林曉彤 黃重銘 彭慧婷 陳虹宇 王文萍 王思斯 曹 洋

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州 510405

近年來，惡性腫瘤成為影響全球人類健康的疾病之一。我國作為原發(fā)性肝癌發(fā)病率的高危國家之一，肝癌的死亡率高達(dá)23.7%，成為威脅國人健康的公共衛(wèi)生問題[1-2]。中醫(yī)藥治療肝癌具有增效減毒、改善生活質(zhì)量、延長生存期等優(yōu)勢。斑蝥為芫菁科昆蟲南方大斑蝥（Mylabris phalerata Pallas）的干燥體，是我國最早發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用的中藥之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，斑蝥具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等活性，已廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床治療中[3]。目前斑蝥治療肝癌作用機(jī)制尚未明確，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對接的方法來探討斑蝥治療肝癌的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 斑蝥成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）對“斑蝥”進(jìn)行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥18%為條件，篩選出斑蝥活性化合物。結(jié)合2010 年1 月至2020 年10 月中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)文獻(xiàn)，篩選并匯總斑蝥的活性成分。通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫對斑蝥活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，設(shè)置可能性＞0.1 篩選出潛在的作用靶點(diǎn)。

1.2 肝癌的靶點(diǎn)收集及潛在靶點(diǎn)的預(yù)測

以“Liver Cancer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，匯總?cè)ブ睾蟮玫礁伟┗虬悬c(diǎn)。利用R 軟件將斑蝥的作用靶點(diǎn)與肝癌基因靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得斑蝥活性成分-肝癌潛在靶點(diǎn)的維恩圖，得到斑蝥抗腫瘤的潛在靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白輸入String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homosapiens”，導(dǎo)出保存TSV 文件。將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape，并繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 斑蝥-活性成分-肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 構(gòu)建斑蝥-活性成分-肝癌靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。其中，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表著斑蝥、活性成分和關(guān)鍵基因靶點(diǎn)；邊線代表著斑蝥與活性成分、活性成分與作用靶點(diǎn)、疾病與靶點(diǎn)的關(guān)系。

1.5 斑蝥的GO 分析和KEGG 通路富集分析

Bioconductor 是一個(gè)提供基因組數(shù)據(jù)分析和注釋工具的R 語言軟件包集合平臺。安裝Bioconductor 中的“ClusterProfiler”“DOSE”及“Pathway”軟件包，運(yùn)行R 先后繪制出斑蝥治療肝癌潛在作用靶點(diǎn)的GO 富集分析氣泡圖與KEGG 通路富集分析柱狀圖。

1.6 分子對接驗(yàn)證

結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作程度，選取互作程度最高前2 名靶點(diǎn)蛋白為關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。ZINC 數(shù)據(jù)庫中搜索斑蝥活性成分mol2 格式結(jié)構(gòu)，利用PDB 數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的PDB 格式的結(jié)構(gòu)。運(yùn)用AutoDockTools 軟件對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去除水分子、加氫等預(yù)處理，導(dǎo)入并設(shè)置成小分子配體，隨后將靶點(diǎn)蛋白與小分子配體轉(zhuǎn)換成pdbqt 文件，對其進(jìn)行分子對接，獲得兩者對接所需的最低結(jié)合能。結(jié)合能代表活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合所需能量，結(jié)合能越低，表明活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合力越強(qiáng)[4]。

2 結(jié)果

2.1 斑蝥的活性成分及靶點(diǎn)

結(jié)合數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)查閱對斑蝥活性成分進(jìn)行篩選，共獲得6 個(gè)有效活性成分（表1）；并得到145 個(gè)預(yù)測作用靶點(diǎn)。

表1 斑蝥有效活性成分信息

2.2 肝癌靶點(diǎn)的獲取與潛在靶點(diǎn)的預(yù)測

數(shù)據(jù)庫檢索匯總?cè)ブ睾蟮玫礁伟┌悬c(diǎn)1442 個(gè)，將145 個(gè)斑蝥作用靶點(diǎn)與1442 個(gè)肝癌相關(guān)基因靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，斑蝥與肝癌的潛在作用靶點(diǎn)44 個(gè)。見圖1。

圖1 斑蝥活性成分與肝癌潛在靶點(diǎn)的維恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包括44 個(gè)節(jié)點(diǎn)，233 條邊。節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺代表靶點(diǎn)蛋白的degree值，其中degree 值越大則靶點(diǎn)顏色越深、面積越大。節(jié)點(diǎn)之間的連線代表著靶點(diǎn)蛋白之間關(guān)聯(lián)性，連線的顏色越深、越粗意味著靶點(diǎn)蛋白間關(guān)聯(lián)性越高。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析顯 示IL-6、MAPK3、MAPK1、ESR1、PTGS2 屬于斑蝥治療肝癌的核心靶點(diǎn)蛋白。見圖2。

