蹇孝麗 師 萍 周 艷 馮琳琳 蔣紅梅 （貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽550004）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，常引起關節(jié)不可逆損傷，進而導致關節(jié)功能障礙［1］。有研究顯示RA 患者血清及滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平升高，而IL-4、IL-10 等抑炎因子表達水平降低，且這些炎癥因子的異常表達與關節(jié)長期遭受破壞密切相關［2-3］。因此，平衡RA 患者體內(nèi)促炎因子與抑炎因子的表達可能是治療RA的一種有效措施。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome path?way，UPP）是一種蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，可參與到細胞周期、細胞凋亡、炎癥反應、細胞內(nèi)信號傳導等過程［4］。最近研究顯示UPP 參與多種疾病的炎癥反應過程，并在其中發(fā)揮非常重要的作用，抑制UPP 途徑的活性可能會改善某些疾病的炎癥反應［5-6］。MG132是一種蛋白酶體抑制劑，屬于醛基肽類，有研究報道MG132 可以減輕多種疾病的炎癥反應，并減少相關炎癥因子的產(chǎn)生［6-8］。目前關于UPP在RA 相關炎癥反應過程中的研究報道較少，本研究以牛Ⅱ型膠原構建膠原誘導性關節(jié)炎（collageninduced arthritis，CIA）模型大鼠，通過注射蛋白酶體抑制劑MG132 進行干預，旨在觀察MG132 對CIA 大鼠關節(jié)病理改變、血清炎癥相關因子TNF-α、IL-6 和IL-10表達水平的影響，討論蛋白酶體抑制劑MG132在膠原誘導性關節(jié)炎大鼠炎癥反應中的作用，為臨床用藥和基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雌性SD 大鼠48 只，購自重慶動物中心，體重約190 g，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器 牛Ⅱ型膠原（BIIC，批號：C7806）和弗氏完全佐劑（FCA，批號：F5881）購自Sigma 公司；MG132（批號：S2619）購自Selleck 公司；大鼠 TNF-α ELISA 試劑盒 96t（批號：ERC-102a）購自欣博盛生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA 試劑盒96t（批號：JRE-04）購自安徽巧伊生物科技有限公司；大鼠IL-10 ELISA 試劑盒96t（批號：BMS629）購自eBioscience 公司；恒溫水浴鍋ELX800 酶標儀購自Bio-Tek。

1.2 方法

1.2.1 建立關節(jié)炎模型 將適應性飼養(yǎng)1 周的48 只 SD 大鼠隨機分為 3 組，即對照組、CIA 模型組和MG132干預組，每組16只。參考課題組此前建模方法建立CIA 大鼠模型［9］：將牛Ⅱ型膠原溶液與FCA等體積混合，乳化成混懸乳劑，取200 μl多點注射于大鼠左后足跖部皮內(nèi)。加強免疫于尾根部同法注射膠原乳劑，在初次免疫后第14天進行。對照組大鼠同法注射相同劑量生理鹽水。

1.2.2 MG132干預過程 用一定劑量的二甲基亞砜（DMSO）溶解MG132，使MG132最終濃度為5 mg/ml，置于-20℃冰箱備用。在造模后第21 天，以皮下注射方式注射 MG132 進行干預，劑量為 1 mg/kg［9］，每天1 次，連續(xù)注射14 d。其余兩組大鼠注射相同劑量的溶媒劑DMSO。在造模第42 天，即給予MG132干預后隔1 周，處死大鼠采血并分離關節(jié)滑膜組織做相應檢測。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠在用牛Ⅱ型膠原造模前后MG132 干預前后關節(jié)紅腫情況、毛色變化、進食情況、精神活動狀態(tài)及排泄物和體重等變化。

1.2.3.2 關節(jié)炎指數(shù) 分別在初次免疫后第7、14、21、28、35 及 42 天觀察各組大鼠四肢足趾關節(jié)、跖關節(jié)和踝關節(jié)的腫脹情況。并根據(jù)各關節(jié)炎癥情況進行關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分。

1.2.3.3 關節(jié)病理觀察 取左后肢剔除表面皮膚和肌肉組織，保留踝關節(jié)及滑膜組織，固定于10%的中性甲醛中1 d，12.5%EDTA-2Na 脫鈣，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察踝關節(jié)軟骨的增生和破壞情況、滑膜組織增生及炎癥情況。

1.2.3.4 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的水平 操作步驟按照試劑盒說明書進行，各細胞因子的濃度通過繪制標準曲線計算得出。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析使用R 統(tǒng)計分析軟件（version 3.2.1）。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及關節(jié)炎指數(shù)的變化 對照組大鼠飲食正常、活動良好、反應迅捷、毛色光澤。注射牛Ⅱ型膠原后第7 天，CIA 模型組大鼠注射足開始緩慢出現(xiàn)紅腫變化，并慢慢累及鄰近和其他足關節(jié)，第14天加強免疫后隨著時間的推移關節(jié)炎癥狀進展較快并逐漸加重，第21天關節(jié)紅腫更加明顯。隨著時間的延長有些大鼠伴有行動遲緩、跛行以至活動障礙。MG132 干預組大鼠造模成功后，第21 天觀察大鼠出現(xiàn)明顯關節(jié)炎相關癥狀后再經(jīng)皮下注射MG132 干預2 周；經(jīng)干預后的大鼠關節(jié)腫脹程度較對照組有所減輕，且干預組大鼠較少出現(xiàn)關節(jié)功能障礙和行動遲緩等嚴重情況。見圖1。

