李應(yīng)娜，萬南微，陳永正*

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) a.藥學(xué)院；b.貴州省生物催化與手性藥物合成重點實驗室；c.貴州省綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000)

C—H鍵選擇性活化是構(gòu)建C—X鍵的有效策略[1-3]，該策略已成為向有機(jī)化合物中引入新功能基團(tuán)最直接的方法之一[4]。在有機(jī)化合物中常常存在化學(xué)性質(zhì)相似的C—H鍵[5]，且C—H鍵的解離能較高、極性小[6]，如何在溫和條件下實現(xiàn)C—H鍵的選擇性官能團(tuán)化是該策略的研究難點。在傳統(tǒng)的合成化學(xué)中，金屬催化法[7-10]和有機(jī)小分子催化法[11]都是C—H鍵選擇性活化官能團(tuán)化的重要路線，但該過程中涉及昂貴催化劑的使用，反應(yīng)條件苛刻，存在化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性控制難等問題。隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，可通過定向進(jìn)化技術(shù)賦予酶更多的催化功能，以P450單加氧酶為代表的生物催化方法在C—H鍵活化上取得了突破性的進(jìn)展[12-15]。本文綜述了近10年P(guān)450酶催化C—H鍵選擇性官能團(tuán)化方面的研究進(jìn)展。

P450酶，全稱細(xì)胞色素P450(cytochrome P450或CYP450)，因血紅素還原態(tài)與一氧化碳結(jié)合后在450 nm有特征吸收峰而得名[16-17]。P450是一類硫醇鹽蛋白的超家族酶類，亞鐵血紅素近端連接到保守的半胱氨酸(Cys)殘基上，遠(yuǎn)端則與反應(yīng)底物相結(jié)合進(jìn)行催化活化[18]。其廣泛存在于自然界的動植物、微生物體內(nèi)，是一類擁有多種催化功能的酶，可以實現(xiàn)不同底物的羥基化、氨基化等。除此之外，P450酶還影響植物中天然產(chǎn)物的活性，參與類固醇、萜烯類、維生素等復(fù)雜天然產(chǎn)物的合成，參與動物的新陳代謝以及人體內(nèi)藥物的分解代謝[19]。根據(jù)氨基酸序列的同源程度，其成員又依次分為家族和亞家族。根據(jù)自身能否實現(xiàn)亞鐵血紅素的輔酶循環(huán)又可將其分為自給型和非自給型。

醇類化合物是藥物、農(nóng)藥、聚合物和天然化合物的結(jié)構(gòu)單元，是多功能合成的中間體[20]。合成醇類化合物最直接有效的方法是C—H鍵直接氧化羥基化(直接將C—H鍵一步轉(zhuǎn)化為C—O鍵)[4]，符合綠色化學(xué)提倡的原子經(jīng)濟(jì)性。目前，已有許多文獻(xiàn)報道，將P450酶作為催化劑實現(xiàn)C—H鍵的羥基化[21-24]。

早在1995年，Dawson等[25]就報道將P450cam作為催化劑，催化樟腦1實現(xiàn)C—H鍵的羥基化生成樟腦醇2，但這一過程中該酶展現(xiàn)出底物普適性和兼容性差等局限。P450cam能高選擇性氧化(1R)-樟腦生成(1R)-5-羥基-樟腦作為唯一產(chǎn)物；當(dāng)?shù)孜飺Q成(1S)-樟腦時，除了生成主要產(chǎn)物(1S)-5-羥基-樟腦外，還會有少量的2,5-雙酮產(chǎn)物產(chǎn)生(Scheme 1)。

Scheme 1

自二十世紀(jì)九十年代以來，定向進(jìn)化已成為改善菌株催化活性和選擇性的有效方法。2014年，李智等[26]報道了源自SphingomonasSp.HXN-200的P450pyr，是一種具有烷烴末端羥化功能的P450酶。通過迭代飽和突變(ISM)策略對P450pyr進(jìn)行定向進(jìn)化，成功得到了對烷烴次末端具有高區(qū)域選擇性和高立體選擇性羥化的P450pyr突變體，可用于催化烷烴C—H鍵的活化羥基化以制備高光學(xué)純的醇(Scheme 2)。2015年，李智等[27]又對P450pyr進(jìn)一步定向進(jìn)化獲得新的突變菌株，不僅提高了P450pyr對脂環(huán)族化合物的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，而且使P450pyr對新的底物產(chǎn)生兼容性，完成了N-取代吡咯烷羥基化產(chǎn)物的構(gòu)型互補(bǔ)、烷烴羥基化位點的改變以及催化正丁醇生成1,2-二丁醇，區(qū)域選擇性均高于98%，實現(xiàn)烷烴C—H鍵的區(qū)域/立體選性功能化(表1)。

