顏琳， 高潔， 張毅鵬， 王紅梅， 陳勤， 沈詠梅， 岳碧松， 張修月*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，好醫(yī)生藥業(yè)集團有限公司，成都610031； 3. 中齊建設(shè)工程有限公司，成都610094)

毛發(fā)生長是一個復(fù)雜的過程，受營養(yǎng)、環(huán)境、遺傳和生理水平等多種因素的影響(王婷等，2013)。脫發(fā)是一種由多種因素引起的頭部毛發(fā)脫落的常見疾病，脂溢性脫發(fā)、斑禿等問題一直是臨床治療的難題。目前，臨床上針對脫發(fā)的藥物很少，限制了對脫發(fā)等疾病的有效治療。

胸腺素最初是從小牛胸腺提取的一種淋巴細(xì)胞生長因子，分為α、β、γ三類。有關(guān)β族胸腺素的研究最多，其中Tβ4是β族胸腺素中的主要成員，脊椎動物Tβ4有多種功能，如促血管生成和傷口愈合(Badamchianetal.，2003；Kimetal.，2011；于虎等，2011)、腫瘤轉(zhuǎn)移(Chaetal.，2003；馬藝欣，2017)、促細(xì)胞遷移(Freemanetal.，2011)等，且Tβ4的應(yīng)用研究已進入臨床階段。此外，多個研究還發(fā)現(xiàn)，脊椎動物Tβ4與毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長周期的調(diào)節(jié)有密切聯(lián)系，對毛發(fā)生長有促進作用(Chaetal.，2010；李曄等，2014；高笑宇，2015)。目前關(guān)于無脊椎動物胸腺素的研究較少，但研究發(fā)現(xiàn)，它們與脊椎動物Tβ4有類似的功能，如激素調(diào)節(jié)(Tanaka，2012)、促傷口愈合(Hinkeletal.，2015；何文耀等，2018)、參與免疫應(yīng)答(周鑫鑫，2018)等。美洲大蠊Periplanetaamericana是一種傳統(tǒng)藥用昆蟲，其醇提物具有促傷口愈合與組織修復(fù)(何正春等，2007)、增強機體免疫(周瓊等，2008)、抗腫瘤(王飛等，2011)等功能，但其藥效成分和藥理尚不清楚。本研究首次探討了美洲大蠊胸腺素對小鼠毛發(fā)生長的影響，并對促毛發(fā)生長的作用機理進行了初步探討，為美洲大蠊?jié)撛谒幱脙r值開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

90只實驗用C57BL/6小鼠購自四川大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-026，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2018-185，雄性，周齡為7～8周，體質(zhì)量為15～20 g，按照屏障系統(tǒng)設(shè)施要求進行飼養(yǎng)環(huán)境管理。小鼠飼料和墊料均為SPF級，購自成都達(dá)碩生物公司。

1.2 實驗試劑及耗材

美洲大蠊胸腺素THY1、THY2、THY3由本實驗室原核表達(dá)純化獲得(Jingetal.，2019)。人源胸腺素Tβ4購自肽佳生物(批號：800034)。PBS、qPCR八連管、脫脂棉、手術(shù)剪、鑷子、直尺和凍存管均購自成都奧克公司。脫毛膏(批號：83155367，日本Veet)。動物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×Taq SYBR Green qPCR Mix購自北京聚合美生物科技有限公司。4%多聚甲醛購自成都奧創(chuàng)公司。

1.3 主要設(shè)備儀器

熒光定量PCR儀：Bio-Rad(型號：CFX96 Touch)；普通光學(xué)顯微鏡：日本Olympus(型號：CX23)；正置熒光顯微鏡：Leica(型號：DM4 B)。

1.4 動物模型制備及給藥

將C57BL/6小鼠放于室溫18～22 ℃、相對濕度30%～50%的動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成5組：Tβ4組(陽性對照組)、THY1組、THY2組、THY3組和PBS組(空白對照組)，每組18只。將小鼠背部毛發(fā)用電動剃毛器剔除后，均勻涂抹脫毛膏，面積約為2 cm×2 cm。放置2 min后，輕輕用脫脂棉擦去皮膚表面的脫毛膏，并用溫水清洗干凈。

脫毛24 h后，將不同的藥物直接涂抹于小鼠脫毛區(qū)光滑無傷痕的背部皮膚上，給藥體積為50 μL，THY1組、THY2組、THY3組和Tβ4組的藥物濃度均為500 μg·mL-1，每24 h給藥一次，每隔48 h拍照一次。觀察不同組毛發(fā)生長情況。

