郭新明，吳麗君*，趙 靜，田俊生

（1.太原師范學(xué)院體育系，山西 太原 030619；2.山西大學(xué)體育學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006）

自由基是細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物[1-2]，但是過量的自由基則是冠心病、糖尿病、白內(nèi)障、癌癥以及衰老等的誘發(fā)因素。早在1982年Davies等就提出急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)使體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基[3]，近年來的研究也表明急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)由于產(chǎn)生大量自由基可引起生物體脂質(zhì)過氧化、DNA氧化損傷及遺傳毒性損傷等[4-6]，因此自由基受到運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)學(xué)界的緊密關(guān)注。

蝦青素是在海洋生物（魚、蝦、藻類）中發(fā)現(xiàn)的一種類胡蘿卜素[7]，可通過吸引自由基或?yàn)樽杂苫峁╇娮觼砬宄杂苫?，從而抑制?xì)胞脂質(zhì)和DNA過氧化造成的損傷，具有緩解眼疲勞、保護(hù)中樞神經(jīng)、抗炎、抗癌和防衰老等多種功效。在運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域，蝦青素具有抗氧化、緩解骨骼肌與心肌損傷、維持骨骼肌張力與耐力、延緩運(yùn)動(dòng)疲勞等作用[8-11]。

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代末期自人類基因組計(jì)劃、蛋白質(zhì)組計(jì)劃之后迅速發(fā)展起來的以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)、以群組指標(biāo)分析為基礎(chǔ)的一門生物學(xué)學(xué)科[12]。可以不預(yù)先設(shè)定將要檢測的具體指標(biāo)“全景式”掃描所有代謝物，從而反映藥物、環(huán)境污染、運(yùn)動(dòng)等外界因素對機(jī)體代謝的影響[13-15]。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在生理學(xué)、毒理學(xué)、藥物療效與藥物作用機(jī)理等方面取得了長足進(jìn)步。在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域針對天然抗氧化物對運(yùn)動(dòng)機(jī)體影響的研究少有學(xué)者采用代謝組學(xué)方法進(jìn)行探究。本實(shí)驗(yàn)采用核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)研究口服蝦青素對人體在安靜狀態(tài)下及間歇性急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血清小分子代謝物的影響，結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行分析，試圖從代謝物及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控角度探究天然抗氧化物蝦青素對人體機(jī)能產(chǎn)生影響的作用途徑與機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重水D2O 美國Norell公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Amresco公司；抗氧化指數(shù)試劑盒、血乳酸試劑盒 意大利Callegari公司；蝦青素軟交囊600 mg/粒（每粒蝦青素質(zhì)量≥4 mg） 湖北武漢雅士達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

874E定量負(fù)荷功率自行車 瑞典Monark公司；CR3000RC型氧自由基生化分析儀 意大利Callegari公司；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán)；XW-80A渦旋混合器 深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；600 MHz AVACNCE III NMR波譜儀 瑞士Bruker公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山舒美公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)對象篩選與分組

以體育學(xué)院體育學(xué)專業(yè)16 名男生（18～20 周歲）作為實(shí)驗(yàn)對象，隨機(jī)分為對照組A（服用安慰劑，外觀一致的淀粉交囊）和實(shí)驗(yàn)組B（服用蝦青素組），每組8 人。受試者的心率、血壓在正常范圍，肺活量、臺(tái)階指數(shù)、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、100 m跑等指標(biāo)處于同級水平內(nèi)，經(jīng)顯著性分析顯示無顯著性差異。兩組受試者身高、體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)指標(biāo)等無顯著差異（表1）。無家族遺傳病史，近期無心血管、呼吸道感染等病史，實(shí)驗(yàn)前一個(gè)月無VC、VE等抗氧化營養(yǎng)補(bǔ)劑及中藥補(bǔ)劑補(bǔ)充。

