林輝雄 林海鋒 逯 妍 王小泉 王聞通 （瓊海市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，瓊海571400）

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見原因［1］。目前，肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略包括手術(shù)切除、化學(xué)療法和放射療法，化學(xué)療法仍是晚期肺癌的常用治療方案之一［2］。吉西他濱作為一線治療藥物已被用于肺癌治療，但耐藥性限制其臨床應(yīng)用，耐藥性的確切機(jī)制尚未闡明，耐藥性相關(guān)基因仍需進(jìn)一步探索［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素［4］。miR-591 在多種生物學(xué)和病理學(xué)過程中起重要作用，備受關(guān)注。研究表明，miR-591 在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-591 抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲［5］。miR-591在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，可緩解肝癌細(xì)胞耐藥性［6］。ABCC3 是ATP-結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可主動(dòng)釋放多種抗腫瘤藥物，導(dǎo)致多藥耐藥［7］。ABCC3 在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，在非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，干擾ABCC3表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的集落形成，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［7-9］。但miR-591在肺癌細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性的影響，以及miR-591 是否通過靶向調(diào)控ABCC3 表達(dá)影響肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性尚未明確。因此，本研究建立肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR，并觀察miR-591 對(duì)其增殖、凋亡的影響，并結(jié)合ABCC3探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；吉西他濱（99.8%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；吉西他濱購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司；RIPA 裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；ABCC3、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與耐藥細(xì)胞株（A549/GR）構(gòu)建 采用含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細(xì)胞，37℃、5%CO2的潮濕條件下培養(yǎng)。參考 WEI 等［10］方法構(gòu)建A549/GR 細(xì)胞株，將對(duì)吉西他濱敏感的A549 親本細(xì)胞連續(xù)暴露于濃度逐漸增加的吉西他濱中，初始濃度為10 nmol/L，6個(gè)月后增加至10 μmol/L。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理 肺癌A549細(xì)胞或吉西他濱耐藥細(xì)胞株A549/GR 接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合，按照說明書，采用Lipofectamine2000將miR-591、si-ABCC3、pcDNA-ABCC3及相應(yīng)陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，吉西他濱（0.1 μmol/L）處理48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96 孔板，37℃下采用不同濃度吉西他濱（0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL）處理A549、A549/GR細(xì)胞48 h，或收集轉(zhuǎn)染后的A549/GR細(xì)胞，10 μ/l孔加入CCK-8 溶液，37℃、5%CO2孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè) miR-591 和 ABCC3 mRNA 表達(dá) 采用 TRIzol 提取 A549 和 A549/GR 細(xì)胞總RNA，采用PrimeScripte RT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)，以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。引物序列：miR-591 F：5'-GAGGTAGACCATGGGTTCTCA-3'，R：5'-AGCCAGGGAGTCCACAGTTA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；ABCC3 F：5'-CCTTTGCCAACTTTCTCTGC-3'，R：5'-AGGGCACTCAGCTGTCTCAT-3'；GAPDH F：5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'，R：5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

1.2.5 TargetScan 預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) TargetScan 網(wǎng)站（http：//www. targetscan. org/）預(yù)測(cè) miR-591 靶基因，ABCC3 3'UTR 中預(yù)測(cè) miR-591的假定結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建野生（WT）和突變（MUT）-ABCC3 質(zhì)粒，采用Lipofectamine2000 試劑共轉(zhuǎn) 染 WT-ABCC3 或 MUT-ABCC3 與 miR-591 模 擬 物或miR 陰性對(duì)照（NC），轉(zhuǎn)染后48 h，雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒評(píng)估熒光素酶活性。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 A549/GR 細(xì)胞在 Binding Buffer 緩沖液中稀釋至 1×105個(gè)/ml，取100 μl 細(xì)胞懸液加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI工作液，室溫避光孵育15 min，BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞。

1.2.7 Western blot 檢 測(cè) ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 采用冷磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，與含有蛋白酶抑制劑混合物的冷RIPA 緩沖液孵育，冰上裂解30 min，4℃ 離心15 min。采用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清中蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%）分離等量蛋白（20 μg），轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax一抗（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）4℃ 孵育過夜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑顯影，ImageJ軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度吉西他濱對(duì)肺癌A549 細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR抑制率的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL 吉西他濱顯著降低A549/GR 細(xì)胞增殖抑制率；吉西他濱作用的A549/GR 細(xì)胞IC50顯著高于A549細(xì)胞（P<0.05，表1）。

表1 不同濃度吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞抑制率的影響（，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells（，n=9）

表1 不同濃度吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞抑制率的影響（，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells（，n=9）

Note：Compared with A549，1）P<0.05.