通過動態(tài)比較3組大鼠關節(jié)炎指數(shù)，造模第7天，CIA模型組和MG132干預組大鼠較對照組關節(jié)炎指數(shù)開始升高，第21天達到高峰。干預組經(jīng)MG132干預后，關節(jié)炎指數(shù)明顯下降，在建模第42天，該指數(shù)明顯低于CIA模型組（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠足趾關節(jié)觀察及關節(jié)炎指數(shù)（AI）的比較Fig.1 Observation of toe joints and comparison of arthri?tis index（AI）

2.2 大鼠關節(jié)滑膜組織病理改變 對照組大鼠可見清晰的關節(jié)腔，關節(jié)軟骨表面光滑，滑膜組織可見排列整齊的滑膜細胞和滑膜下組織，無炎癥細胞浸潤（圖2A）。CIA 模型組大鼠關節(jié)內(nèi)纖維組織增生、關節(jié)腔變狹窄、關節(jié)軟骨破壞、關節(jié)面粗糙、周圍可見大量新生血管和炎癥細胞、滑膜組織細胞明顯增厚（圖2B）。MG132干預組大鼠關節(jié)損壞較輕、軟骨破壞較少、滑膜組織細胞增生較輕、只見少量炎癥細胞（圖2C）。

圖2 各組大鼠關節(jié)組織病理特征（HE染色，×200）Fig.2 Histological characteristics of ankle joints of rats（HE staining，×200）

2.3 大鼠血清炎癥相關因子TNF-α、IL-6、IL-10 水平的比較 與對照組相比，CIA 模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 的含量明顯增高（P<0.01），IL-10 的含量明顯減少（P<0.01）。與CIA 模型組比較，MG132干預組血清 TNF-α、IL-6 的含量顯著降低，IL-10 的含量顯著增高（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比較（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比較（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

Note：Compared with Mock group，1）P<0.01；compared with Collagen group，2）P<0.01.

Groups Mock Collagen MG132 intervention TNF-α（pg/ ml）56.24±10.27 86.48±24.801）50.82±11.122）IL-6（pg/ ml）53.69±10.05 138.72±62.571）68.12±17.842）IL-10（pg/ ml）123.28±42.50 76.49±29.811）113.76±40.622）

3 討論

本研究結果顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可以明顯減輕牛Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)腫脹癥狀，減少關節(jié)組織炎癥細胞浸潤，降低大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平，升高血清中抑炎因子IL-10表達水平。

RA 的病理特征主要是慢性的關節(jié)滑膜炎癥和纖維組織增生，長期嚴重的炎癥反應會使關節(jié)破壞，最終導致殘疾［1］。研究顯示RA患者關節(jié)滑膜內(nèi)大量炎癥細胞浸潤和血管翳的形成，都與細胞因子失調(diào)，主要是促炎因子和抑炎因子表達異常有關［10］。之前的研究顯示，RA 患者體內(nèi)的 TNF-α 與IL-6 活性水平呈明顯升高趨勢。TNF-α 及 IL-6 是重要的促炎因子，可參與活化單核巨噬細胞、成纖維細胞等，對RA 患者病程進展起到加重的作用，其血清表達水平與患者的嚴重程度呈正相關關系［11-12］。本研究結果亦顯示CIA模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6表達水平與對照組比較顯著升高。與TNF-α和IL-6 不同，IL-10 是一種抑炎因子，其能抑制某些細胞因子如 TNF-α、IL-6 及 IL-8 的活性，還能抑制軟骨細胞和滑膜成纖維細胞中 IL-1 和 TNF 的表達［13］。本研究結果顯示CIA 模型組大鼠血清中IL-10 表達水平與對照組相比顯著降低。

長期的炎癥反應是導致RA 進展及惡化的主要原因，因此控制炎癥反應在治療RA 中顯得極為重要。目前雖有抗風濕藥、非甾體抗炎藥等用來治療RA，但這些藥物的治療效果有限［14］。泛素-蛋白酶體途徑作為細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，亦可調(diào)控炎癥相關蛋白，在炎癥反應過程中充當著極為重要的角色［15-16］。在調(diào)控多種炎癥基因表達的過程中，NF-κB是最為重要的轉錄因子，經(jīng)各種因素刺激活化后可以增加多種炎癥因子如TNF-α、IL-6、環(huán)氧化酶等的表達，而增加的這些炎癥因子又能進一步活化NF-κB，導致整個炎癥過程反復進行并加重［17］。抑制NF-κB 的激活可以降低炎癥因子的釋放，從而改善RA 的炎癥反應［18］。研究顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可通過抑制NF-κB 的活化及轉錄以減輕分枝桿菌及佐劑誘導的關節(jié)炎大鼠的炎癥疼痛反應［19］。本課題組前期研究結果亦顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可以通過減少IκB 蛋白的降解，使NF-κB 無法與結合蛋白 IκB 解離從而抑制 NF-κB 的活性，減輕RA大鼠的炎癥反應［9］。

本實驗在前期研究基礎上，用蛋白酶體抑制劑MG132 對CIA 模型大鼠進行干預，進一步檢測大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 和抑炎因子IL-10 的表達水平。結果顯示，在MG132 干預后，大鼠血清中TNF-α 和IL-6 表達水平顯著下降，關節(jié)受累現(xiàn)象也得到明顯改善，而IL-10 水平明顯升高。促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平主要受 NF-κB 通路調(diào)控，MG132 可能是通過抑制NF-κB 的活化和轉錄從而降低相關炎癥因子TNF-α、IL-6 的表達；但其升高IL-10水平的機制有待進一步探討。

綜上所述，本研究顯示蛋白酶體抑制劑MG132能有效降低 CIA 大鼠 TNF-α、IL-6 表達水平，同時提高IL-10 表達水平，對改善CIA 大鼠炎癥癥狀，緩解疾病的進一步發(fā)展起到積極作用。