表1 受試者基本狀況Table 1 Basic parameters of the subjects

1.3.2 干預(yù)劑量與運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)定為29 d。實(shí)驗(yàn)第1天清晨兩組受試者首次空腹指尖采血測定抗氧化指數(shù)與血乳酸質(zhì)量濃度，當(dāng)晚9時(shí)實(shí)驗(yàn)組開始服用蝦青素（12 mg/d），以后每晚9時(shí)按此劑量連續(xù)服用28 d，對照組服用安慰劑28 d。實(shí)驗(yàn)第29天清晨兩組受試者空腹再次指尖采血測定抗氧化指數(shù)與血乳酸質(zhì)量濃度，同時(shí)肘靜脈抗凝管采血5 mL。隨后進(jìn)行30 s×3 組，組間休息3 min蹬騎功率自行車運(yùn)動(dòng)，負(fù)荷為0.075 kg/kgm[16-17]。

b運(yùn)動(dòng)后即刻進(jìn)行第3次采血，指尖血測定抗氧化指數(shù)與血乳酸質(zhì)量濃度，肘靜脈抗凝管采血5 mL用于代謝組學(xué)測試。

1.3.3 核磁共振氫譜測定

抗凝管內(nèi)收集的血樣經(jīng)3 000 r/min離心30 min后，取上清液1 mL置于EP管內(nèi)、80 ℃冰箱保存。將冷凍保存的血清樣本用冰水混合物解凍后，用移液槍吸取450 μL到2 mL的EP管中，加入甲醇900 μL漩渦振蕩2 min，再放入TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)中4 ℃、13 000 r/min離心30 min，然后取上清液900 μL加入5 mL的EP管中，經(jīng)鼓風(fēng)干燥機(jī)空氣源吹干后加入600 μL pH 7.4 0.2 mol/L PBS（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%三甲基硅基丙酸鈉），在超聲清洗器中經(jīng)超聲復(fù)溶，充分復(fù)溶后取550 μL加入內(nèi)徑為5 mm的核磁管，4 ℃保存待測。4 ℃保存待測的核磁管內(nèi)制備好的樣本使用600-MHz AVACNCE III NMR波譜儀利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脈沖序列掃描64 次，自旋弛豫延遲320 ms，自由感應(yīng)衰減64 K數(shù)據(jù)點(diǎn)，譜寬8 kHz，得到指紋圖譜。

1.3.4 血乳酸質(zhì)量濃度與抗氧化指數(shù)測定

血乳酸質(zhì)量濃度與抗氧化指數(shù)測定的血樣均為指尖毛細(xì)微管采血，采血后立刻用CR3000RC型氧自由基測試儀檢測血乳酸質(zhì)量濃度和抗氧化指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)采集與處理

使用MestReNova軟件對NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉變換，經(jīng)校正、積分后進(jìn)行歸一化處理，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。使用SIMCA-P13.0軟件對積分值進(jìn)行中心化與規(guī)格化后，對其進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projection to latent structures discrimination analysis，OPLS-DA）。以差異代謝物對本組的變量重要性貢獻(xiàn)（variable importance in the projection，VIP）值和t檢驗(yàn)值作為差異代謝物的篩選指標(biāo)，即以VIP值大于1且P＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。所有的化合物都通過京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，再將篩選出的生物標(biāo)志物輸入MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca）中，分析相應(yīng)的代謝通路。血乳酸質(zhì)量濃度與抗氧化指數(shù)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)組與對照組對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組組內(nèi)自身前后差異采用配對樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLS-DA結(jié)果

PLS-DA可以實(shí)現(xiàn)多因變量與多自變量的回歸建模，為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，本研究對建立的各PLS-DA模型是否過擬合進(jìn)行了驗(yàn)證。模型的R2X、R2Y、Q2參數(shù)用來檢驗(yàn)本次模型是否過擬合，R2X和R2Y分別表示多元統(tǒng)計(jì)分析建模時(shí)模型對X、Y變量的解釋度，參數(shù)越接近1表示所建模型可靠性越高，Q2表征模型的預(yù)測率，一般R2Y和Q2的值都大于0.5說明組間差異顯著。由表2可見，本模型比較理想，具有很好的解釋率和預(yù)測率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖1可知，R2與Q2最右側(cè)的點(diǎn)均明顯高于其他點(diǎn)，且R2趨勢不僅高于Q2且能很好地分開，表明本次模型驗(yàn)證參數(shù)的解釋及預(yù)測能力強(qiáng)，模型驗(yàn)證成立。