1.5 小鼠背部皮膚組織學(xué)觀察

在實驗第6天、第12天和第18天，每組隨機取5只小鼠背部皮膚，部分固定在4%多聚甲醛中，部分放在凍存管中并迅速放入液氮罐。將固定后的皮膚組織送成都奧創(chuàng)公司制作皮膚組織的HE切片(縱切，切片厚度為 2 μm)，在100倍顯微鏡下觀察毛囊的發(fā)育情況并統(tǒng)計毛囊數(shù)量。

1.6 實時熒光定量PCR

將液氮速凍后的皮膚組織放在-80 ℃中保存?zhèn)溆?。按照動物總RNA提取試劑盒說明書和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取小鼠背部皮膚總RNA，并制備相應(yīng)的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?連環(huán)蛋白(β-catenin)引物(Kimetal.，2019;F：5’-CCCACTAATGTCCAGCGTTT-3’，R：5’-AACCAAGCATTTTC-ACCAGG-3’)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)引物(Chunetal.，2015；F：5’-ATCGCAGACTCCTG GAATG-3’，R：5’-CCAGCCAGTCTGATTTGATG-3’)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)引物(Jinetal.，2014；F：5’-AGAGACCCTTTGCGGGGTGA-3’，R：5’-CTTCTGAGTCTTGGGCATGT-3’)由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計算。

1.7 小鼠背部毛發(fā)生長情況評估

在實驗第13～17天，每日從小鼠背部相同位置用鑷子取部分毛發(fā)進行測量。每組取5只小鼠，每只隨機挑選5根毛發(fā)并用直尺測量長度，記錄毛長情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用Graphpad prism 8.4.0進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠背部脫毛區(qū)毛發(fā)生長情況

在造模完成后立即對小鼠背部進行拍照，此后每48 h進行拍照。各組脫毛后，皮膚均呈粉紅色，毛發(fā)進入休止期。給藥6 d后，給藥組開始變黑；給藥8 d后，給藥組明顯變黑而PBS組還呈粉紅色；給藥12 d后，給藥組均長出1層細(xì)密的毛發(fā)，而對照組僅部分區(qū)域長出毛發(fā)(圖1)。

2.2 小鼠背部皮膚切片觀察情況

8周齡小鼠毛囊大部分處于休止期(曾明輝，譚正懷，2008)，此時的毛囊下段退化，毛乳頭上移至立毛肌附著處(江樂文等，2020)。給藥 6 d 后，給藥組小鼠毛囊向下生長至皮下深層，進入生長期，而PBS組仍停滯在真皮層；給藥12 d后，黑色素囤積，小鼠皮膚毛囊數(shù)增多，給藥組毛囊數(shù)量明顯多于PBS組(圖2)。在給藥第6天，Tβ4組、PBS組、THY1組、THY2組、THY3組100倍視野毛囊數(shù)分別為(21.25±6.29)個、(8.75±2.99)個、(22.75±5.74)個、(20.00±3.65)個、(21.25±6.29)個，給藥組多于PBS組，且THY1組與PBS組之間具有顯著性差異(P<0.05)；在給藥第18天，Tβ4組、PBS組、THY1組、THY2組、THY3組100倍視野毛囊數(shù)分別為(62.25±9.74)個、(45.75±4.43)個、(63.75±10.15)個、(63.75±10.91)個、(64.75±4.50)個，給藥組明顯多于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01) (圖3)。

2.3 小鼠背部毛發(fā)長度變化情況

在給藥第13天和第14天，THY1組、THY2組、THY3組毛長顯著或極顯著高于PBS組，而Tβ4組與PBS組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在給藥第15天、第16天和第17天，給藥組毛長均顯著或極顯著長于PBS組(P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.000 1) (圖4)。

2.4 美洲大蠊胸腺素對毛發(fā)生長相關(guān)基因表達(dá)影響

在給藥第6天，THY1組、THY2組和THY3組小鼠皮膚內(nèi)β-catenin表達(dá)量均高于PBS組，且THY1組和THY3組與PBS組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在給藥第12天，Tβ4組β-catenin表達(dá)量高于PBS組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在給藥第12天和第18天，給藥組β-catenin表達(dá)量均低于PBS組(圖5)。

在給藥第6天，THY2組、THY3組和Tβ4組小鼠皮膚內(nèi)的MMP-2表達(dá)量高于PBS組；在給藥第12天和第18天，給藥組MMP-2表達(dá)量均高于PBS組，且在給藥第18天，THY2組與PBS組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) (圖6)。

在給藥第6天，給藥組IGF-1表達(dá)量均高于PBS組；在給藥第12天，THY1組和Tβ4組IGF-1表達(dá)量高于PBS組；在給藥第18天，THY1組IGF-1表達(dá)量顯著高于PBS組(P<0.05) (圖7)。