Groups Gem concentration（μmol/L）1 2 5 IC50 1.21±0.14 47.58±4.131）33.663 0.000 A549 A549/GR t P 0.01 11.02±1.17 6.34±0.631）10.566 0.000 0.1 28.46±2.84 10.25±0.911）18.391 0.000 41.33±4.15 15.44±1.231）17.944 0.000 52.69±5.18 24.36±1.571）15.702 0.000 66.32±6.22 31.42±1.741）16.210 0.000 10 79.68±6.22 36.14±2.181）16.033 0.000

2.2 miR-591和ABCC3 在肺癌A549 細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR 中的表達(dá) qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與A549 細(xì)胞相比，A549/GR 細(xì)胞中miR-591 表達(dá)明顯減少，ABCC3 mRNA和ABCC3蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05，圖1）。

圖1 肺癌A549細(xì)胞和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR中miR-591、ABCC3表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-591 and ABCC3 in lung cancer cells A549 and lung cancer gemcitabine-resistant cells A549/GR

2.3 miR-591靶向調(diào)控ABCC3表達(dá) TargetScan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-591 與ABCC3 3'UTR 區(qū)堿基可形成互補(bǔ)配對(duì)（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-591 明顯降低 WT-ABCC3 細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性（P<0.05），而對(duì)MUT-ABCC3 細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性無顯著影響（圖2B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-591明顯降低ABCC3 蛋白表達(dá)；與anti-miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-591 顯著提高ABCC3 蛋白表達(dá)（P<0.05，圖2C）。

圖2 miR-591靶向調(diào)控ABCC3表達(dá)Fig.2 miR-591 targeting regulates ABCC3 expression

2.4 miR-591 過表達(dá)聯(lián)合吉西他濱（0.1 μmol/L）對(duì)A549/GR細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響與 Con 組相比，Gem+miR-NC 組、Gem+miR-591 組A549 細(xì)胞和 A549/GR 細(xì)胞中 miR-591 表達(dá)明顯降低，抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白表達(dá)顯著提高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯降低；與Gem+miR-NC組相比，Gem+miR-591 組 A549 細(xì)胞和 A549/GR 細(xì)胞miR-591表達(dá)、抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達(dá)明顯提高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P<0.05，圖3、表2）。

表2 miR-591 過表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

表2 miR-591 過表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

Note：Compared with Con，1）P<0.05；compared with Gem+miR-NC，2）P<0.05.

Groups Con Gem+miRNC Gem+miR-591 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 Apoptosis rate 6.22±0.61 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 Apoptosis rate 7.36±0.74 7.25±0.761）7.15±0.7229.65±2.411）19.32±1.331）33.58±3.351）2）22.69±2.231）2）52.66±5.171）2）31.54±3.111）2）329.000 0.000 F P 714.438 0.000 394.187 0.000 578.333 0.000

圖3 miR-591 過表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells

2.5 干擾ABCC3 表達(dá)聯(lián)合吉西他濱（0.1 μmol/L）對(duì)A549/GR細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響與 Con 組 相 比 ，Gem+si-NC 組 、Gem+si-ABCC3 組A549/GR 細(xì)胞和A549 細(xì)胞抑制率、凋亡率、ABCC3、p21、Bax蛋白水平明顯提高，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低；與Gem+si-NC 組相比，Gem+si-ABCC3 組 A549/GR 細(xì)胞和 A549 細(xì)胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平明顯提高，ABCC3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，圖4、表3）。

表3 干擾ABCC3 表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

表3 干擾ABCC3 表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

Note：Compared with Con，1）P<0.05；compared with Gem+si-NC，2）P<0.05.

Groups Con Gem+si-NC Gem+si-ABCC3 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 9.87±0.991）Apoptosis rate 6.24±0.61 6.58±0.66 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 27.14±2.651）Apoptosis rate 7.14±0.71 18.69±1.331）31.25±3.121）2）19.45±1.881）2）48.33±4.271）2）27.31±2.411）2）342.207 0.000 F P 643.036 0.000 352.630 0.000 627.429 0.000

圖4 干擾ABCC3 表達(dá)聯(lián)合吉西他濱對(duì)A549/GR 細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells

2.6 ABCC3 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達(dá)對(duì)肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR 吉西他濱耐藥性的作用 與 Gem+miR-NC 組 相 比 ，Gem+miR-591 組A549/GR 細(xì)胞 ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減少，細(xì)胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平顯著提高（P<0.05），與Gem+miR-591+pcDNA 組相比，Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 組 A549/GR 細(xì) 胞ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯升高，細(xì)胞抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，表4、圖5）。

表4 ABCC3 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達(dá)在肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR中的作用（，n=9，%）Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR（，n=9，%）

表4 ABCC3 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達(dá)在肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR中的作用（，n=9，%）Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR（，n=9，%）

Note：Compared with Gem+miR-NC，1）P<0.05；compared with Gem+miR-591+pcDNA，2）P<0.05.