圖1 PLS-DA模型驗(yàn)證圖Fig.1 Verification of PLS-DA model

表2 PLS-DA模型參數(shù)Table 2 Parameters of PLS-DA model

2.2 OPLS-DA結(jié)果

本研究通過OPLS-DA得到其簡化、降維后的得分圖與S-Plots圖分別如圖2、3所示。

圖2 OPLS-DA模型得分圖Fig.2 Score plots of OPLS-DA model

圖2A、B分別為對照組與實(shí)驗(yàn)組在運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OPLS-DA模型得分圖。如圖2所示，每組組內(nèi)個(gè)體呈現(xiàn)聚集趨勢，對照組與實(shí)驗(yàn)組能夠明顯分開，兩組間分離趨勢明顯，說明補(bǔ)充蝦青素及運(yùn)動(dòng)對機(jī)體產(chǎn)生了明顯的干預(yù)作用。

如圖3所示，圖中每一個(gè)點(diǎn)都對應(yīng)一個(gè)代謝物基于VIP值的分布情況，與原點(diǎn)距離越大的點(diǎn)其貢獻(xiàn)率和可信度越高、VIP值越大。由圖3可知，部分點(diǎn)明顯與其他多數(shù)點(diǎn)分離，離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的即為顯著性差異代謝物（VIP值＞1）。

圖3 OPLS-DA模型的S-Plots圖Fig.3 S-Plots of OPLS-DA models

2.3 安靜狀態(tài)下兩組差異代謝物、抗氧化指數(shù)及血乳酸質(zhì)量濃度的變化

如表3所示，安靜狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)組與對照組有15 種代謝差異物，其中實(shí)驗(yàn)組中纈氨酸、β-羥基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甜菜堿（betaine，Bet）、乙酰乙酸、甘氨酸、葡萄糖、酪氨酸、丙氨酸及肌酸相對含量顯著升高（P＜0.05），甘油、苯丙氨酸、組氨酸及乳酸相對含量顯著降低（P＜0.05）。說明在安靜狀態(tài)下，補(bǔ)充蝦青素對人體的部分代謝產(chǎn)物有顯著影響。為進(jìn)一步證明這一觀點(diǎn)，進(jìn)行了代謝通路分析。

表3 安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組組血清差異代謝物的篩選Table 3 Screening of serum differential metabolites between experimental and control groups in quiet state

將上述15 種差異代謝物輸入MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫，對其所涉及的代謝通路進(jìn)行權(quán)重分析，構(gòu)建與補(bǔ)充蝦青素相關(guān)的代謝通路分析圖，設(shè)立P＜0.05、代謝通路影響因子（pathway impact）大于0.2的臨界點(diǎn)。如表4和圖4所示，安靜狀態(tài)下受蝦青素影響的代謝通路共有3 條。其中代謝差異物肌酸、Bet和甘氨酸涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路；乙酰乙酸及β-羥基丁酸涉及酮體的合成和降解通路；丙氨酸、谷氨酸及谷氨酰胺涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。

表4 安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組的通路分析結(jié)果Table 4 Results of pathway analysis for differential metabolites between experimental group and control group in quiet state

圖4 安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組的通路分析結(jié)果Fig.4 Results of pathway analysis for differential metabolites between experimental and control groups in quiet state

由表5可知，在補(bǔ)充蝦青素前，對照組與實(shí)驗(yàn)組機(jī)體抗氧化指數(shù)、血乳酸質(zhì)量濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對照組在服用安慰劑前后機(jī)體抗氧化指數(shù)、血乳酸質(zhì)量濃度也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)充中等劑量蝦青素28 d后，機(jī)體抗氧化指數(shù)顯著升高（P＜0.05），同時(shí)也顯著高于同期對照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組服用蝦青素后血乳酸質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），同時(shí)也顯著低于同期對照組（P＜0.05）。

