號傳導(dǎo)通路上關(guān)鍵分子的表達(dá)及活性改變方面，然而結(jié)論卻并不一致，且主要以高聚體的葡萄籽原花青素為主，而氧化活性強的HPC鮮見研究。VC在蔬菜和水果中含量十分豐富，具有很強抗氧化能力，同時還能保護(hù)其他物質(zhì)免受氧化破壞[7]。Wnt/β-catenin信號通路可由Wingless/integrated protein 1（Wnt1）、Wnt2、Wnt3α和Wnt8等蛋白激活，與細(xì)胞表面Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh結(jié)合后，Dsh被激活并抑制下游軸蛋白/糖原合酶激酶-3β/腺瘤樣息肉病蛋白（Axin/glycogen synthasc kinase-3β/adenomatous polyposis coli protein，Axin/GSK-3β/APC）復(fù)合物，Axin/GSK-3β/APC復(fù)合體可抑制細(xì)胞內(nèi)信號分子β-catenin的降解，使得胞漿內(nèi)的β-catenin大量積聚，部分β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與T-Cell factor/Lymphoid Enhance Factor轉(zhuǎn)錄因子家族如原癌蛋白（C-myc）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）、生存素（survivin）、Axin2和白細(xì)胞分化抗原44（cluster of differentiation 44，CD44）等作用并促進(jìn)其表達(dá)，而PPARγ的表達(dá)與胰島素抵抗的發(fā)展密切相關(guān)[8-10]。HPC聯(lián)合VC之間抗氧化有無協(xié)同作用且通過Wnt/β-catenin信號通路減輕胰島素抵抗氧化應(yīng)激鮮見相關(guān)報道。本實驗采用喂養(yǎng)大鼠高脂飼料制造胰島素抵抗模型，并探討HPC和VC聯(lián)合作用通過Wnt/β-catenin分子信號通路調(diào)控PPARγ表達(dá)對大鼠胰島素抵抗以及胰島素的敏感性和反應(yīng)性的影響，為功能食品開發(fā)和研制胰島素抵抗肝臟氧化應(yīng)激治療新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠90 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（189±12）g，SPF級，由濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2017-0012）。在無特定病原體的條件下常規(guī)喂養(yǎng)大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。

One-Touch全自動血糖儀及配套血糖試紙美國強生公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國Millipore公司；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒 南京建成科技有限公司；HPC（純度95%） 中國西安綠天生物技術(shù)有限公司；VC、二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗體美國Sigma公司；β-actin多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體 武漢三鷹生物公司；總RNA提取試劑盒、SYBR green試劑盒 日本Takara公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；凝交成像分析系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 澳大利亞Corbett公司；熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）分析儀 上海格羅貝爾生物科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 胰島素抵抗大鼠造模

將90 只雄性Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組10 只和高脂膳食組80 只。對照組給予配比為玉米73.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）、麥麩20%、魚粉5%、骨粉1%、食鹽0.5%的普通飼料，脂肪供能占61%；高脂膳食組給予配比為普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%的高脂飼料，脂肪供能占87%。兩組大鼠同時喂養(yǎng)6 周，分別稱量造模前后正常對照組和造模成功的高脂膳食組大鼠體質(zhì)量，計算2 組大鼠在造模前后的體質(zhì)量變化。造模成功后，對大鼠禁食12 h，次日上午將所有大鼠全麻，斷尾取血1 mL，采用One-Touch全自動血糖儀檢測大鼠空腹血糖濃度。同時對所有大鼠進(jìn)行眼眶靜脈取血，4 ℃、20 000 r/min離心20 min取上清液，參考ELISA試劑盒檢測血清胰島素濃度，參照試劑盒說明書用比色法檢測血清ALT、AST和ALP活力。大鼠空腹血糖濃度不低于6.5 mmol/L且血清胰島素濃度不低于35 μIU/mL為造模成功。