圖2 斑蝥的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 斑蝥-活性成分-肝癌靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)分析

斑蝥-活性成分-肝癌的靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖包含44 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，97 條邊。見圖3。

圖3 斑蝥-活性成分-肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 及KEGG的富集分析

GO 富集氣泡圖顯示斑蝥治療肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的主要生物學(xué)功能涉及細(xì)胞增殖、體內(nèi)激素分泌與調(diào)控、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程。見圖4（封三）。

圖4 GO 富集分析氣泡圖

KEGG 通路富集分析顯示，斑蝥抗肝癌的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)富集的通路主要與細(xì)胞增殖與凋亡、腫瘤血管新生、炎癥介導(dǎo)及細(xì)胞黏附相關(guān)。見圖5（封三）。

圖5 KEGG 通路富集分析柱狀圖

2.6 分析對接結(jié)果

分子對接顯示，IL-6、MAPK3 與所有活性成分都顯示出良好的結(jié)合活性（表2）。其中，3-苯基-4-氮雜芴與IL-6 及MAPK3 對接顯示出最好結(jié)合力。見圖6～7。

表2 IL-6、MAPK3 與活性成分的分子對接結(jié)果（kJ/mol）

圖6 IL-6 與3-苯基-4-氮雜芴分子對接圖

圖7 MAPK3 與3-苯基-4-氮雜芴分子對接圖

3 討論

油酸、亞油酸、十八碳七烯酸、去甲斑蝥素、3-苯基-4-氮雜芴、斑蝥素等成分可能是斑蝥治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，斑蝥素可通過抑制β-連環(huán)蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期并誘導(dǎo)其凋亡[7]。去甲腎上腺素通過ERK1/2和NF-κB 信號通路的磷酸化下調(diào)MMP-9 和u-PA的表達(dá)，抑制HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力[8]。

PPI 結(jié)果顯示，IL-6、MAPK3、MAPK1、ESR1、PTGS2為互作程度最高的前5 個(gè)靶點(diǎn)。IL-6 可引起JAK 磷酸化激活STAT3 形成二聚體，誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。MAPK3 與MAPK1 均為MAPK家族成員，其中通過激活下游RAS/RAF/MAPK/ERK通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化的過程；還可以激活JNK 和p38/MAPK 通路在炎癥和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10-11]。PTGS2 其催化合成的前列腺素為肝損傷中重要的炎癥介質(zhì)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[12]。ESR1 為雌激素受體，乙型肝炎病毒（HBV）誘發(fā)ESR1 高甲基化，從而誘導(dǎo)肝炎的發(fā)生甚至進(jìn)展成為肝癌[13]。中藥斑蝥通過調(diào)控上述靶點(diǎn)的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

KEGG 通路富集顯示，斑蝥抗肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因所在的介導(dǎo)的通路可歸納為以下4 類：第1 類與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)，如AGE-RAGE 結(jié)合可協(xié)同誘導(dǎo)MAPK 信號傳通路的活化，加速細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14-15]；AGEs-ROS 還能通過介導(dǎo)P38、MAPK和JNK 活化，引起促凋亡的caspase-3 級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]；TNF-α 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，促進(jìn)腫瘤增殖[18-19]。第2 類與血管新生途徑相關(guān)，如VEGF 通過刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)小靜脈血管的滲透性，加速腫瘤細(xì)胞的遷移[20-22]；CLEC-2 誘導(dǎo)激活的血小板上調(diào)整合素和選擇素表達(dá)使癌栓牢固地黏附于血管內(nèi)皮，釋放炎癥因子進(jìn)而增加血管的通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的外滲和轉(zhuǎn)移[23-24]。第3 類與炎癥介導(dǎo)相關(guān)，AGE-RAGE 結(jié)合促進(jìn)NF-κB的活化，上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6的釋放[25-26]。第4 類與細(xì)胞黏附相關(guān)，如CLEC-2 與配體蛋白結(jié)合后，通過激活Ras 家族成員RhoA，促進(jìn)細(xì)胞骨架重組及下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，加速腫瘤的轉(zhuǎn)移[27-28]。因此，斑蝥可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥微環(huán)境、血管新生途徑及細(xì)胞黏附從而起到治療肝癌的作用，反映了斑蝥多靶點(diǎn)、多通路抗腫瘤的特點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)斑蝥是通過多種活性成分，調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，作用多條通路去實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管新生的抗腫瘤作用，其中AGE-RAGE 通路及C型凝集受體通路可作為未來研究斑蝥抗肝癌機(jī)制的方向。