表5 安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組抗氧化指數(shù)與血乳酸質(zhì)量濃度（n＝8）Table 5 Antioxidant capacity and blood lactate values in experimental and control groups in quiet state (n = 8)

2.4 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下兩組差異代謝物、抗氧化指數(shù)及血乳酸質(zhì)量濃度的變化

如表6所示，運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有3 種差異代謝物，其中補(bǔ)充蝦青素組的半胱氨酸和谷氨酰胺相對含量顯著升高（P＜0.05），甘油相對含量顯著下降（P＜0.05）。說明補(bǔ)充蝦青素對運(yùn)動(dòng)后的機(jī)體代謝有顯著影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)充蝦青素后運(yùn)動(dòng)涉及的代謝通路，將上述3 種差異代謝物輸入MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫，對其所涉及的代謝通路進(jìn)行權(quán)重分析，構(gòu)建與補(bǔ)充蝦青素相關(guān)的代謝通路分析圖，設(shè)立P＜0.05、代謝通路影響因子大于0.2的臨界點(diǎn)，結(jié)果如表7和圖5所示，急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后受蝦青素影響的代謝通路共有1 條，即代謝差異物谷氨酰胺涉及的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。

表6 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組相比對照組血清差異代謝物的篩選Table 6 Screening of serum different metabolites between experimental and control groups immediately after exercise

表7 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下對照組與實(shí)驗(yàn)組代謝差異物通路影響分析Table 7 Impact scores of metabolic pathways for differential metabolites between experimental and control groups

圖5 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組代謝差異物通路影響分析Fig.5 Impact scores of metabolic pathways for differential metabolites between experimental and control groups

由表8可知，兩組受試者在運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下機(jī)體的抗氧化指數(shù)均顯著下降（P＜0.05），但實(shí)驗(yàn)組平均值顯著高于對照組（P＜0.05）；兩組受試者血乳酸質(zhì)量濃度均顯著上升（P＜0.05），但實(shí)驗(yàn)組低于對照組（P＜0.05）。

表8 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組抗氧化指數(shù)與血乳酸質(zhì)量濃度的變化（n＝8）Table 8 Changes in antioxidant capacity and blood lactate values in experimental and control groups immediately after exercise (n = 8)

3 討 論

代謝組學(xué)是生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究方法之一，它從總體代謝物輪廓上進(jìn)行代謝機(jī)制研究，是將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)信息技術(shù)相結(jié)合的一種重要研究方法。近年來，代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域，從整體視角分析代謝物的變化，以期尋找準(zhǔn)確的作用靶點(diǎn)。在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域采用代謝組學(xué)方法進(jìn)行研究的報(bào)道還較少。但是已有研究表明蝦青素可在一定程度上逆轉(zhuǎn)某些代謝途徑的下調(diào)，并減少細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[18]。劇烈或持久運(yùn)動(dòng)可造成機(jī)體乳酸堆積，若不及時(shí)處理會(huì)使呈弱堿性的體液呈酸性，影響細(xì)胞的正常功能，造成肌肉酸痛、神情倦怠、頭痛惡心等癥狀。運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的乳酸含量就越少、清除乳酸的能力越強(qiáng)，所以乳酸監(jiān)控是提高運(yùn)動(dòng)成績的有效手段之一[19]。乳酸還可作為能量物質(zhì)和信號分子廣泛參與腫瘤發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)，它可為腫瘤發(fā)生發(fā)展提供能量，也可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能向有利于疾病進(jìn)展的方向轉(zhuǎn)化從而加重病理進(jìn)程[20]。本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，研究補(bǔ)充蝦青素對人體在安靜狀態(tài)下及間歇性急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血清小分子代謝物的影響，結(jié)合機(jī)體抗氧化指數(shù)及血乳酸質(zhì)量濃度從代謝角度闡釋天然抗氧化物蝦青素對機(jī)體機(jī)能產(chǎn)生影響的作用途徑與機(jī)理。