表1 P450pyr及突變體的底物譜考察

與此同時，Priska等[28]采用迭代飽和突變策略對P450BM3進(jìn)行了分子改造，得到了兩株對底物7具有高選擇性的突變體。其中F87A/I263L突變體對底物7的C9具有非常高的區(qū)域羥化活性(100%)；而L75A/V78A/F87G突變體則對底物7的C10具有較高的區(qū)域選擇性(97%)(Scheme 3)。

Scheme 2

Scheme 3

P450酶在催化過程中表現(xiàn)出高立體/區(qū)域選擇性，促使化學(xué)家們考慮用酶催化來補(bǔ)充甚至替代傳統(tǒng)的合成路線，用于實現(xiàn)藥物分子的修飾及合成。2009年，F(xiàn)asan等[29]利用P450酶作為催化劑實現(xiàn)C—H鍵的羥基化，并將P450酶與化學(xué)法級聯(lián)實現(xiàn)含氟化合物的合成。這一過程主要是通過使用P450單加氧酶將羥基引入到目標(biāo)骨架中，再使用親核氟化劑(DF)取代羥基實現(xiàn)氟化(Scheme 4)。使用具有不同區(qū)域選擇性的P450突變體與親核氟化劑(DF)級聯(lián)可獲得不同氟化衍生物。

Scheme 4

Scheme 5

Scheme 6

Scheme 7

Reetz等[21]利用突變景觀和分子動力學(xué)模擬合理設(shè)計迭代飽和突變，得到的突變體在兼顧活性的同時還可以實現(xiàn)類固醇C16的選擇性羥基化(Scheme 5)，其產(chǎn)物是糖皮質(zhì)激素的組成部分，具有實用價值。

Fasan等[30]報道了利用P450酶調(diào)控天然產(chǎn)物青蒿素的不同位點的不對稱羥基化，通過定向進(jìn)化提高該酶的區(qū)域和立體選擇性。以P450BM3突變體FL#62為該實驗的模板菌株，通過定向進(jìn)化并結(jié)合高通量P450酶的指紋識別篩選方法得到3株突變體IV-H4、II-H10和X-E12，對青蒿素實現(xiàn)高區(qū)域和立體選擇性羥基化。模板菌株FL#62在該反應(yīng)中選擇性差，生成產(chǎn)物中有83%的C7(S)，10%的C7(R)，7%的C6a；而突變體IV-H4可催化青蒿素只轉(zhuǎn)化為17；II-H10催化青蒿素只轉(zhuǎn)化為18；X-E12催化該反應(yīng)選擇性生成的產(chǎn)物19比親本高87%(Scheme 6)。

Scheme 8

Scheme 9

Scheme 10

2014年，F(xiàn)asan等[31]將P450突變體用于單萜內(nèi)酯環(huán)(C9和C14)的高區(qū)域選擇羥基化(Scheme 7)。在羥基化產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)法進(jìn)一步合成一組新的小白菊內(nèi)酯類似物，并且其中一些化合物具有抗原發(fā)性急性髓系白血病的能力。

2021年，F(xiàn)asan等[32]利用高通量篩選方法篩選出P450突變體V-F10和V-H10，對具有抗白血病活性的天然產(chǎn)物(MCL)的C2和C14進(jìn)行高選擇性羥基化，生成產(chǎn)物26和27(Scheme 8)，彌補(bǔ)了該類天然產(chǎn)物這兩個位點C—H鍵羥基化的空白，再進(jìn)一步采用化學(xué)法對該兩個位點的羥基進(jìn)行官能團(tuán)化修飾，可顯著提升該藥物分子的抗白血病活性。

