劉佳宜，李婷婷*，勵(lì)建榮,*，謝 晶，林 洪，王 轟，申照華，郭曉華

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；5.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 265600；6.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276800）

微生物是在加工、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中引起食物腐敗的重要因素，食品中的微生物利用食物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)自身的生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致食品的腐敗變質(zhì)[1-2]。Gram等[3]將微生物的腐敗潛力定義為純培養(yǎng)條件下產(chǎn)生與特定產(chǎn)品腐敗相關(guān)代謝物的能力。許多細(xì)菌能夠在自身分泌的化學(xué)信號(hào)分子即自誘導(dǎo)分子的調(diào)控下，以細(xì)菌種群密度來(lái)調(diào)節(jié)表型特征，當(dāng)自誘導(dǎo)分子水平隨著細(xì)菌密度逐漸增高至某一閾值后，會(huì)與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合，從而誘導(dǎo)或抑制某些基因的表達(dá)，這種細(xì)菌行為被稱(chēng)為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[4]。這些自誘導(dǎo)分子在革蘭氏陽(yáng)性菌中被鑒定為寡肽，在革蘭氏陰性菌中被鑒定為酰基化高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）[5]。研究表明，細(xì)菌的許多生理功能均由QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)，如生物發(fā)光、毒力因子、能動(dòng)性、生物被膜的形成等[6]。

我國(guó)作為水產(chǎn)品生產(chǎn)和銷(xiāo)售大國(guó)，水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界的70%，其出口額已連續(xù)6 年位居世界第一[7]。水產(chǎn)品中含有大量的水分和豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，這使其較一般生鮮食品更易受到微生物侵染[8]，因此QS系統(tǒng)在水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)過(guò)程中起著重要作用。氣單胞菌屬（Aeromonassp.）為革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，以運(yùn)動(dòng)型桿菌為主。該屬迄今已確認(rèn)30 個(gè)種，其中嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）等與人類(lèi)和動(dòng)物感染及食品腐敗關(guān)系密切[9]，相關(guān)研究較多。殺鮭氣單胞菌是多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的主要水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌，同時(shí)也是冰藏魚(yú)類(lèi)中的腐敗菌，其腐敗活性受自身分泌AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控。因此，抑制QS系統(tǒng)成為水產(chǎn)品保鮮研究的新方向。

QS抑制劑是以QS系統(tǒng)為靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制該系統(tǒng)，在不殺死或不干擾細(xì)菌正常生命活動(dòng)的前提下有效調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)和功能，抑制細(xì)菌生物被膜和毒力因子的產(chǎn)生以及其他致腐、致病基因的表達(dá)，具有更好的生態(tài)安全性和環(huán)境友好性[10]。與傳統(tǒng)抗菌劑相比，QS抑制劑不會(huì)殺死細(xì)菌或陰滯細(xì)菌的生長(zhǎng)，被認(rèn)為不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的形成。據(jù)報(bào)道，肉桂醛揮發(fā)油成分及其類(lèi)似物對(duì)多種細(xì)菌具有QS抑制作用，通過(guò)降低LuxR家族蛋白的DNA結(jié)合能力抑制受QS調(diào)控的毒力因子[11]。李晴等[12]報(bào)道花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌生物被膜、胞外蛋白酶活性和泳動(dòng)現(xiàn)象的抑制作用呈濃度依賴(lài)性，且能顯著抑制嗜水氣單胞菌AHLs的產(chǎn)生，推測(cè)花椒提取物可能通過(guò)降低AHLs水平抑制嗜水氣單胞菌QS系統(tǒng)調(diào)控基因的表達(dá)。但是天然QS抑制劑提取率差、操作過(guò)于復(fù)雜，并且提取所得單體物質(zhì)在一定劑量下的安全性有待商榷，因此還沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。

