楊二妹 賈 浩 周晨霞 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000)

糧食是人類賴以生存的必需品，糧食安全成為首要問(wèn)題。根據(jù)我國(guó)儲(chǔ)糧損失相關(guān)資料顯示，國(guó)家?guī)鞊p失為0.2%，農(nóng)戶儲(chǔ)糧損失為6%～9%[1]。玉米象在我國(guó)已被列入10大儲(chǔ)糧害蟲(chóng)之中，也被視為世界頭號(hào)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)[2]。玉米象是蛀食性儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，主要發(fā)生在稻谷、小麥和玉米等原糧中，被害糧食幾乎為空殼，糧食的品質(zhì)嚴(yán)重下降和質(zhì)量減少[3, 4]。玉米象分布較為廣泛，在我國(guó)多個(gè)省的地方糧食儲(chǔ)備庫(kù)及加工企業(yè)和儲(chǔ)糧農(nóng)戶中均有玉米象的存在[5, 6]。玉米象屬于鞘翅目象甲科，善于爬行、能飛行、有假死性和喜潮濕、陰暗地等生物學(xué)特性[7]。在我國(guó)玉米象每年可發(fā)生1～7代，由北方到南方，隨著溫度和濕度的變化，東北每年產(chǎn)1～2代，廣東、廣西等地每年可產(chǎn)7代，由北向南產(chǎn)生的代數(shù)逐漸增多，對(duì)糧食危害很?chē)?yán)重[8, 9]。

磷化氫被廣泛用于防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，是一種劇毒農(nóng)藥，長(zhǎng)期使用儲(chǔ)糧害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，并污染環(huán)境及危害工作人員的身體健康[10, 11]。植物源殺蟲(chóng)劑是一種天然無(wú)害、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性、殺蟲(chóng)范圍廣且易得到的綠色安全的儲(chǔ)糧熏蒸劑[12, 13]。植物源殺蟲(chóng)劑是直接利用或提取植物的根、莖、葉、花、果、種子等或利用其次生代謝物質(zhì)制成具有殺蟲(chóng)作用的活性物質(zhì)[14, 15]。植物源殺蟲(chóng)劑主要分為生物堿類、魚(yú)藤酮類、楝科植物、除蟲(chóng)菊類、萜類化合物、植物光活化毒素和植物精油[16]。植物精油作為植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有特殊的芳香氣味、易揮發(fā)、溶于有機(jī)溶劑的復(fù)合化合物[17, 18]。

國(guó)外很多學(xué)者已對(duì)植物精油有大量的研究，Kim等[19]研究了10種植物精油對(duì)米象的熏蒸實(shí)驗(yàn)，其中香菜精油(caraway), 小茴香精油(dill)，孜然精油(cumin)對(duì)米象的熏蒸效果較其他精油好，其半數(shù)致死劑量分別為2.45、3.29、4.75 mg/L。Hernandez-Lambrao等[20]研究表明香茅(Cymbopogon martinii)精油熏蒸24 h玉米象的致死率達(dá)90%以上，半數(shù)致死量為37.2 μL/L，比市售產(chǎn)品IR3535效果更好。近些年國(guó)內(nèi)外植物源農(nóng)藥得到長(zhǎng)足發(fā)展。李慧等[21]研究表明改性大蒜素對(duì)糧堆表面上的玉米象具有很好的熏蒸效果，熏蒸24 h體積分?jǐn)?shù)為96 μL/L，玉米象的死亡率可達(dá)到100%。張超等[22]研究表明辣根素熏蒸玉米象72 h時(shí)具有較高的熏蒸活性，LD50為 0.74 μg/mL，LD90為1.53 μg/mL。本研究選取了生姜精油、羅勒精油、丁香精油、薄荷精油和黑胡椒精油，設(shè)置不同濃度、不同處理時(shí)間對(duì)玉米象的熏蒸實(shí)驗(yàn)，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)精油的成分進(jìn)行測(cè)定，旨在篩選出對(duì)控制儲(chǔ)糧害蟲(chóng)玉米象效果較好的植物精油，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型植物源殺蟲(chóng)劑提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與試劑

材料與試劑：生姜精油、羅勒精油、丁香精油、薄荷精油、黑胡椒精油、丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇、檸檬烯、聚四氟乙烯、300 mL三角瓶、濾紙、封口膜、移液槍。

設(shè)備：電熱鼓風(fēng)干燥箱，恒溫培養(yǎng)箱，安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2 玉米象飼養(yǎng)方法