Scheme 11

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

除了定向進(jìn)化外，也有新的方法被開發(fā)用于彌補(bǔ)P450酶在催化羥基化過程中的不足，如構(gòu)建級聯(lián)催化體系、光酶催化體系和引入誘導(dǎo)/輔助小分子等。2019年，陳永正等[33]利用P450酶與鹵醇脫鹵酶級聯(lián)反應(yīng)，將鹵代烷烴化合物28高選擇性轉(zhuǎn)化為R構(gòu)型的鹵代醇29，其ee值可以達(dá)到98%～99%(Scheme 9)。

為了擺脫P(yáng)450酶對輔酶NADPH復(fù)雜循環(huán)系統(tǒng)的依賴，Reetz等[34]報道了第一個使用光驅(qū)動P450酶實現(xiàn)C—H鍵的羥基化，該反應(yīng)使用可溶性的去氮黃素(deazaflavin)介質(zhì)代替昂貴的NADPH輔因子作為廉價的電子供體。2019年，叢志奇等[35]利用直接干預(yù)策略和分子工程技術(shù)結(jié)合，創(chuàng)造出一種由細(xì)胞色素P450BM3突變體與輔助雙功能小分子DFSM組成的人工P450過氧酶系統(tǒng)，DFSM(一端含有可高效利用H2O2的咪唑，另一端含有可與P450BM3結(jié)合的?；被崴槠?在該系統(tǒng)中作為一種酸堿幫助催化劑激活H2O2(Scheme 10)，實現(xiàn)小分子烷烴的選擇性羥基化。

含氮化合物作為生物相關(guān)化合物、藥物和天然產(chǎn)物中關(guān)鍵的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，因此降低成本將化學(xué)原料轉(zhuǎn)化為高價值的手性胺是非常有吸引力的策略。在眾多的合成方法中，C—H鍵直接胺化因不需任何預(yù)官能團(tuán)化而具有吸引力。酶因廉價、環(huán)保和催化選擇性高而成為一種“明星”催化劑，并且Arnold等已證明，P450酶可以在實驗室中被設(shè)計成為具有高催化效率和立體選擇性的催化劑從而實現(xiàn)C—H鍵胺化。

早在1985年，Breslow等[36]從肝微粒中提取了P450酶，并用于催化C—H鍵的氨基化，該報道證實了P450酶可用于催化C—H鍵胺化。直到2013年，Arnold等[37]利用定向進(jìn)化技術(shù)得到P450BM3的突變體P411BM3(C404S)，將其用于催化底物31轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物32(Scheme 11)，再次證明P450酶具有催化C—H鍵氨基化的能力。Fasan等[38]以2,4,6-三取代苯磺酰33a～35a為底物考察了P450BM3及其不同突變體在催化分子內(nèi)C—H鍵氨基化反應(yīng)的能力(Scheme 12)。實驗數(shù)據(jù)表明，不同突變體催化磺酸疊氮分子實現(xiàn)分子內(nèi)氨基化的能力不同(表2)。

表2 不同P450突變體C-H鍵氨基化能力考察結(jié)果

隨后，Arnold等[39]又對P411BM3進(jìn)一步改造得到兩株突變體P411BM3-Variant A/-Variant B，可以對磺酸疊氮分子36進(jìn)行選擇性氨基化，并可選擇性生成相應(yīng)的五元環(huán)產(chǎn)物37和六元環(huán)產(chǎn)物38(Scheme 13)。除此之外，Arnold等[40]對P411為模板菌株進(jìn)行分子改造，還得到一系列突變體(P411Diane)可催化伯、仲和叔C(sp3)—H鍵的對映選擇性胺化，展現(xiàn)出優(yōu)良的底物譜適性(Scheme 14)。

除了P450BM3外，Hartwig等[41]報道了一種源于嗜熱生物中的P450酶(Ir(Me)-PIX)，該P(yáng)450酶含有銥卟啉環(huán)。Ir(Me)-PIX可以催化不同取代基磺酸疊氮化合物46的分子內(nèi)立體選擇性氨基化生成五元環(huán)產(chǎn)物47，通過定向進(jìn)化可對其催化的活性和選擇性進(jìn)一步改善，生成產(chǎn)物的產(chǎn)率可達(dá)98%，ee值可達(dá)95%(Scheme 15)。