3.1 安靜狀態(tài)下對照組與實(shí)驗(yàn)組代謝差異物分析

安靜狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異代謝物共有15 種，主要涉及3 條代謝通路，分別為肌酸、Bet及甘氨酸涉及的甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路；乙酰乙酸、β-羥基丁酸涉及的酮體合成與分解代謝通路；丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺涉及的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。

Bet是一種滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，也可調(diào)節(jié)機(jī)體腸道代謝，抑制脂肪合成[21]。在脂肪合成過程中，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）是主要的調(diào)節(jié)劑，也是脂肪生成的限速酶。ACC產(chǎn)生丙二乙酰輔酶A是脂肪分解抑制劑，而脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是催化脂肪生成反應(yīng)的最后步驟。有研究報(bào)道，補(bǔ)充Bet可以顯著降低ACC和FAS的活性并降低FAS mRNA的表達(dá)[22]，且Bet由甘氨酸甲基化生成，血清甘氨酸水平與肥胖呈負(fù)相關(guān)[23]，被認(rèn)為是脂肪代謝供能比例上調(diào)的標(biāo)志物[24]。甘氨酸還是一種全身炎癥級聯(lián)調(diào)節(jié)劑[25]，能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、減少炎性因子合成、抵抗氧化應(yīng)激[26]，還可與精氨酸、甲硫氨酸共同合成肌酸。肌酸既可由人體自行合成，也可從食物中攝取，能夠快速再合成ATP以供給機(jī)體能量。此外，它還可增長肌肉、增加力量、加快疲勞恢復(fù)。本研究中安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組血清Bet、甘氨酸和肌酸含量升高，表明補(bǔ)充蝦青素可能通過調(diào)節(jié)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路來改變機(jī)體脂肪代謝等能量代謝。

除上述作用外，甘氨酸也參與血管內(nèi)皮生長因子通過激活mTOR信號途徑介導(dǎo)增強(qiáng)線粒體供能的過程[27]。并且甘氨酸可直接與電壓依賴性陰離子通道蛋白1（voltage dependent anion channel protein 1，VDAC1）結(jié)合，抑制VDAC1在人體中高度表達(dá)，控制腺嘌呤核苷酸、Ca2+和其他代謝物進(jìn)出線粒體[28]。一般情況下當(dāng)機(jī)體攝入脂肪過多、糖代謝受陰或糖代謝供能無法滿足機(jī)體能量代謝需要時(shí)血液中游離脂肪酸通過β氧化會(huì)使機(jī)體酮體水平升高[29-30]。有報(bào)道稱蝦青素能下調(diào)參與脂肪生成和脂質(zhì)攝取的基因，而不影響肝臟中脂肪酸氧化相關(guān)基因[31]。也有研究表明補(bǔ)充蝦青素可以降低肝臟中甘油三酯和膽固醇水平[32]。Jia Yaoyao等[33]研究指出蝦青素可以誘導(dǎo)脂肪酸分解代謝，其中氨?；o酶A氧化酶基因是過氧化物酶體增殖劑激活受體α的靶基因，蝦青素可以激活?；o酶A氧化酶1、棕櫚酰基因來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞線粒體中的β氧化。本研究中實(shí)驗(yàn)組在安靜狀態(tài)下抗氧化指數(shù)、甘氨酸含量高于對照組，血乳酸質(zhì)量濃度低于對照組，表明補(bǔ)充蝦青素可能通過甘氨酸影響線粒體的功能，從而導(dǎo)致甘油和酮體代謝變化，而安靜狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組比對照組血清中β-羥基丁酸和乙酰乙酸水平顯著升高（P＜0.05），表明人體在空腹安靜狀態(tài)下補(bǔ)充蝦青素確實(shí)促進(jìn)了脂肪分解，可能是由于氧蝦青素提高了機(jī)體的抗氧化能力，改善了線粒體功能，進(jìn)而也減少了乳酸生成。

谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸共同參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。谷氨酰胺是合成α-酮戊二酸的重要原料，而α-酮戊二酸可在一定程度上降低應(yīng)激狀態(tài)下炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6等的水平。研究表明，L-谷氨酰胺可通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽相關(guān)氧化還原穩(wěn)態(tài)及增強(qiáng)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A介導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞代謝來抑制4-羥基-2-壬烯酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[34]。谷氨酸是合成谷氨酰胺的前體物質(zhì)，是一類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于大部分皮層突觸中，參與多種生理病理過程[35]。本研究中實(shí)驗(yàn)組血清谷氨酸、谷氨酰胺水平均上升，提示蝦青素還可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸、谷氨酰胺代謝發(fā)揮抗炎作用。丙氨酸由谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）將來自谷氨酸的α-氨基轉(zhuǎn)移至丙酮酸形成丙氨酸。有研究表明，補(bǔ)充蝦青素可提高中華絨螯蟹血中GPT的活性[36]。在骨骼肌中，丙氨酸和葡萄糖可通過“丙氨酸-葡萄糖循環(huán)”不斷在肝臟和肌肉之間轉(zhuǎn)變，將骨骼肌釋放的丙氨酸用作肝臟中糖異生的底物[37]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中外源性補(bǔ)充丙氨酸有利于減輕神經(jīng)肌肉疲勞、延長力竭時(shí)間、改善運(yùn)動(dòng)能力[38]。本研究中實(shí)驗(yàn)組谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），表明補(bǔ)充蝦青素可影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，促進(jìn)谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸生成，起到抗炎、增加肝臟糖異生底物含量的作用，同時(shí)由于乳酸生成減少，表明補(bǔ)充蝦青素可能通過促進(jìn)丙氨酸生成起到減少酸性物質(zhì)產(chǎn)生、改善機(jī)體機(jī)能的作用。

3.2 運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組差異代謝物分析

運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組相比對照組血清差異代謝物主要有半胱氨酸、谷氨酰胺和甘油。實(shí)驗(yàn)組血清甘油相對含量顯著低于對照組（P＜0.05），表明補(bǔ)充蝦青素促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)過程中脂肪分解產(chǎn)物的消耗。有研究表明蝦青素補(bǔ)充還具有下調(diào)運(yùn)動(dòng)機(jī)體骨骼肌及心肌Nrf2與Nrf2依賴性酶的轉(zhuǎn)錄，降低血漿、肌肉中丙二醛含量等作用[39]。半胱氨酸作為生糖氨基酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可轉(zhuǎn)化為?；撬岷凸入赘孰摹Ｅ；撬崾羌?xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和骨骼肌功能的調(diào)節(jié)劑[40]。?；撬峥山档捅┧讲⒕S持滲透壓[24,41]，可在低滲條件下對滲透感覺神經(jīng)元的激發(fā)速率起到強(qiáng)大抑制作用[42]；可通過抑制氧化應(yīng)激、恢復(fù)線粒體膜電位以及線粒體產(chǎn)生ATP的功能，以降低由丙二醛誘導(dǎo)的死亡率[43]。李植等研究發(fā)現(xiàn)800 m跑后運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)牛磺酸的濃度顯著下降并認(rèn)為?；撬峥赡軈⑴c體內(nèi)氧化物的清理[44]。Batitucci等研究發(fā)現(xiàn)高水平游泳運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充?；撬? 周有助于乳酸代謝[45]。本研究中對照組血清半胱氨酸水平在運(yùn)動(dòng)后下降可能是由于其參與了能量代謝及牛硫酸和谷胱甘肽的生成，而實(shí)驗(yàn)組蝦青素通過直接清除自由基并促進(jìn)脂肪代謝，減少了半胱氨酸的消耗，使實(shí)驗(yàn)組血清半胱氨酸水平顯著高于對照組。