玉米象蟲(chóng)源：2019年2月由國(guó)家物資和儲(chǔ)備局引進(jìn)。

飼養(yǎng)方法：參照黃衍章等[23]、侯昌亮等[24]飼養(yǎng)玉米象的方法，將未接觸過(guò)農(nóng)藥的小麥粒去除雜質(zhì)和塵土，清洗后放入80 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)消毒2 h。將消毒好的小麥粒放置室溫后，含水量調(diào)至12.5%～14%。將養(yǎng)蟲(chóng)瓶在121 ℃、15 min的條件下消毒，冷卻后在養(yǎng)蟲(chóng)瓶2/3處涂一層聚四氟乙烯，防止成蟲(chóng)爬出。用已消毒的毛筆將成蟲(chóng)接入裝有1/3飼料的養(yǎng)蟲(chóng)瓶中，用濾紙將瓶口封好，放入養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)(溫度：27～29 ℃，濕度：70%～80%。待下一代大量成蟲(chóng)羽化后2周取出作為試蟲(chóng)供實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熏蒸實(shí)驗(yàn)

參照程作慧等[25]、楊杉等[26]三角瓶濾紙密閉熏蒸法：將三角瓶置于滅菌鍋中121 ℃、15 min滅菌，冷卻后在距瓶口2～3 cm處均勻的涂一層聚四氟乙烯，防止試蟲(chóng)爬出。每瓶接入玉米象成蟲(chóng)20頭，用微量移液槍分別吸取不同劑量的精油，體積分?jǐn)?shù)分別為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00、40.00 μL/L，分別滴于長(zhǎng)方形濾紙片1×12 cm上，并迅速懸掛在距300 mL三角瓶底部2～3 cm處，濾紙片不能與瓶壁、瓶底接觸，迅速將瓶口密封。以空白濾紙作對(duì)照，每一個(gè)處理重復(fù)3次。置于溫度為27～29 ℃、濕度70%～80%的養(yǎng)蟲(chóng)室中，分別于處理24、48、72、96 h時(shí)，觀察玉米象的死亡數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。

參照上述方法用移液槍分別取丁香酚5、10、15、20、25、30 μL，體積分?jǐn)?shù)為12.50、25.00、37.50、50.00、62.50、75.00 μL/L，移取肉豆蔻酸異丙酯60、70、80、90、100、110 μL，體積分?jǐn)?shù)為150.00、175.00、200.00、225.00、250.00 μL/L，進(jìn)行玉米象熏蒸實(shí)驗(yàn)，每一處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)，分別在24、48、72、96 h觀察玉米象的死亡數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。

死亡標(biāo)準(zhǔn)：以撥針觸及成蟲(chóng)尾部、觸角及足不動(dòng)者為死亡。

死亡率=死亡蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)數(shù)×100%

1.3.2 GC-MS精油成分分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀安捷倫氣相色譜7890A-質(zhì)譜5975C對(duì)精油成分進(jìn)行分析。

氣相色譜條件:色譜柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度280 ℃，程序升溫條件：初始溫度，60 ℃保持3 min，30 ℃/min到285 ℃保持9 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍為全掃描，溶劑延遲2.9 min，使用NIST譜庫(kù)圖譜檢索進(jìn)行定性，采用面積歸一法進(jìn)行成分含量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理、方差分析，并使用該軟件中Probot回歸法進(jìn)行毒力分析(5%顯著水平)。運(yùn)用Origin 9.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果分析

2.1 玉米象熏蒸結(jié)果及分析

在溫度27～29 ℃，濕度70%～80%的黑暗條件下進(jìn)行5種精油7個(gè)濃度梯度測(cè)定對(duì)玉米象熏蒸毒力的劑量效應(yīng)，每一濃度分別在24、48、72、96 h觀察一次，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定精油對(duì)玉米象熏蒸毒力的時(shí)間效應(yīng)。圖1表示5種精油不同濃度處理24、48、72、96 h對(duì)玉米象熏蒸毒力的測(cè)定結(jié)果。

從圖1可看出5種植物精油熏蒸玉米象24、48、72、96 h，校正死亡率均隨精油濃度增大呈上升趨勢(shì)，同種精油同一濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)玉米象的校正死亡率增大。薄荷精油和羅勒精油熏蒸玉米象24、48、72 h的校正死亡率均有顯著差異，熏蒸96 h，7個(gè)濃度玉米象的校正死亡率基本達(dá)到100%，無(wú)顯著性差異，熏蒸效果較好。