Scheme 15

上述文獻(xiàn)報道的C—H鍵氨基化主要發(fā)生在含有磺酸疊氮結(jié)構(gòu)的化合物中。2015年，F(xiàn)asan等[42]進(jìn)一步報道了P450BM3的突變體P411BM3可有效地催化碳酸鹽疊氮化物48環(huán)化生成惡唑烷酮49(Scheme 16)。Wong等[43]利用細(xì)胞色素P450催化底物50分子內(nèi)C—H胺化合成咪唑啉-4-酮51(Scheme 17)。

Scheme 16

Scheme 17

上述研究報道中，P450酶的突變體P411只能實現(xiàn)分子內(nèi)的C—H鍵氨基化，即要求分子內(nèi)含有氮源。2017年，Arnold等[2]發(fā)表的論文表明，P411BM3突變體P411CHA(A82L/A78V/F263L/E267D)可用于催化分子間的氨基化，并且擁有較好的催化活性以及立體選擇性(Scheme 18)。該工作為P450酶催化C—H鍵分子間胺化的研究做出了重大貢獻(xiàn)。

Scheme 18

Scheme 19

Scheme 20

2020年，Arnold等[44]通過對P450BM3進(jìn)行改造后得到兩株突變體，P411BPA和P411APA。P411BPA可有效實現(xiàn)底物芐位C—H鍵的氨基化，而P411APA主要用于催化底物烯丙位C—H鍵的氨基化(Scheme 19)。

C—C鍵是有機(jī)化合物的中心結(jié)構(gòu)。在有機(jī)化合物中通過C—H鍵的烷基化引入不同烷基基團(tuán)，可以得到具有不同性質(zhì)的化合物衍生物。但有關(guān)P450酶催化C—H鍵形成C—C鍵的報道有限。2008年，F(xiàn)umihiko Sato等[45]利用細(xì)胞色素P450酶CYP80G2催化分子內(nèi)的C—H鍵烷基化，實現(xiàn)分子內(nèi)C—C鍵偶聯(lián)反應(yīng)，將底物(S)-Reticuline轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(S)-Corytuberine(Scheme 20)。

Scheme 21

Scheme 22

Scheme 23

2018年，Seyedsayamdost等[46]利用P450催化分子內(nèi)C—C鍵的偶聯(lián)反應(yīng)，將P450酶OxyC與化學(xué)法級聯(lián)實現(xiàn)萬古霉素的合成。

在有機(jī)化合物中引入氟烷基基團(tuán)可以顯著改變其藥理特性[47]。2019年，Arnold等[48]通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得P450突變體，可以催化氟烷基卡賓中間體插入底物C—H鍵中，可實現(xiàn)含氟烷基分子的對映異構(gòu)體合成，ee值高達(dá)99%(Scheme 21)。該研究中開發(fā)的酶將為合成含氟生物活性分子開辟新的途徑，提供一種可將P450酶用于催化C—H鍵官能團(tuán)多樣化的新思路。

2019年，Arnold等[3]采用定向進(jìn)化技術(shù)對P450BM3的突變體P411進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過改造得到的P450突變體能完成多種底物(包括苯基、烯丙基或α-氨基)的C—H鍵功能化。探索發(fā)現(xiàn)，通過卡賓插入C—H鍵實現(xiàn)分子間的烷基化，能獲得較高的轉(zhuǎn)化率和優(yōu)良的選擇性(Scheme 22)。

2020年，Arnold等[49]通過對P411進(jìn)行改造獲得了突變體P411-C10，可高效和高立體選擇性將內(nèi)酯-卡賓轉(zhuǎn)移到74α-氨基位置的C—H鍵上生成產(chǎn)物76或77(Scheme 23)。

C—H鍵直接官能團(tuán)化是構(gòu)建C—X鍵合成新化合物最簡便的方法，具有較高的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。目前，P450酶在催化C—H鍵選擇性官能團(tuán)化中展現(xiàn)出巨大潛力，可高選擇性的催化C—H鍵官能團(tuán)化，并可用于藥物分子中間體的合成，其中有關(guān)C—H鍵羥基化的研究較多，而通過C—H鍵的官能團(tuán)化構(gòu)建其他C—X鍵的研究相對有限。此外，P450酶因其活性低、穩(wěn)定性差、輔酶依賴性等問題限制了其在實際中的應(yīng)用，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)和酶工程技術(shù)的大力發(fā)展，P450酶的應(yīng)用瓶頸有望逐步被打破，其將成為未來綠色化學(xué)發(fā)展中最具潛力的生物催化劑之一。