Apoptosis rate 6.935±0.71 21.36±2.141）23.65±2.33 13.28±1.332）172.497 0.000 Groups Gem+miR-NC Gem+miR-591 Gem+miR-591+pcDNA Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 F P Inhibition rate 10.65±1.13 35.58±3.481）37.19±3.71 19.25±1.282）207.463 0.000

3 討論

吉西他濱作為一線化療藥物，廣泛用于多種癌癥治療，包括肺癌治療［11-12］。盡管患者治療開始時(shí)對(duì)吉西他濱反應(yīng)良好，但部分患者最終會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致治療失敗，并最終導(dǎo)致死亡［13］。因此，吉西他濱耐藥性分子機(jī)制的進(jìn)一步研究將促進(jìn)新型治療方法開發(fā)并改善患者預(yù)后。本研究在體外建立肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株A549/GR，發(fā)現(xiàn)不同濃度吉西他濱處理的A549/GR 細(xì)胞增殖抑制率明顯低于A549 親本細(xì)胞，IC50顯著高于A549 細(xì)胞，說明耐藥A549/GR 細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性顯著降低。本研究考察 miR-591 和 ABCC3 在 A549/GR 細(xì)胞中的表達(dá)，及其對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響，有助于克服肺癌吉西他濱耐藥的靶向療法開發(fā)。

肺癌耐藥發(fā)病機(jī)制中，miRNA 失調(diào)起關(guān)鍵作用［14］。已確定多種miRNA 失調(diào)與肺癌化療耐藥性有關(guān)，如 miR-324-5p、miR-140-5p、miR-326 等［15-17］。既往研究表明，miR-591 在惡性胸膜間皮瘤組織中明顯下調(diào)，是惡性胸膜間皮瘤中一種有效的腫瘤抑制因子［18］。miR-591 與乳腺癌放療抵抗性密切相關(guān)［19］。耐紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞中，miR-591 顯著下調(diào)，恢復(fù)miR-591 表達(dá)可使耐藥性卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇重新敏感，并可能通過抑制其靶基因ZEB1 降低癌細(xì)胞遷移和增殖，但其在肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞中的表達(dá)和機(jī)制尚未闡明［20］。本研究中，與A549細(xì)胞相比，A549/GR細(xì)胞中miR-591表達(dá)明顯減少，提示miR-591 影響肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-591 過表達(dá)可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而降低肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性，與HUH等［20］報(bào)道結(jié)論相符。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC 家族表達(dá)增加與化療失敗有關(guān)，ABCC3 與多種耐藥性和較差的臨床反應(yīng)聯(lián)系密切［21］。懸浮狀態(tài)使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231耐藥性增強(qiáng)，也可誘導(dǎo)ABCC3 表達(dá)增加，而ABCC3 沉默顯著降低懸浮MDA-MB-231細(xì)胞耐藥性［22］。人膀胱癌組織中ABCC3 mRNA 和蛋白水平顯著高于正常組織，過表達(dá)ABCC3 可促進(jìn)細(xì)胞增殖、耐藥和需氧糖酵解，并與膀胱癌患者不良預(yù)后有關(guān)［23］。敲除乳腺癌化療患者ABCC3，化療藥物在乳腺癌細(xì)胞中的保留和細(xì)胞凋亡明顯增加，敏感性更高。本實(shí)驗(yàn)A549/GR細(xì)胞中ABCC3 mRNA 和ABCC3 蛋白表達(dá)顯著增加，與既往報(bào)道一致［9］。干擾ABCC3 表達(dá)可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，減輕其耐藥程度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-591 可靶向調(diào)控ABCC3表達(dá)。ABCC3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-591過表達(dá)對(duì)吉西他濱作用的A549/GR 細(xì)胞增殖、凋亡、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響。說明miR-591 逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性可能通過靶向調(diào)控ABCC3表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，miR-591 在肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549/GR 中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-591 可抑制吉西他濱誘導(dǎo)的A549/GR 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，減輕肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性，機(jī)制與靶向調(diào)控ABCC3 表達(dá)有關(guān)，為吉西他濱治療肺癌的耐藥性提供了新見解。