熏蒸24 h，體積分?jǐn)?shù)為10 μL/L時(shí)，薄荷精油和羅勒精油的校正死亡率分別為25%、12.5%，體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L時(shí)，薄荷精油和羅勒精油的校正死亡率分別為87.50%、45%以上?？梢?jiàn)熏蒸24 h精油濃度對(duì)玉米象的校正死亡率影響較大。Buentello等[27]研究了羅勒精油對(duì)三種果蠅的熏蒸實(shí)驗(yàn)，熏蒸2 h體積分?jǐn)?shù)為2.5%致死率均為77%以上，說(shuō)明同種精油熏蒸不同種害蟲(chóng)效果不同，羅勒精油對(duì)熏殺害蟲(chóng)種類范圍較大。楊杉等[26]研究了8種植物精油對(duì)玉米象的熏蒸毒力，熏蒸24 h，薄荷精油對(duì)玉米象的熏蒸效果最強(qiáng)，校正死亡率為86.67%。熏蒸48 h，羅勒精油和薄荷精油的7個(gè)濃度熏蒸玉米象的校正死亡率均在60%以上，體積分?jǐn)?shù)為40 μL/L，校正死亡率均超過(guò)80%。熏蒸48 h，丁香精油和黑胡椒精油對(duì)玉米象的校正死亡率均未到達(dá)40%，丁香精油隨濃度增大，玉米象的校正死亡率逐漸升高，但校正死亡率相對(duì)較低。洪承昊[28]研究表明留蘭香精油熏蒸48 h、體積分?jǐn)?shù)為6.25 μL/cm3，玉米象的校正致死率為15.5%，體積分?jǐn)?shù)18.75 μL/cm3校正死亡率為97.7%，熏蒸72 h、體積分?jǐn)?shù)為2.257 μL/cm3，玉米象的校正死亡率為24.4%，體積分?jǐn)?shù)為18.757 μL/cm3，玉米象的校正死亡率為98.8%，隨濃度、時(shí)間不斷增大，玉米象校正死亡率明顯增加。熏蒸72 h，生姜精油的7個(gè)濃度對(duì)玉米象的校正死亡率均達(dá)到75%以上，羅勒精油和薄荷精油體積分?jǐn)?shù)在40.00 μL/L時(shí)，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%。隨熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)，玉米象的校正死亡率不斷升高。熏蒸96 h，薄荷精油體積分?jǐn)?shù)為15 μL/L時(shí)，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%，羅勒精油體積分?jǐn)?shù)為20.00 μL/L時(shí)，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%，生姜精油體積分?jǐn)?shù)為25.00 μL/L時(shí)，玉米象的校正死亡率為100%。丁香精油體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L 時(shí)，玉米象的校正死亡率達(dá)到90%，有顯著差異。黑胡椒精油熏蒸玉米象24 、48、72、96 h，7個(gè)濃度的校正死亡率規(guī)律性較差，殺蟲(chóng)效果還需進(jìn)一步研究確定。說(shuō)明薄荷精油對(duì)玉米象的熏蒸效果較好，羅勒精油對(duì)玉米象的效果僅次于薄荷精油。同一熏蒸時(shí)間不同種精油對(duì)玉米象的致死效果不同，說(shuō)明精油熏蒸玉米象的有效成分含量不同、種類也不同，但隨精油劑量的不斷增大，玉米象的校正死亡率明顯增加，精油濃度對(duì)玉米象的校正死亡率影響較大。

注：同一圖中同一圖案上不同字母表示顯著差異，余同。圖1 5種精油不同濃度熏蒸24 h、48 h、72 h、96 h對(duì)玉米象的校正死亡率

綜合以上研究結(jié)果表明5種精油中薄荷精油對(duì)玉米象熏蒸效果最好，羅勒精油次之，丁香精油相對(duì)較差，若增大濃度熏蒸玉米象可能熏蒸效果會(huì)好。Gonzales等[29]研究了丁香精油和肉桂精油對(duì)玉米象的熏蒸效果，丁香精油熏蒸效果較差，在本研究中同一濃度丁香精油熏蒸玉米象的效果較其他精油差，說(shuō)明丁香精油對(duì)玉米象的毒力較小。薄荷精油和羅勒精油熏蒸72 h和96 h時(shí)，玉米象的校正死亡率趨于100%，對(duì)玉米象的熏蒸效果較好?？蔀檠兄菩滦途G色植物源殺蟲(chóng)劑提供參考，為進(jìn)一步說(shuō)明薄荷精油和羅勒精油對(duì)玉米象的熏蒸效果，因此，對(duì)其進(jìn)行毒力回歸分析。