乙基麥芽酚是一種人工合成的廣譜高效增香劑，常用于肉制品、罐頭、糖果、餅干、面包、調(diào)味品等食品。乙基麥芽酚不但可以通過(guò)與肉中的氨基酸相互作用提高鮮味，而且可以與肌紅蛋白中的鐵離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，保持肉色。一些研究還表明，乙基麥芽酚具有抑酸、抑苦、去腥、防腐等功效[13]。因此，本研究以乙基麥芽酚為QS抑制劑，探究乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌QS現(xiàn)象的抑制作用，以期拓寬乙基麥芽酚的應(yīng)用范圍，使其成為以QS為靶點(diǎn)的新型水產(chǎn)品保鮮劑，同時(shí)為水產(chǎn)品保鮮提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

QS生物報(bào)告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum026，CV026）為C.violaceumATCC 31532的mini-Tn5突變體。該菌株自身不產(chǎn)生AHLs信號(hào)分子，且對(duì)卡那霉素不敏感，當(dāng)添加外源AHLs時(shí)，會(huì)產(chǎn)生紫色桿菌素，通過(guò)顏色變化可檢測(cè)短鏈AHLs信號(hào)分子（N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-butyryl-L-homoserine lactone，C4-HSL）～C8-HSL）的存在。殺鮭氣單胞菌由腐敗大菱鲆中分離獲得。上述兩種菌株均由遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，在28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)。

乙基麥芽酚（純度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；卡那霉素、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AHLs信號(hào)分子（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國(guó)Sigma公司；結(jié)晶紫 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、冰乙酸、濃硫酸、醋酸異戊酯、苯酚 天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；脫脂奶粉 美國(guó)BD公司；瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、D(+)-葡萄糖 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉 天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；鋅片上海邁砷化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

W-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Czone系列抑菌圈測(cè)定及菌落計(jì)數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；iMark酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；SS-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；7890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度測(cè)定及QS抑制劑初步檢測(cè)

參考魏宇超等[14]的方法并稍加修改。利用牛津杯打孔法測(cè)定乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌的最小抑菌濃度。將菌株CV026和殺鮭氣單胞菌按體積比2∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，過(guò)夜活化至二代，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后與LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂混勻，用牛津杯打孔。利用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液配制不同質(zhì)量濃度（0～10 mg/mL）乙基麥芽酚溶液，并過(guò)0.22 μm濾膜除菌備用。待LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，將不同質(zhì)量濃度（0～10 mg/mL）乙基麥芽酚溶液加入孔中，并添加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為陰性對(duì)照。將平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1～2 d，觀察CV026和殺鮭氣單胞菌菌落生長(zhǎng)情況確定乙基麥芽酚最小抑菌濃度。

將CV026按體積比2∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，過(guò)夜活化至二代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將菌液以體積比1∶100混入200 mL含20 μg/mL卡那霉素的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，并添加20 μg/mL C6-HSL混勻后倒板，待其凝固后牛津杯打孔。將100 μL亞抑菌濃度的乙基麥芽酚溶液加入孔中，以100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇作為陰性對(duì)照。將平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1～2 d，觀察乙基麥芽酚對(duì)紫色桿菌素生成的抑制情況。

1.3.2 乙基麥芽酚處理后CV026生長(zhǎng)情況分析及紫色桿菌素產(chǎn)量的測(cè)定

參照Z(yǔ)hang Ying等[15]的方法并略加修改。取過(guò)夜活化2 次、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CV026，以體積比1∶100接種于10 mL含20 μg/mL C6-HSL的LB肉湯中，添加乙基麥芽酚使其終質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL。并以添加100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液為陰性對(duì)照，置于28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h。利用酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液密度，確定乙基麥芽酚對(duì)CV026生長(zhǎng)的影響。向1.5 mL離心管中依次添加300 μL上述培養(yǎng)后的菌液，加入150 μL 10 g/100 mL SDS溶液振蕩裂解10 s，再加入600 μL正丁醇振蕩5 s提取紫色桿菌素。最后于10 000 r/min離心5 min，依次吸取離心后上清液于96 孔板中，利用酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液OD值，每處理組取3 個(gè)平行。