3 討論

毛囊的生長周期分為生長期、退行期和休止期(周乃慧，2008)。C57BL/6小鼠是常用來進行毛發(fā)生長觀察的動物模型，軀干背部的黑色素細(xì)胞只存在于毛囊中(于萍等，2014)。小鼠毛囊在退行期時，黑色素生成減少，皮膚變?yōu)榛疑?曾明輝，譚正懷，2008)。7周齡C57BL/6小鼠毛發(fā)生長開始進入休止期，黑色素的生成完全停止，背部皮膚為粉紅色(邢喆等，2004；曾明輝，譚正懷，2008)。而當(dāng)小鼠背部毛囊進入新的生長周期時，皮膚逐漸變黑，因此可以通過小鼠背部顏色的變化來推斷小鼠毛發(fā)是否進入生長期。本實驗發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠皮膚變黑明顯早于PBS組，毛發(fā)生長長度及毛囊數(shù)量顯著高于PBS組，說明美洲大蠊胸腺素可以增加毛囊數(shù)量、促進毛發(fā)生長。

Wnt/β-catenin是生物體內(nèi)一條保守的信號通路，在毛囊發(fā)生的起始階段起到關(guān)鍵的作用(Chodankaretal.，2003)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，與Let-1相互作用，參與毛發(fā)基板的發(fā)育(Huelskenetal.，2001)、促進毛發(fā)生長與協(xié)調(diào)毛囊周期(Cadigan & Nusse，1997)。毛囊發(fā)育首先形成基板，進而進行形態(tài)發(fā)生(Huelskenetal.，2001)。Posthaus等(2002)發(fā)現(xiàn)，基板發(fā)生往往伴隨β-catenin表達(dá)的上調(diào)，敲除β-catenin和Lef1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠出生后體表無毛、無胡須。Huelsken等(2001)同樣發(fā)現(xiàn)敲除小鼠β-catenin基因，毛發(fā)生長受到抑制。本研究初步發(fā)現(xiàn)，在脫毛的C57BL/6小鼠背部涂抹美洲大蠊胸腺素，β-catenin表達(dá)水平在給藥第6天明顯高于PBS組，且高于Tβ4組，這說明β-catenin在脫毛小鼠背部毛囊發(fā)育前期發(fā)揮重要作用，美洲大蠊胸腺素可能通過促進β-catenin的表達(dá)進而促進小鼠的毛囊發(fā)育。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的主要成員，僅在毛囊、巨噬細(xì)胞和汗腺中表達(dá)(高笑宇，2015)。Kumar等(2011)發(fā)現(xiàn)MMP-2會促進黑素細(xì)胞前體(成黑素細(xì)胞)從毛囊外根鞘的遷移，從而在毛球部積累并生成黑色素。高笑宇(2015)發(fā)現(xiàn)Tβ4可以促進MMP-2的表達(dá)從而改變相關(guān)信號通路的活性，促進毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長。本研究首次探究并初步發(fā)現(xiàn)，除了在給藥第6天THY1組小鼠皮膚內(nèi)MMP-2表達(dá)量低于PBS組，其余給藥組的均高于PBS組，表明美洲大蠊胸腺素可能通過提高小鼠體內(nèi)的MMP-2表達(dá)來促進上皮細(xì)胞的遷移，促進毛囊的生長發(fā)育。

IGF-1是一種多功能細(xì)胞調(diào)控因子，是皮膚毛囊發(fā)育過程中的重要因子(Ben-Amitaietal.，2006)。Stenn等(1996)發(fā)現(xiàn)外源性的IGF-1能促進體外毛囊的生長，影響次級毛囊的形成和發(fā)育。王婷等(2013)發(fā)現(xiàn)IGF-1可通過刺激羊駝皮膚成纖維細(xì)胞的增殖而促進毛囊的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，THY1蛋白處理的小鼠皮膚IGF-1表達(dá)量隨時間變化增高；THY2和THY3處理后的小鼠皮膚IGF-1表達(dá)量在給藥第6天最高，隨時間變化降低。這說明不同胸腺素蛋白可能在小鼠毛發(fā)生長不同階段影響小鼠皮膚IGF-1的表達(dá)，進而調(diào)節(jié)小鼠毛發(fā)生長。

綜上所述，美洲大蠊胸腺素可以促進C57BL/6小鼠的毛發(fā)生長。推測美洲大蠊胸腺素可能通過提高β-catenin、MMP-2和IGF-1的表達(dá)來調(diào)控小鼠的毛囊發(fā)育與毛發(fā)生長。