根據(jù)羅勒精油和薄荷精油對(duì)玉米象的熏蒸效果，計(jì)算出不同處理時(shí)間的回歸方程、致死中量及相關(guān)系數(shù)等。由表1可知薄荷精油熏蒸24 h的玉米象半數(shù)致死中量是72 h的3倍多。羅勒精油熏蒸24 h玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)是72 h的8倍，與Hossain等[30]研究的羅勒精油對(duì)玉米象熏蒸48、72、96 h的半數(shù)致死中量為8.14、6.50、4.91 μL/mL，均表明隨熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)、玉米象的半數(shù)致死中量逐漸減少，趨勢(shì)相一致。薄荷精油和羅勒精油對(duì)玉米象的毒力回歸方程中相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.90以上，說(shuō)明兩種精油對(duì)玉米象毒力測(cè)定的回歸方程擬合程度較好，與實(shí)際情況相符合[31, 32]。周娟[33]研究結(jié)果表明肉桂精油對(duì)玉米象熏蒸24、48、72 h后，肉桂精油對(duì)玉米象的半數(shù)致死中量分別是1.97、1.54、1.12 μL/L。與本研究中的半數(shù)致死劑量隨熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種精油處理玉米象的LD50值明顯下降有相同趨勢(shì)，與周娟的研究結(jié)果趨勢(shì)一致。

表1 羅勒精油和薄荷精油對(duì)玉米象的熏蒸毒力回歸分析

2.2 精油成分分析

為確定薄荷精油和羅勒精油中的有效成分，對(duì)兩種精油進(jìn)行氣質(zhì)分析。根據(jù)兩種精油的氣相色譜圖，可看出均存在多個(gè)峰，峰面積出現(xiàn)的時(shí)間和大小均不同，成分較為復(fù)雜。

從表2中可看出薄荷精油中的化學(xué)成分種類較多，分析出119種組分，其中10種化學(xué)成分含量達(dá)到81.6%。洪承昊[28]研究中發(fā)現(xiàn)薄荷精油的主要成分為薄荷醇和檸檬烯，薄荷醇含量較高，但不是薄荷精油中熏殺玉米象的有效成分，檸檬烯對(duì)玉米象有一定的熏殺效果，檸檬烯對(duì)玉米象處理體積分?jǐn)?shù)為37.5 μL/L時(shí)，熏蒸24、48、72 h 玉米象的校正死亡率分別為74.1%、87.5%、97.3%。本研究中選取薄荷醇和檸檬烯對(duì)玉米象進(jìn)行熏蒸實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)玉米象熏蒸的有效成分。

表2 薄荷精油的GC-MS分析

從表3中可以看出羅勒精油的化學(xué)成分種類較多，分離出70種組分，其10種化學(xué)成分含量達(dá)到96.48%，其中丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯、苯甲酸芐酯和石竹烯4種化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)91.4%。黃麗沄等[34]發(fā)現(xiàn)羅勒精油的成分丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.55%，石竹烯占4.73%，有很好的抑菌作用，說(shuō)明有一定的毒殺效果。目前，研究羅勒精油所含的單體成分對(duì)玉米象的熏蒸效果的報(bào)道文獻(xiàn)較少，需進(jìn)一步研究確定有效成分。