1.3.3 乙基麥芽酚處理后殺鮭氣單胞菌信號(hào)分子產(chǎn)生量的測(cè)定

AHLs粗提液制備：將殺鮭氣單胞菌過(guò)夜活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以體積比為1∶100接種于LB肉湯中，添加終質(zhì)量濃度0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL乙基麥芽酚溶液，并以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為陰性對(duì)照，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的菌液10 000 r/min離心10 min，留上清液。加入等體積含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸的乙酸乙酯溶液提取，取乙酸乙酯層加入一定量的無(wú)水硫酸鈉，于35 ℃、真空度0.1 MPa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，取適量甲醇溶解殘留物，-20 ℃保存待用。

GC-MS測(cè)定：以甲醇為溶劑配制6 種AHLs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定參數(shù)參考梅永超等[16]的方法，根據(jù)信號(hào)分子保留時(shí)間定性，以峰面積大小表示信號(hào)分子產(chǎn)生量。

1.3.4 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜的影響分析

1.3.4.1 乙基麥芽酚處理后殺鮭氣單胞菌生物被膜形成率的測(cè)定

參考Bouyahya[17]和Lee[18]等的方法并稍加修改。將過(guò)夜活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的殺鮭氣單胞菌以體積比為1∶100接種于LB肉湯，加入乙基麥芽酚溶液，使其終質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL，分別以100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液和終質(zhì)量濃度20 μg/mL C12-HSL信號(hào)分子為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。利用酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液密度，確定乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的影響。

取1 mL上述培養(yǎng)液分裝于1.5 mL無(wú)菌離心管中，28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。取菌液于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值后，棄去菌液，用無(wú)菌水清洗3 次，無(wú)菌風(fēng)干燥30 min，使生物被膜固定在離心管內(nèi)壁后，取1 mL 0.2 g/100 mL結(jié)晶紫染色15 min。棄去染色液，無(wú)菌水清洗3～5 次至干凈透明，再用體積分?jǐn)?shù)33%冰乙酸溶解固定的染色液，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處冰乙酸溶解后染色液的OD值，每處理組取3 個(gè)平行。生物被膜的相對(duì)形成率按下式計(jì)算。

1.3.4.2 乙基麥芽酚處理后殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的觀察

參考Chang Aiping等[19]的方法并稍加修改。將經(jīng)拋光機(jī)除去表面氧化層的鋅片剪成10 mm×10 mm，先后置于無(wú)水乙醇和去離子水中超聲30 min，烘干后滅菌備用。將10 mL含終質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL乙基麥芽酚的LB肉湯加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并將經(jīng)2 次過(guò)夜活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的殺鮭氣單胞菌以體積比為1∶100接種其中，混勻后放入滅菌鋅片，28 ℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h。分別以100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液和終質(zhì)量濃度20 μg/mL的C12-HSL信號(hào)分子為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

培養(yǎng)72 h后取出鋅片，無(wú)菌水沖洗3～5 次，放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出鋅片后用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液梯度洗脫，無(wú)水乙醇脫水2 次后，經(jīng)乙酸異戊酯置換2 次，無(wú)菌風(fēng)干燥。噴金處理后掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.5 乙基麥芽酚處理后殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活力的測(cè)定

將過(guò)夜活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的殺鮭氣單胞菌以體積比1∶100接種于含終質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL乙基麥芽酚的肉湯中，分別以100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液和100 μL終質(zhì)量濃度20 μg/mL的C12-HSL信號(hào)分子為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h以產(chǎn)生胞外蛋白酶。培養(yǎng)結(jié)束后用無(wú)菌濾器過(guò)濾菌液，取濾液待用。根據(jù)Abinaya等[20]的方法配制牛奶瓊脂固體培養(yǎng)基，待其凝固后用預(yù)先滅菌的牛津杯打孔，取200 μL上述濾液于孔中，平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，每處理組制作3 個(gè)平行，觀察并測(cè)量透明圈直徑。

