劉海彬, 李增強

(1.遼寧科技學院 生物醫(yī)藥與化學工程學院，遼寧 本溪 117004；2.沈陽藥科大學 制藥工程學院，遼寧 沈陽 110016)

喹唑啉類化合物是一類具有較高生物活性的含氮雜環(huán)化合物，在醫(yī)藥和農藥領域有著廣泛的應用，其生物活性主要表現(xiàn)抗菌[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗真菌[5-6]、抗炎[7-8]、抗病毒[9]、抗驚厥[10]、抗HIV活性[11]等。研究發(fā)現(xiàn)，N-取代的4-氨基喹唑啉化合物通過與ATP的結合位點結合，能夠抑制表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化，從而表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用[12-14]。為了尋找高活性的先導化合物，設計合成了4-氨基喹唑林衍生物3(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型數(shù)字熔點儀(溫度計未經校正)；Bruker avance 600 MHz型核磁共振儀(TMS 為內標)；Thermo LCQ Fleet HPLC-MS型質譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮(1)的合成

稱取4,5-二甲氧基-2-氨基苯甲酸8.0 g(0.04 mol)溶解于100 mL無水乙醇中，在攪拌下加入醋酸甲脒8.4 g(0.08 mol)，加熱回流10 h，然后冷卻至室溫，用旋轉蒸發(fā)器旋去溶劑，加入50 mL飽和碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH=7～8，過濾，濾餅用少量水淋洗，得灰色粉末狀固體(1)7.89 g，產率94.3%。

(2)4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉(2)的合成

稱取6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮(1)6.44 g(0.0311 mol)溶解于155 mL二氯亞砜中，滴加3滴DMF，待完全溶后加熱回流1 h，冷卻至室溫，減壓蒸除二氯亞砜，得黃色固體。將黃色固體慢慢加入冰水中，用氨水調節(jié)其pH=7～8，過濾，干燥，得淡黃色固體(2)6.48 g，產率92.3 %。

(3)化合物3的合成(以3a的合成為例)

稱取20.50 g(2.2 mmol)溶解于22 mL異丙醇中，完全溶解后加入乙醇胺0.15 g(2.4 mmol)，于90 ℃回流5 h，冷卻至室溫，減壓抽濾，干燥，用異丙醇重結晶得3a。

3a: 白色固體，產率63.5%，m.p.236.4～237.2 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 8.33(s, 1H), 7.96(s,J=4.8 Hz, 1H), 7.62(s, 1H), 7.09(s, 1H), 4.84(t,J=5.4 Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 3.89(s, 3H), 3.63(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.61(t,J=5.4 Hz, 2H); MS(ESI)m/z: 250.27{[M+H]+}。

3b: 黃色固體，產率52.4%，252.7～253.6 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.32(s, 1H), 8.87(s, 1H), 8.32(s, 1H), 8.05(t,J=1.8 Hz, 1 H), 7.79(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.49(d,J=8.4 Hz, 1 H), 7.46(t,J=7.8 Hz, 1 H), 7.35(s, 1H), 4.03(s, 3H), 4.01(s, 3H); MS(ESI)m/z: 360.35{[M+H]+}。

3c: 淺黃色固體，產率58.9%，247.3～248.7 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 12.92(s, 1H), 11.77(s, 1H), 8.89(s, 1H), 8.28(s, 1H), 7.83(d,J=1.8 Hz, 1H), 7.35(s, 1H), 6.85(d,J=1.8 Hz, 1H), 4.00(s, 3H), 3.99(s, 3H); MS(ESI)m/z: 272.28{([M+H]+}。

3d: 白色固體，產率95.3%，187.1～187.4 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.84(s, 1H), 8.82(s,1H), 8.42(s,1H), 7.78(d,J=9.6 Hz, 1 H), 7.56(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.54(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.43(s, 1H), 4.02(s, 3H), 4.01(s, 3H); MS(ESI)m/z: 378.36{[M+H]+}。

3e: 白色固體，產率89.75%，230.0～231.2 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.54(s, 1H), 8.62(s, 1H), 8.04(s, 1H), 7.46,(s, 1H), 7.19(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.12～7.09(m, 2H), 7.04(t,J=6.6 Hz, 1H), 4.09(s, 3H), 3.97(s, 3H), 2.22(s, 3H); MS(ESI)m/z: 296.32{[M+H]+}。

1.3 體外抗腫瘤活性測試

用MTT(四氮唑藍)比色法測試了化合物的體外培養(yǎng)腫瘤細胞的抑制活性。實驗所用腫瘤細胞株分別為人乳腺癌細胞(MCF-7)、人肺癌細胞(A549)和人前列腺癌細胞(PC-3)。樣品用DMSO溶解后，用培養(yǎng)基溶劑配成0.1、1.0、10和100 μmol/L不同濃度的溶液。將對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，以180 μL/孔接種到96孔板中，置于37 ℃、含5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。各個劑量的藥液加入96孔板中，每劑量3個復孔，放入培養(yǎng)箱中孵育72 h。然后加入配置好的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，每孔加100 μL的DMSO，使用酶標儀在492 nm處測光密度(OD)值。

1.4 分子對接實驗

利用AutoDockTools軟件，選取PDB數(shù)據(jù)庫中的DNA序列 d(CGATCG)(PDB: 1D12)[15]為模型，進行分子對接研究。去除PDB:1D12中的水分子、清潔蛋白等操作，3b及ADM(阿霉素)的三維結構均由Marvin Sketch構建，再將準備好的DNA序列與小分子化合物進行對接研究。

2 結果與討論

2.1 體外抗腫瘤活性

采用常規(guī)的MTT比色法，測試了3對人乳腺癌細胞(MCF-7)、人肺癌細胞(A549)和人前列腺癌細胞(PC-3)的體外抗腫瘤活性，并與ADM(阿霉素)進行了對照，結果見表1。從中可見，所合成的化合物對3種人腫瘤細胞的體外生長顯示不同的抑制作用，但遠遠低于對照藥ADM的抑制活性。3b對人肺癌細胞(A549)和人前列腺癌細胞(PC-3)顯示出弱的抑制活性，IC50值分別為43.686和32.157 μmol/L；3e對人肺癌細胞(A549)顯示出弱的抑制活性，IC50值為57.595 μmol/L。但5種化合物在最大濃度(10-4mol/L)時對于人口腔表皮樣癌細胞(KB)的抑制率均未達到50%，化合物3c和3d對3種癌細胞均無明顯的抑制活性。

表1 化合物3a～3e對MCF-7、A549和PC-3細胞的IC50值

2.2 分子對接

利用AutoDockTools軟件，對ADM和3b與DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)進行了分子對接?；衔?b與PDB: 1D12對接后的能量值為-5.69，ADM(阿霉素)的能量值為-6.35，對接結果顯示：本文設計并合成的化合物應具有一定的活性。同時，研究結果也獲得了3b與DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式圖，3b插入到了DNA序列的活性口袋中，這種作用方式與ADM和DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式較接近。而從對接方式顯示，進一步引入取代基，可能會獲得更加理想的化合物。

圖1 (a)ADM與DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式圖;(b)3b與DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式圖。

合成了5個4-氨基喹唑啉的化合物，經1H NMR和MS對其結構進行了表征。通過體外抗腫瘤活性實驗，發(fā)現(xiàn)目標化合物3b、3d和3e對人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549和人前列腺癌細胞PC-3表現(xiàn)出一定的抑制活性。分子對接結果顯示：3b和ADM 與DNA序列(PDB: 1D12)具有相近的能量值和類似的作用方式，也進一步證明了此類化合物具有一定的活性。