表3 羅勒精油的GC-MS分析

從圖2可看出同一濃度檸檬烯、薄荷醇和丁香酚對(duì)玉米象的熏蒸活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)校正死亡率增加，同一熏蒸時(shí)間對(duì)玉米象的校正死亡率隨濃度增加而增加，且有顯著差異。在熏蒸96 h，檸檬烯體積分?jǐn)?shù)為75 μL/L對(duì)玉米象的校正死亡率95%以上，薄荷醇體積分?jǐn)?shù)為275 μL/L對(duì)玉米象的校正死亡率近90%，檸檬烯對(duì)玉米象的校正死亡率較薄荷醇較好。楊杉等[28]研究表明薄荷醇體積分?jǐn)?shù)為50 μL/L、對(duì)玉米象熏蒸24、48、96、120 h時(shí)，校正死亡率分別為0、2.5%、2.5%和12.9%，檸檬烯體積分?jǐn)?shù)為50 μL/L，對(duì)玉米象熏蒸24 h時(shí)，校正死亡率達(dá)到100%。薄荷精油的主要成分中檸檬烯對(duì)玉米象具有有效的熏殺效果，薄荷醇熏殺效果較弱。丁香酚體積分?jǐn)?shù)為75 μL/L時(shí)，熏蒸96 h玉米象的校正死亡率為100%。熏蒸時(shí)間對(duì)玉米象的校正死亡率有顯著影響。肉豆蔻酸異丙酯熏蒸24 h時(shí)，玉米象的校正死亡率為0，無(wú)熏蒸效果。熏蒸96 h時(shí)，玉米象的校正死亡率隨精油濃度的增大而增大，不同濃度下有顯著差異，體積分?jǐn)?shù)為275 μL/L時(shí)，校正死亡率為50%。丁香酚相對(duì)肉豆蔻酸異丙酯對(duì)玉米象的熏蒸效果較好，丁香酚是羅勒精油中主要?dú)⑾x(chóng)成分之一。薄荷精油和羅勒精油成分均較為復(fù)雜，其他成分對(duì)玉米象的熏殺效果還需進(jìn)一步分析。

圖2 檸檬烯、薄荷醇、丁香酚和肉豆蔻酸異丙酯對(duì)玉米象熏蒸24、48、72、96 h的校正死亡率

根據(jù)檸檬烯、薄荷醇和丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯對(duì)玉米象的熏蒸效果，分別計(jì)算出其不同處理時(shí)間的毒力回歸方程、致死中量及相關(guān)系數(shù)等。從表4可以看出檸檬烯熏蒸24 h的半數(shù)致死中量時(shí)96 h的4倍多，薄荷醇熏蒸24 h的半數(shù)致死中量是96 h的1.6倍，檸檬烯和薄荷醇對(duì)玉米象的半數(shù)致死中量隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷減少。丁香酚熏蒸24 h時(shí)，玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)是72 h的3倍多，熏蒸時(shí)間對(duì)熏蒸效果影響較大。肉豆蔻酸異丙酯熏蒸96 h時(shí)，玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)為255.713 μL/L。四種成分對(duì)玉米象的毒力回歸方程中相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.90以上，說(shuō)明對(duì)玉米象毒力測(cè)定的回歸方程擬合度較好，與實(shí)際情況相符合。薄荷精油中檸檬烯的半數(shù)致死中量較薄荷醇小，說(shuō)明檸檬烯對(duì)玉米象的熏蒸毒性較薄荷醇大。羅勒精油的中的丁香酚的半數(shù)致死量較肉豆蔻酸異丙酯小，說(shuō)明丁香酚對(duì)玉米象的熏蒸毒性較大。

表4 檸檬烯、薄荷醇和丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯對(duì)玉米象的熏蒸毒力回歸分析

3 結(jié)論

在熏蒸24、48、72、96 h時(shí)，薄荷精油和羅勒精油對(duì)玉米象的熏蒸效果較好，兩種精油在熏蒸72、96 h，體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L時(shí)，校正死亡率達(dá)到100%。羅勒精油熏蒸24、48、72 h時(shí)，LD50分別為44.569、 7.821、5.840 μL/L，薄荷精油熏蒸24、48、72 h時(shí)，LD50分別為18.124、 8.266、5.476 μL/L，相關(guān)系數(shù)(R2)均在90%以上，線性關(guān)系良好。采用氣相-色譜聯(lián)用儀對(duì)薄荷精油和羅勒精油分別進(jìn)行了成分分析，薄荷精油分析出119種成分，主要有薄荷醇(21.17%)、檸檬烯(12.59%)，檸檬烯較薄荷醇對(duì)玉米象具有較強(qiáng)的熏殺效果；羅勒精油分析出分離出70種成分，主要為丁香酚(38.55%)、肉豆蔻酸異丙酯(29.43%)，羅勒精油的主要成分丁香酚對(duì)玉米象的熏蒸效果較肉豆蔻酸異丙酯好，說(shuō)明丁香酚為羅勒精油熏玉米象的有效成分之一，其他成分尚需進(jìn)一步研究確定。

綜合玉米象熏蒸實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，薄荷精油對(duì)玉米象的熏殺效果最好，羅勒精油次之。因此，在防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)方面比較有發(fā)展前景，可通過(guò)與其他精油進(jìn)行復(fù)配，研制出新型綠色、安全植物源殺蟲(chóng)劑。