殺鮭氣單胞菌是一種運(yùn)動(dòng)細(xì)菌，能在軟表面、微硬表面和成群半固體表面泳動(dòng)[21]。參考文獻(xiàn)[22]的方法配制群集、泳動(dòng)培養(yǎng)基。群集培養(yǎng)基配方：1 g/100 mL蛋白胨、0.5 g/100 mL氯化鈉、0.5 g/100 mLD(+)-葡萄糖、0.5 g/100 mL瓊脂粉。泳動(dòng)培養(yǎng)基配方：1 g/100 mL胰蛋白胨、0.5 g/100 mL氯化鈉、0.3 g/100 mL瓊脂粉。將5 μL過(guò)夜活化至二代、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的殺鮭氣單胞菌分別加入含終質(zhì)量濃度0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL乙基麥芽酚的群集、泳動(dòng)培養(yǎng)基中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌風(fēng)吹干后放入28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每處理組取3 個(gè)平行，測(cè)量其運(yùn)動(dòng)遷移直徑。分別以100 μL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液和終質(zhì)量濃度20 μg/mL的C12-HSL信號(hào)分子為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；運(yùn)用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙基麥芽酚最小抑菌濃度的確定及QS抑制劑初步檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)觀察不同質(zhì)量濃度（0～10 mg/mL）乙基麥芽酚對(duì)菌株CV026和殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，乙基麥芽酚對(duì)CV026的最小抑菌濃度為0.1 mg/mL。由圖1A可看出，經(jīng)0.1 mg/mL乙基麥芽酚處理后的孔周?chē)霈F(xiàn)不透明、渾濁的白色抑制圈，表明在不抑制CV026正常生長(zhǎng)的前提下，乙基麥芽酚能夠抑制CV026紫色桿菌素的產(chǎn)生。這說(shuō)明乙基麥芽酚能通過(guò)干擾QS報(bào)告菌株CV026的QS系統(tǒng)，進(jìn)而影響紫色桿菌素的產(chǎn)生。同時(shí)，如圖1B所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mg/mL的乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)同樣無(wú)抑制作用。因此，選取0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL作為乙基麥芽酚對(duì)CV026和殺鮭氣單胞菌的亞抑菌質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 乙基麥芽酚對(duì)CV026產(chǎn)紫色桿菌素（A）和殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)（B）的抑制活性Fig.1 Inhibitory effect of ethyl maltol against violacein production in strain CV026 (A) and growth of Aeromonas salmonicida (B)

2.2 乙基麥芽酚對(duì)CV026生長(zhǎng)及紫色桿菌素產(chǎn)生量的影響

由圖2可知，在亞抑菌質(zhì)量濃度下，隨著乙基麥芽酚質(zhì)量濃度增加，CV026的紫色桿菌素產(chǎn)生量逐漸下降，并且對(duì)CV026菌液OD595nm幾乎無(wú)影響。與陰性對(duì)照相比，乙基麥芽酚質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，CV026紫色桿菌素產(chǎn)生量下降約71.55%，且下降幅度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明，亞抑菌濃度下乙基麥芽酚不會(huì)干擾CV026的正常生長(zhǎng)，其降低CV026產(chǎn)生紫色桿菌素的能力是通過(guò)干擾CV026的QS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 乙基麥芽酚對(duì)CV026菌株菌液OD595 nm和紫色桿菌素產(chǎn)生量的影響Fig.2 Effect of ethyl maltol on bacterial density and violacein production of strain CV026

2.3 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌信號(hào)分子產(chǎn)生量的影響

圖4 GC-MS測(cè)定殺鮭氣單胞菌信號(hào)分子AHLs類(lèi)型Fig.4 GC-MS profile of AHLs from Aeromonas salmonicida

由圖3、4可知，6 種AHLs信號(hào)分子混合標(biāo)準(zhǔn)品分離效果良好、峰形尖銳；殺鮭氣單胞菌所分泌信號(hào)分子的保留時(shí)間為11.334 min，由此確定其為C12-HSL。由圖5可知，隨著乙基麥芽酚質(zhì)量濃度的增加，C12-HSL峰面積逐漸減小，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。結(jié)果表明，乙基麥芽酚可以抑制殺鮭氣單胞菌的長(zhǎng)鏈AHLs產(chǎn)生量，結(jié)合2.2節(jié)中乙基麥芽酚對(duì)CV026紫色桿菌素產(chǎn)生量的抑制作用，推測(cè)乙基麥芽酚既可以干擾CV026由外源短鏈AHLs所介導(dǎo)的QS系統(tǒng)，又對(duì)殺鮭氣單胞菌所分泌的長(zhǎng)鏈AHLs信號(hào)分子具有抑制效果。