1.3.2 大鼠肝勻漿相關(guān)指標(biāo)水平檢測

將造模成功的胰島素抵抗大鼠隨機(jī)分為模型組、HPC組、VC組、HPC+VC組和二甲雙胍組，每組10 只。對各組大鼠進(jìn)行5 mL等體積灌胃：正常對照組和模型組（等體積生理鹽水）、HPC（56 μg/mL）組、VC（180 μg/mL）組、HPC（56 μg/mL）+VC（180 μg/mL）組和二甲雙胍（2 μg/mL）組[11]，每日1 次，連續(xù)給藥12 周后，禁食12 h后，眼眶靜脈取血檢測葡萄糖和胰島素水平，然后將大鼠脫臼處死，解剖后迅速出取肝臟，用生理鹽水沖洗并用濾紙吸干，稱取250 mg肝臟并剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入2.25 mL預(yù)冷的pH 7.4、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝勻漿備用，按照各試劑盒說明書分別測定各組大鼠肝勻漿中的SOD、CAT、GPx、GSH、MDA水平。

1.3.3 實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ的mRNA表達(dá)水平

將預(yù)處理的大鼠肝細(xì)胞以0.5×106個/孔的密度接種于6 孔板。按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA，采用SYBR green試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測。通過ΔΔCt方法計算相對mRNA表達(dá)水平，并選擇GAPDH作為內(nèi)參基因[12]，通過熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。引物序列參見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的表達(dá)水平

取肝勻漿200 mg，加入少量0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗2 次，4 ℃、20 000 r/min離心棄去上清液，瀝干后加入1 mL裂解緩沖液，冰上靜置40 min，收集裂解液，4 ℃、20 000 r/min離心20 min，取上清液至EP管備用。取20 mg蛋白樣品，加入6%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，沸水變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝交電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后濕移至聚偏二氟乙烯膜上；用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，依次加入兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗體和相應(yīng)β-actin多克隆抗體，4 ℃過夜，加入0.05 mol/L pH 7.8的Tris緩沖溶液洗膜后，滴加ECL發(fā)光試劑進(jìn)行檢測，曝光20 s～5 min，顯影2 min，定影5 min，采用Quantity One軟件掃描各條帶，獲取目的蛋白灰度值，實驗重復(fù)6 次。

1.3.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析法檢測Wnt1和Dsh結(jié)合情況

采用FRET分析儀檢測Wnt家族分泌蛋白Wnt1和Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh之間是否能形成異源二聚體，分別制備對照組、模型組、HPC組、VC組、HPC+VC組和二甲雙胍組處理12 周后的大鼠肝細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)，采用分子克隆方法構(gòu)建用于FRET的兩個真核重組質(zhì)粒：pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1。質(zhì)粒構(gòu)建成功后，利用pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染上述制備的6 組肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，檢測FRET信號。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素抵抗大鼠造模結(jié)果

80 只大鼠給予高脂膳食喂養(yǎng)，有54 只造模成功，成功率67.5%。如表2所示，造模后，模型組大鼠的空腹血糖、血清胰島素、ALT、AST和ALP水平均顯著高于對照組大鼠（P＜0.01）。

表2 造模后對照組和模型組大鼠各檢測指標(biāo)比較Table 2 Comparison of all tested parameters between control and model groups

2.2 大鼠肝勻漿中各指標(biāo)檢測結(jié)果

如表3所示，與對照組相比，模型組大鼠SOD、CAT、GPx、GSH水平均極顯著下降（P＜0.01），而MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，HPC組、HPC+VC組和二甲雙胍組大鼠肝勻漿中各指標(biāo)含量均有極顯著差異（P＜0.01）。HPC+VC組對肝勻漿中各指標(biāo)干預(yù)效果優(yōu)于HPC組（P＜0.05）。

表3 大鼠肝勻漿中各指標(biāo)檢測結(jié)果（n＝10）Table 3 Parameters in rat liver homogenate (n = 10)

2.3 HPC和VC聯(lián)合對Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1和β-catenin的mRNA相對表達(dá)水平極顯著增加（P＜0.01），分別增加102.34%和110.62%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低56.12%、60.34%、53.41%和70.05%。與模型組比較，HPC+VC組Wnt1和β-catenin的mRNA相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了35.61%和45.21%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相對表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），分別升高了51.37%、69.54%、42.39%和61.54%。