對運(yùn)動(dòng)后即刻狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行富集化分析后發(fā)現(xiàn)，影響得分最高的通路為谷氨酰胺相關(guān)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。谷氨酰胺是血漿和骨骼肌中最豐富的氨基酸，其合成、儲(chǔ)存與釋放的主要組織是骨骼肌。谷氨酰胺具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)嘌呤與嘧啶合成、抗氧化與抗炎等特性，還具有調(diào)節(jié)熱激蛋白合成的作用，被認(rèn)為是對運(yùn)動(dòng)員十分有益的補(bǔ)充劑[46]。谷氨酰胺也是淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、巨噬細(xì)胞吞噬作用以及分泌活性物質(zhì)及嗜中性白細(xì)胞殺死細(xì)菌的必需營養(yǎng)素，故谷氨酰胺被認(rèn)為是“免疫系統(tǒng)的燃料”。在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，免疫細(xì)胞對谷氨酰胺的消耗速率與機(jī)體對葡萄糖的消耗速率相似或更高[47]。谷氨酰胺在體內(nèi)還可參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)血氨和乳酸水平、合成谷胱甘肽，提高機(jī)體的抗氧化能力[48-50]。有研究表明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致肌肉中谷氨酸含量急劇升高，是血清中谷氨酸的200 倍，同時(shí)對血清中谷氨酰胺的消耗也急劇增加[51]。但是，持續(xù)14 d每天補(bǔ)充0.3 g/kgmb的谷氨酰胺可有效提高運(yùn)動(dòng)后的谷胱甘肽水平，減輕氧化應(yīng)激，并防止運(yùn)動(dòng)損傷[52]。谷胱甘肽已被證實(shí)是機(jī)體減少氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)之一，谷氨酰胺的抗氧化作用可能是通過合成谷胱甘肽來發(fā)揮的[53]。運(yùn)動(dòng)后機(jī)體免疫力下降、發(fā)生氧化損傷可能與谷氨酰胺的運(yùn)動(dòng)消耗有關(guān)。李植等的研究表明運(yùn)動(dòng)后谷氨酰胺水平顯著下降并與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間成正相關(guān)[44]。

馬海峰等的研究表明，在進(jìn)行高強(qiáng)度力量訓(xùn)練時(shí)，機(jī)體內(nèi)谷氨酰胺水平可能下降達(dá)50%，訓(xùn)練強(qiáng)度越大，谷氨酰胺流失的速度越快，若得不到及時(shí)補(bǔ)充肌肉就會(huì)發(fā)生分解，以滿足機(jī)體對谷氨酰胺的需求，從而影響肌肉體積，同時(shí)由于免疫系統(tǒng)的谷氨酰胺主要來源于骨骼肌的釋放，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降[54]。Koo等的研究表明，預(yù)先7 d每天補(bǔ)充6 g谷氨酰胺可促進(jìn)人體急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期血液中氨、磷和肌酸激酶濃度的降低，進(jìn)而促進(jìn)疲勞恢復(fù)，同時(shí)還可增加白細(xì)胞介素1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)而增強(qiáng)人體的免疫功能[55]。本研究中實(shí)驗(yàn)組谷氨酰胺、半胱氨酸水平和抗氧化指數(shù)明顯高于對照組，血乳酸質(zhì)量濃度顯著低于對照組（P＜0.05），表明蝦青素起到了抗氧化作用，減少了谷氨酰胺、半胱氨酸參與谷胱甘肽合成及運(yùn)動(dòng)造成的流失，它們與蝦青素協(xié)同作用，明顯抑制了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的乳酸生成，進(jìn)而起到延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

綜上，蝦青素補(bǔ)充可造成人體急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)前后血液代謝物改變，主要涉及人體氨基酸代謝、脂代謝相關(guān)通路，這些代謝物的改變可能是補(bǔ)充蝦青素機(jī)體抗氧化能力提高、運(yùn)動(dòng)能力提高的內(nèi)在機(jī)制。