圖3 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖Fig.3 GC-MS profile of mixed AHLs standard

圖5 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌AHLs產(chǎn)生量的影響Fig.5 Effect of ethyl maltol on the production of AHLs from Aeromonas salmonicida

2.4 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜的影響

2.4.1 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形成量的影響生物被膜是細(xì)菌的一種自我保護(hù)性生長(zhǎng)方式，是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，通過(guò)分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）使細(xì)菌包裹在其中，進(jìn)而不斷繁殖形成的大量細(xì)菌聚集膜。細(xì)菌生物被膜的形成一般分為3 個(gè)階段：首先，細(xì)菌通過(guò)鞭毛或菌毛等初始吸附于物體表面[23]；然后，當(dāng)細(xì)菌附著在生物或非生物表面并穩(wěn)定后，細(xì)菌開(kāi)始分泌EPS，這是一個(gè)不可逆的過(guò)程，EPS連續(xù)復(fù)制直到生物被膜完全成熟，完全成熟的生物被膜呈三維塔狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部由小通道組成，可輸送養(yǎng)分、水和廢物[24]；最后，生物被膜內(nèi)的細(xì)菌繁殖產(chǎn)生不同的糖化酶，并上調(diào)鞭毛形成相關(guān)蛋白的表達(dá)，幫助細(xì)菌釋放[25]。肖夢(mèng)圓等[26]報(bào)道了QS抑制劑能夠抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌信號(hào)分子合成，從而干擾細(xì)菌生物被膜的形成。

由圖6可知，亞抑菌質(zhì)量濃度的乙基麥芽酚在不影響殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的前提下，能有效抑制其生物被膜的形成，且呈濃度依賴(lài)性。相比于陰性對(duì)照，0.08 mg/mL乙基麥芽酚處理的殺鮭氣單胞菌生物被膜相對(duì)形成率僅為28.8%，抑制率達(dá)71.2%，添加信號(hào)分子C12-HSL的陽(yáng)性對(duì)照生物被膜相對(duì)形成率達(dá)到128.67%。由此可以看出，乙基麥芽酚可以通過(guò)干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的形成。

圖6 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形成的影響Fig.6 Effect of ethyl maltol on biofilm formation of Aeromonas salmonicida

2.4.2 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

利用掃描電子顯微鏡觀察不同亞抑菌質(zhì)量濃度乙基麥芽酚處理殺鮭氣單胞菌形成的生物被膜形態(tài)。由圖7可知，陰性對(duì)照組的生物被膜覆蓋整張鋅片，且結(jié)構(gòu)均勻致密，出現(xiàn)一定的堆疊現(xiàn)象；而陽(yáng)性對(duì)照組中生物被膜形態(tài)不僅結(jié)構(gòu)致密粗糙，而且堆疊狀態(tài)加深、厚度增加，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜；添加乙基麥芽酚的殺鮭氣單胞菌形成的生物被膜逐漸稀松，表面粗糙度隨質(zhì)量濃度的增大而降低，并且出現(xiàn)不同程度的破裂。乙基麥芽酚質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，殺鮭氣單胞菌生物被膜覆蓋率大大降低，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單疏松。這與上述酶標(biāo)法測(cè)定生物被膜相對(duì)形成率結(jié)果一致，印證了乙基麥芽酚可降低殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成能力。

活動(dòng)引導(dǎo)式教學(xué)模式改變了傳統(tǒng)的“灌輸式”教學(xué)模式,這種教學(xué)模式能夠很好地啟發(fā)學(xué)生思維,突顯以學(xué)生為中心的教學(xué)理念,對(duì)現(xiàn)階段我國(guó)全方位進(jìn)行的教學(xué)改革具有重要意義。在倡導(dǎo)素質(zhì)教育、創(chuàng)新性人才培養(yǎng)大形勢(shì)下,應(yīng)該給以足夠的重視,并加以推廣。

圖7 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響Fig.7 Effect of ethyl maltol on biofilm morphology of Aeromonas salmonicida