圖1 Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ的mRNA相對表達(dá)水平（n＝6）Fig.1 mRNA expression of wnt1, Axin, GSK-3β, APC, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.4 HPC和VC聯(lián)合對肝組織Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1和β-catenin的蛋白相對表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），蛋白相對表達(dá)水平分別升高了56.31%和68.15%；PPARγ的蛋白相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），蛋白相對表達(dá)水平降低了82.61%。與模型組比較，HPC+VC組Wnt1和β-catenin的蛋白相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了38.25%和47.64%；PPARγ的蛋白相對表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），升高了76.28%。

圖2 Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的相對表達(dá)水平（n＝6）Fig.2 Relative protein expression levels of Wnt1, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.5 FRET檢測配體Wnt1和受體Dsh結(jié)合狀況

轉(zhuǎn)染24 h用FRET分析儀檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示。為獲得FRET圖像，通過受體組獲得摩爾吸光系數(shù)為0.60，通過配體組獲得摩爾吸光系數(shù)為0.53，配體Wnt1表達(dá)數(shù)量多呈現(xiàn)黑紫色，數(shù)量少呈紅色，受體Dsh呈藍(lán)紫色，配體Wnt1和受體Dsh結(jié)合形成數(shù)量少顯示綠色，形成數(shù)量多會出現(xiàn)紅黃色。與模型組相比，HPC+VC組的FRET信號明顯減弱，說明隨著時間的延長，Wnt1與Dsh之間的結(jié)合力明顯減弱，形成的異源二聚體數(shù)量明顯減少。

圖3 24 h后FRET信號結(jié)果（60×）Fig.3 FRET signals acquired after 24 h (60 ×)

3 討 論

肥胖是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要原因之一，亦會損害肝臟使其氧化應(yīng)激能力降低，加劇2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[13-15]。血清中ALT、AST和ALP升高可能與肝細(xì)胞的損傷有關(guān)[16]，本研究中，造模成功的胰島素抵抗大鼠血清ALT、AST和ALP水平均高于對照組大鼠（P＜0.01）。研究證明，發(fā)生胰島素抵抗時，肝細(xì)胞氧化應(yīng)激能力增強，氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞損傷有密切聯(lián)系[17-18]。肥胖導(dǎo)致肝臟過氧化，過氧化產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）增多，ROS和RNS氧化和損傷機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的基因，還可以激活細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路，該分子信號通路與胰島素抵抗和肝細(xì)胞功能受損密切相關(guān)[19-21]。本實驗中，通過HPC和VC聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)胰島素抵抗大鼠，肝勻漿中SOD、CAT、GPx活力和GSH含量均顯著升高而MDA含量顯著下降（P＜0.01），效果優(yōu)于單獨使用HPC干預(yù)，明顯降低了胰島素抵抗大鼠的肝臟氧化應(yīng)激能力，改善胰島素抵抗[22-24]。

PPARγ是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞接受Wnt信號刺激時，Wnt蛋白作為配體與細(xì)胞膜表面的Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh結(jié)合，Dsh通過磷酸化被激活，通過Dsh的DIX和PDZ結(jié)構(gòu)域抑制GSK-3β破壞復(fù)合物Axin/GSK-3/APC活性，β-catenin能夠積聚并定位于細(xì)胞核，隨后通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以及T細(xì)胞因子/淋巴增強因子誘導(dǎo)Wnt蛋白表達(dá)，如PPARγ轉(zhuǎn)錄降低，使外周組織對胰島素的敏感性和靈敏性降低，而發(fā)生胰島素抵抗[25-27]。胰島素抵抗大鼠同時攝取HPC和VC，與模型組比較，Wnt1的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了35.61%和38.25%，F(xiàn)RET信號明顯減弱，Wnt1與Dsh之間的結(jié)合力明顯減弱，形成的異源二聚體數(shù)量明顯減少，Axin、GSK-3β、APC的mRNA相對表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），β-catenin的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），PPARγ的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），初步說明HPC+VC聯(lián)合作用通過Wnt/β-catenin通路減輕胰島素抵抗大鼠氧化應(yīng)激，且HPC和VC為食物中的植物活性成分和營養(yǎng)素，值得進(jìn)一步提取研究和開發(fā)，從而應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療疾病[28-30]。

綜上所述，HPC和VC聯(lián)合應(yīng)用改善胰島素抵抗大鼠肝臟氧化應(yīng)激與Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)PPARγ有關(guān)，但是二者聯(lián)合如何抑制Wnt1蛋白分泌的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探索。