2.5 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、游離氨基酸等，這些成分為微生物生長(zhǎng)繁殖提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)，使得含有豐富蛋白酶的腐敗微生物在其中大量繁殖，導(dǎo)致水產(chǎn)品喪失原有的風(fēng)味和品質(zhì)，最終腐敗變質(zhì)[27]。由表1可知，亞抑菌質(zhì)量濃度下隨著乙基麥芽酚質(zhì)量濃度的增大，胞外蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水解圈直徑逐漸減小，0.08 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)69.1%。同時(shí)，當(dāng)添加外源信號(hào)分子C12-HSL時(shí)，胞外蛋白酶水解圈直徑與陰性對(duì)照組相比明顯增大。由此可以看出，殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性是由AHLs所介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控，并且乙基麥芽酚通過(guò)干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)抑制其胞外蛋白酶活性。

表1 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Table 1 Effect of ethyl maltol on extracellular protease activity of Aeromonas salmonicida

2.6 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌群集和泳動(dòng)的影響

細(xì)菌的主要運(yùn)動(dòng)方式有群集、泳動(dòng)、滑行和蹭行，且主要通過(guò)鞭毛和菌毛實(shí)現(xiàn)。其中，群集是由鞭毛和菌毛在半固體環(huán)境中介導(dǎo)的一種運(yùn)動(dòng)方式，而泳動(dòng)是由鞭毛單獨(dú)介導(dǎo)的一種單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方式[28]。丁莉莎等[29]報(bào)道了運(yùn)動(dòng)缺陷型細(xì)菌形成生物被膜的能力會(huì)下降，即細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性與生物被膜的形成能力呈正相關(guān)，并且其運(yùn)動(dòng)性也是由QS系統(tǒng)起主要調(diào)控作用。

圖9 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌泳動(dòng)的影響Fig.9 Effect of ethyl maltol on swimming motility of Aeromonas salmonicida

由圖8、9可知，隨乙基麥芽酚質(zhì)量濃度的增加，殺鮭氣單胞菌群集和泳動(dòng)遷移直徑與陰性對(duì)照相比均呈逐漸減小的趨勢(shì)。當(dāng)乙基麥芽酚質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，殺鮭氣單胞菌的群集及泳動(dòng)的遷移直徑均僅約10 mm，分別較陰性對(duì)照組減少80.4%和82.1%。說(shuō)明在此質(zhì)量濃度下殺鮭氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力極微弱。當(dāng)添加C12-HSL信號(hào)分子時(shí)，殺鮭氣單胞菌的遷移直徑明顯增大。這與2.4節(jié)中乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜的抑制作用結(jié)果一致。

圖8 乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌群集的影響Fig.8 Effect of ethyl maltol on swarming motility of Aeromonas salmonicida

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定乙基麥芽酚對(duì)QS報(bào)告菌CV026的紫色桿菌素產(chǎn)生情況的影響，并探究乙基麥芽酚對(duì)魚(yú)類(lèi)腐敗菌殺鮭氣單胞菌QS及其腐敗活性的抑制效果。GC-MS結(jié)果表明，乙基麥芽酚可以抑制殺鮭氣單胞菌分泌QS信號(hào)分子C12-HSL，結(jié)合乙基麥芽酚對(duì)CV026紫色桿菌素的抑制作用，進(jìn)一步確定了乙基麥芽酚對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)具有抑制作用。同時(shí)乙基麥芽酚對(duì)殺鮭氣單胞菌分泌C12-HSL所調(diào)控的腐敗表型，如生物被膜形成、胞外蛋白酶活性以及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性同樣存在抑制作用。0.08 mg/mL乙基麥芽酚處理殺鮭氣單胞菌的生物被膜相對(duì)形成率僅為陰性對(duì)照組的28.8%。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，乙基麥芽酚能夠有效破壞殺鮭氣單胞菌生物被膜結(jié)構(gòu)。由此證明，乙基麥芽酚具有良好的QS抑制性，有望成為一種以QS為靶點(diǎn)的安全高效的新型水產(chǎn)品保鮮劑。但是其作用機(jī)理還不明確，可以通過(guò)分子對(duì)接、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等手段進(jìn)一步驗(yàn)證其抑制機(jī)理。